Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Questo lavoro descrive un metodo robusto e diretto per rilevare e quantificare l'endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. Uno standard analitico deuterato che abbiamo preparato e utilizzato per la quantificazione di 2-AG da diluizione isotopica e cromatografia liquida-elettrospray-spettrometria di massa di mitinazione -tandem (LC-ESI-MS/MS).

Abstract

Questo lavoro presenta un metodo per preparare uno standard analitico per analizzare la glicerel 2-aracidonoyl (2-AG) qualitativamente e quantitativamente mediante cromatografia liquida-elettrospray ionization-tandem spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS). Gli endocannabinoidi sono conservati mediatori lipidici che regolano più processi biologici in una varietà di organismi. In C. elegans, 2-AG è stato trovato per possedere ruoli diversi, tra cui la modulazione della formazione di dauer e metabolismo del colesterolo. La presente relazione descrive un metodo per superare le difficoltà associate ai costi e alla stabilità degli standard deuterati necessari per la quantificazione dei 2 AG. La procedura per la sintesi dello standard è semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio, senza la necessità di competenze di sintesi organica o di attrezzature speciali. Inoltre, viene descritta una modifica del metodo di Folch per estrarre lo standard deuterato dalla cultura di C. elegans. Infine, viene descritto un metodo quantitativo e analitico per rilevare 2-AG utilizzando l'analogico 1-AG-d₅ etichettato isotopicamente stabile, che fornisce risultati affidabili in una corsa fast-cromatica. La procedura è utile per studiare i molteplici ruoli di 2-AG in C. elegans, pur essendo applicabile ad altri studi di metaboliti in organismi diversi.

Introduzione

Gli endocannabinoidi regolano i processi biologici multipli in una varietà di organismi e sono conservati mediatori lipidici¹. I primi endocannabinoidi scoperti e più caratterizzati sono l'anandamide (arachidonoylethanolamide, AEA) e il glicerolo 2-arachidonoyl (2-AG). Gli endocannabinoidi svolgono molti ruoli critici, compresi quelli coinvolti nei sistemi di ricompensa del cervello, nonché la tossicodipendenza, la memoria, l'umore e i processi metabolici². AEA e 2-AG sono sintetizzate solo quando necessario e hanno una breve durata di vita, e sono degradate attraverso la ricarica delle proteine di trasporto e l'idrolisi³.

L'uso di modelli animali come Caenorhabditis elegans (C. elegans) è diventato importante per studiare la grande varietà di processi biologici tra cui l'apoptosi, la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare, la polarità cellulare, la regolazione genica, il metabolismo, l'invecchiamento, e determinazione del sesso^4,5. Inoltre, C. elegans è un ottimo modello per studiare i ruoli fisiologici degli acidi grassi polinsaturi (PUFA). AEA è stato identificato in C. elegans ed è ridotto sotto la restrizione dietetica⁶. Questa carenza estende la durata della vita del nematode attraverso un meccanismo di restrizione dietetica che può essere soppresso dal completamento con l'endocannabinoide. Recentemente, si è scoperto che 2-AG e AEA svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione del traffico di colesterolo in C. elegans⁷. Ancora più importante, è stato determinato che il completamento con esogeno 2-AG può salvare l'arresto dauer, che è causato dal traffico di colesterolo alterato nei mutanti Niemann-Pick tipo C1 C. elegans.

Per comprendere meglio il rapporto tra 2-AG e il traffico di colesterolo e altri processi biologici nel nematode (ad es. segnalazione monoaminergica, nociception e locomozione), è fondamentale studiare questo metabolita endogeno e come in determinate condizioni ambientali e dietetiche^{8,9,10,11,12,13}. Pertanto, è imperativo progettare e ottimizzare un metodo per rilevare e quantificare endogeno 2-AG in C. elegans che è semplice da usare per gli scienziati di diversi campi, in particolare quelli che studiano il comportamento del nematode in relazione a questo Endocannabinoide.

Nel 2008, Lethonen e i colleghi sono riusciti a identificare 2-AG e AEA in C. elegans utilizzando metodi analitici LC-MS¹⁴. Nel 2011 sono riusciti ad espandere questa tecnica ad altri endocannabinoidi¹⁵. Un lavoro più recente ha dimostrato altri metodi analitici che sono riusciti a rilevare e quantificare gli endocannabinoidi in C. elegans, tra cui la spettrometria di massa e GC-MS^16,17,18, e ha è stato inoltre segnalato che metodi analitici simili possono essere ampliati ad altri modelli¹⁹.

I metodi analitici precedentemente riportati utilizzati per quantificare 2-AG in campioni biologici di solito comportano l'uso di standard deuterati che sono acquisiti commercialmente e richiedono disponibilità per l'acquisto^20,21. Molti standard analitici per la quantificazione LC-MS/MS degli endocannabinoidi sono disponibili in commercio da diversi fornitori. Tuttavia, sono costosi, sono sensibili e si ossidano nel tempo, a causa della presenza di più obbligazioni doppie. Le versioni più comuni di questi standard sono basate sull'acido aracidonico ottuerato e sono adatte per la quantificazione mediante diluizione isotopica LC-MS/MS^14,22. Inoltre, la maggior parte di questi standard sono sostituiti nella posizione 2 del glicerolo, rendendoli instabili nella maggior parte delle condizioni in quanto sono inclini alla migrazione acyl^19,23.

Per superare le difficoltà concuite con i costi e la stabilità di questi standard deuterati, viene presentato un metodo comodo e semplice per preparare uno standard analitico basato sul glicerol-d₅. La sequenza per preparare lo standard penta-deuterato richiede una procedura in tre fasi che si traduce nello standard 1-AG-d₅, che è stabile e non subisce la migrazione acyl (il problema principale quando si mira a sintetizzare 2 monoacylglyceroli).

L'obiettivo principale qui è quello di mostrare un metodo semplice e riproducibile per studiare 2-AG in C. elegans, compresa la sintesi dello standard analitico deuterato, la preparazione e l'estrazione dei campioni di nematodi, e l'analisi da LC-MS/MS(Figura 1 ). Questa procedura sintetica è realizzabile senza la sofisticata conoscenza di sintesi organica o attrezzature speciali, che lo rende adatto per gli scienziati provenienti da diversi campi che stanno studiando il comportamento di C. elegans sotto l'influenza endocannabinoide. Il metodo è anche espandibile ad altri modelli di studio, rendendolo utile per diversi obiettivi. La norma, preparata come riportato qui, è stata applicata per sviluppare con successo un metodo cromatico veloce e affidabile che consente un rilevamento e una quantificazione efficaci di 2-AG in modo riproducibile.

Protocollo

1. 1-AG-d₅ preparazione

NOTA: Per ottenere 1-AG-d₅ come standard interno deuterato per i test quantificanti, seguire il protocollo come descritto di seguito.

1. Protezione differenziale
   1. Per proteggere solo gli alcoli primari, aggiungere prima 38 mg di glicerol-d₈ a un tubo di reazione da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere 5 mL di dicloromagno (DCM) utilizzando una siringa Hamilton da 5 mL e riempire il tubo con N₂ secco per produrre un'atmosfera inerte.
   3. Preparare un bagno con una flacone Dewar poco profonda piena di acetato di etilio distillato.
   4. Montare il tubo di reazione ermeticamente chiuso all'interno del bagno e raffreddarlo aggiungendo lentamente il liquido N₂ all'acetato etilico fino a quando il solvente non è congelato.
      AGGIORNAMENTO: Il liquido bolle violentemente a temperatura ambiente (RT) e può causare gravi ustioni quando si contattano occhi e pelle.
   5. Aggiungere 54 mg di collidine anidrodo utilizzando una siringa Hamilton.
      CONTRIBUTO: Collidine è volatile e ha un profumo molto forte e sgradevole.
   6. Aggiungere 70 mg di cloruro tert-butyldimethylsilyl e mescolare l'intera soluzione per 3 h a -78 gradi centigradi su un agitatore magnetico.
   7. Dopo 3 h, lasciare la reazione a scaldare a RT e continuare a mescolare per altri 12 h.
   8. Aggiungere 2 mL di salamoia per placare la reazione.
   9. Estrarre la soluzione 3x con 2 mL di diclorometanotano distillato utilizzando un imbuto di separazione, risparmiando ogni volta l'estratto organico.
   10. Unire i tre estratti organici e asciugarli sul solfato di sodio.
   11. Evaporare il diclorometano sotto pressione ridotta in un evaporatore rotante sottovuoto per evitare proiezioni di solventi.
   12. Purificare la miscela grezza per cromatografia a colonne utilizzando il gel di silice come fase stazionaria e un gradiente di acetato exano/etilio in aumento del 10%, a partire dal 100% di esagonale e riterminando con 100% di acetato etilico.
   13. Combinare le frazioni contenenti il prodotto e rimuovere il solvente sotto pressione ridotta in un evaporatore rotante a vuoto per ottenere il glicerol-d 1-O,3-O-bis(TBDMS) puro come liquido incolore.
2. Esterificazione
   1. Aggiungere 10 mg di 1-O,3-O-bis (TBDMS)-glycerol-d₅ (precedentemente sintetizzato) a un tubo di reazione da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere 2 mL di diclorometanono con una siringa Hamilton da 5 mL e riempire il tubo con N₂ secco per produrre un'atmosfera inerte.
   3. Raffreddare la soluzione a 0 gradi centigradi con un bagno di ghiaccio.
   4. Aggiungere 36 mg di acido arachidonico utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare.
   5. Aggiungere 15 mg di 4-dimetilaminopirise e mescolare.
   6. Aggiungere 15 mg di N,N'-diisopropylcarbodimide utilizzando una micropipetta regolabile multi-volume e mescolare.
   7. Lasciare che la miscela reagisca a 0 gradi centigradi per 3 h.
   8. Dopo 3 h, lasciare la reazione a scaldare a RT e continuare a mescolare per altri 12 h.
   9. Aggiungere 2 mL di acqua per placare la reazione.
   10. Estrarre la soluzione organica 3x con 2 mL di diclorometanono (DCM) utilizzando un imbuto di separazione.
   11. Mettere i tre estratti organici nello stesso tubo e asciugarli sul solfato di sodio.
   12. Evaporare il diclorometano sotto pressione ridotta in un evaporatore rotante sottovuoto per evitare proiezioni di solventi.
   13. Purificare la miscela grezza per cromatografia a colonne utilizzando il gel di silice come fase stazionaria e un gradiente di acetato di etaneio/ etilio del 10%, a partire dal 100% di esagonale e riterminando con il 50% di esagonale/50% di acetato etilico.
   14. Combinare le frazioni contenenti il prodotto e rimuovere il solvente sotto pressione ridotta in un evaporatore rotante a vuoto per ottenere il liquido bruno puro 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d₅ come liquido giallastro.
3. Deprotezione
   1. Aggiungere 15 mg di 1-O,3-O-bis (TBDMS)-2-AG-d₅ (precedentemente sintetizzato) a un tubo di reazione da 10 mL utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere 2 mL di THF anidroso utilizzando una siringa Hamilton da 5 mL e riempire il tubo con N₂ asciutta per produrre un'atmosfera inerte.
   3. Raffreddare la soluzione a 0 gradi centigradi con un bagno di ghiaccio.
   4. Aggiungere in THF una soluzione di fluoruro da 1 M di fluoruro di tetrabutylammonium utilizzando una siringa Hamilton.
   5. Lasciare scaldare la reazione a RT e mescolare per 1 h.
   6. Dopo 1 h, aggiungere 2 mL di acqua per placare la reazione.
   7. Estrarre la soluzione 3x con 2 mL di diclorometanono si discosta utilizzando un imbuto di separazione.
   8. Unire i tre estratti organici e asciugarli sul solfato di sodio.
   9. Evaporare il diclorometano a pressione ridotta in un evaporatore rotante sottovuoto per ottenere il puro 1-AG-d₅ come liquido giallastro.
4. Monitorare tutte le reazioni da cromatografia strato sottile eseguita su gel di silice 60 F₂₅₄ fogli di alluminio pre-rivestito. Visualizza le bande sotto una lampada UV da 254 nm dopo la colorazione con una soluzione etnolica di 4-anisaldeide.

2. Preparazione dello stock standard e delle soluzioni di misura

1. Sciogliere 1 mg dello standard interno 1-AG-d₅ in 1 mL di ACN e sonicare per 1 min per ottenere la soluzione stock standard 1.000 ppm.
2. Per preparare la soluzione da 1.000 ppb utilizzata per la quantificazione nei vermi, preparare prima una soluzione da 10 ppm: prendi 10 l della soluzione stock utilizzando una siringa Hamilton e diluila fino a un volume finale di 1 mL aggiungendo 990 luna di ACN.
3. Dalla soluzione prodotta al punto 2.2 utilizzando una siringa Hamilton, e diluirla a un volume finale di 1 mL aggiungendo 900 L di ACN per ottenere la soluzione da 1.000 ppb utilizzata per la quantificazione.
4. Sonicare per 1 min tra ogni passo per garantire una solubilità completa. Conservare le soluzioni a -78 gradi centigradi per mantenere le concentrazioni e l'integrità degli standard. Dopo aver utilizzato la soluzione standard, far scorrere un po 'di azoto prima di chiudere la fiala per prevenire l'ossidazione.

3. Crescita e manutenzione di C. elegans

NOTA: Semina il mezzo di crescita del nematode (NGM) piastre di agar con E. coli OP50 e propagare i vermi su queste piastre.

1. Mescolare 3 g di NaCl con 17 g di agar.
2. Aggiungere 2,5 g di peptone, quindi aggiungere 975 mL di H₂O.
3. Autoclave per 50 min, quindi raffreddare il pallone a 55 gradi centigradi.
4. Mescolare quanto segue: 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M MgSO₄, 25 mL di 1 M KH₂PO₄ buffer (tutti precedentemente autoclaved) e 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo in etanolo.
5. Pur mantenendo un ambiente sterile, erogare la soluzione NGM in piastre Petri da 60 mm, riempiendo le piastre a due terzi del loro volume. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi.
6. Streak la coltura batterica E. coli da uno stock di glicerolo di -80 gradi centigradi sulla piastra di agar LB. Lasciar crescere sul piatto per tutta la notte a 37 gradi centigradi.
7. Raccogliere una singola colonia per inoculare 100 mL di LB liquido durante la notte a 37 gradi centigradi con agitazione.
   NOTA: Non è necessario controllare l'OD perché questo ceppo può raggiungere la fase stazionaria in questo periodo.
8. Rimuovere le piastre NGM immagazzinate, rimuovere i coperchi nel cofano di flusso laminare e lasciare aperto per consentire l'evaporazione dell'umidità in eccesso dalle piastre.
9. Una volta asciugate le piastre, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere 100 -L di OP50 E. coli al centro della piastra senza diffondersi.
10. Lasciare il prato OP50 E. coli per crescere durante la notte a RT o a 37 gradi centigradi per 8 h.
11. Aggiungere il numero desiderato di embrioni di verme ottenuti con il trattamento con ipoclorite o "sbiancamento" (Sezione 4).
    NOTA: Raffreddare le piastre a RT prima dell'aggiunta di vermi.

4. Tecnica di sbiancamento per la sincronizzazione delle culture C elegans

1. Vermi di semi e pezzi su piastre NGM da 6 cm.
2. Lasciare i vermi in crescita per 2-3 giorni per ottenere un numero sufficiente di uova e adulti gravidi sul piatto.
3. Una volta che ci sono abbastanza uova / adulti, versare 5 mL di M9 sul piatto.
4. Trasferire i vermi in un tubo di centrifuga di 15 mL utilizzando una pipetta di vetro.
5. Centrifugare il tubo per 2 min a 2.000 x g e pellet i vermi.
6. Aspirazione nella maggior parte del M9, evitando disturbi del pellet di verme.
7. Aggiungere 3 mL di soluzione di sbiancamento (2:1:1 rapporto di NaOH:NaOCl:H₂O).
8. Invertire delicatamente per mescolare la soluzione per 5 min o fino a quando il numero di vermi adulti intatti diminuisce.
   AVVISO: Non candegginare per più di 5 min.
9. Centrifuga per 1 min a 2.000 x g e aspirazione la maggior parte della soluzione di sbiancamento senza disturbare il pellet verme.
10. Aggiungere 15 mL di M9 e mescolare bene.
11. Centrifuga di nuovo a 2000 x g per 1 min.
12. Aspirazione fuori la maggior parte del M9 senza disturbare il pellet verme.
13. Ripetere i passaggi da 4.10 a 4.12 una o due volte.
14. Aggiungere 5 mL di M9 fresco e agitare.
15. Lasciare che le uova si schiudono durante la notte con dondolo delicato.

5. Preparazione del campione di verme

1. Lasciamo che gli embrioni N2 ottenuti con la procedura di sbiancamento si schiudono durante la notte nel tampone M9 (5 mL in un tubo di centrifuga di 15 mL) a 20 gradi centigradi.
2. Raccogliere gli L1 sincronizzati centrifundo il tubo per 2 min a 2.000 x g.
3. Lavare i vermi con il buffer M9 1x, quindi quantificare il numero di vermi L1 vivi.
4. Seme circa 10.000 vermi in piastre NGM (10 cm di diametro) con 1 mL di OP50 E. coli (precedentemente essiccati).
5. Incubare le piastre per 48 h a 20 gradi centigradi fino a quando i vermi raggiungono lo stadio L4.
6. Raccogliere i vermi utilizzando il tampone M9 freddo in un tubo di centrifuga 15 mL, lavarli 1x, quindi e trasferirli in un tubo da 1,5 mL.
7. Pellet i vermi per centrifugazione a 2.000 x g per 1 min, eliminare la maggior parte dei supernatali, immergere i tubi in azoto liquido, e conservare a -80 gradi centigradi.

6. Estrazione dei lipidi

1. Scongelare circa 100 l di pellet di verme congelati appartenenti a N2 sul ghiaccio, aggiungere 1,3 mL di metanolo e sonicare il campione per 4 min.
2. Aggiungere 2,6 mL di cloroformio e 1,3 mL di 0,5 M KCl/0,08 M H₃PO₄ a un rapporto finale di 1:2:1, 1.000 ppb dello standard interno 1-AG-d₅e idroxytoluene butylated come agente antiossidante con una concentrazione finale di 50g/mL.
3. Vorticare i campioni per 1 min e sonicare in un bagno d'acqua ultrasonica per 15 min sul ghiaccio.
4. Vorticare i campioni 2x per 1 min e centrifugare per 10 min a 2.000 x g per indurre la separazione di fase.
5. Raccogliere la fase inferiore e raccoglierla in un tubo pulito, asciugarla sotto azoto e risospendere il residuo solido in 100 -L di ACN.

7. Analisi endocannabinoide di HPLC-MS/MS

1. Utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con uno spettrometro di massa triplo quadruplo ESI per rilevare e quantificare 2-AG da campioni di nematodi.
2. Utilizzare il seguente rapporto per HPLC in fase inversa: da 0,0-0,5 min H₂O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H₂O:ACN (40:60) a (25:75), 6.5-7.5 min H₂O:ACN (25:75), 7.5-8.0 min H₂O:ACN (25:75) a (40:60), 8.0-12.0 min H₂O: ACN (40:60).
3. Mantenere la temperatura della colonna a 40 gradi centigradi e impostare la temperatura del vassoio autocampionatore a 10 gradi centigradi.
4. Impostare le seguenti condizioni di ionizzazione: modalità ionio positivo; gas di essiccazione (N₂₎temperatura di 300 gradi centigradi; portata del gas di essiccazione: 10 L/min; pressione del nebulizzatore - 10 UA; e tappo. tensione di 4 kV.
5. Per il rilevamento dell'analita, utilizzare Gestione record di messaggistica con le seguenti transizioni: da 379,2 m/z a 289,2 m/z per 2-AG; e da 384,2 m/z a 289,2 m/z per 1-AG-d₅.

8. Quantificazione endocannabinoide nei vermi

1. Utilizzare lo standard interno 1-AG-d₅ deuterato e calcolare i rapporti di area di picco dell'analita rispetto allo standard interno.
2. Utilizzare le seguenti transizioni: 384,2 m/z a 287,2 m/z per 2-AG; e da 379,2 m/z a 287,2 m/z per 1-AG-d₅.
3. Calcolare la concentrazione dell'endogeno 2-AG confrontandolo con i rapporti di area di picco dello standard deuterated utilizzando il valore di concentrazione dello standard.

Risultati

Un analogo con etichetta isotopica è statosintetizzato con successo da acido aracilolo e arachidonico disponibile in commercio utilizzando un metodo sintetico in 3 fasi (Figura 2, Figura 3). Questi passaggi sono semplici e non richiedono attrezzature sofisticate, condizioni appositamente controllate o costosi reagenti. Così, questo metodo è robusto e può essere esteso con successo per sintetizzare monoacylgliglycer...

Discussione

Gli endocannabinoidi sono una classe di lipidi che sono stati implicati nella regolazione della formazione di dauer in C. elegans⁷. Più specificamente, la sintesi di acidi grassi polinsaturi (PUFA) è importante per il traffico di colesterolo e lo sviluppo riproduttivo dei vermi. Si rivela qui che 2-AG, un acido arachidonico contenente endocannabinoidi, è responsabile della restituzione della larva dauer al suo ciclo normale in vermi che hanno alterato il metabolismo del colesterolo

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	107700	reagent grade, 99%
antioxidant BHT	Sigma-Aldrich	W21805
Arachidonic acid	Sigma-Aldrich	10931
Glycerol-d8	Sigma-Aldrich	447498
Mass detector Triple Quadrupole	Thermo Scientific		TSQ Quantum Access Max
N,N’-diisopropylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D125407
NMR spectrometer	Bruker		Avance II 300 MHz
reversed-phase HPLC column	Thermo Fisher	25003-052130	C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm)
tert-Butyldimethylsilyl chloride	Sigma-Aldrich	190500	reagent grade, 97%
tetrabutylammonium fluoride	Sigma-Aldrich	216143	1.0M in THF
UHPLC System	Thermo Scientific		Ultimate 3000 RSLC Dionex
worm strain N2 Bristol	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)