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要約

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。

要約

インビトロ研究のための理想的なモデルを定義することは、主に細胞の分化などの生理学的プロセスを研究する場合に不可欠です。腫瘍間質では、宿主線維芽細胞は癌細胞によって刺激され分化する。したがって、それらは腫瘍微小環境に寄与し、腫瘍の進行を支持する表現型を獲得する。このスフェロイドモデルを用いて、このような3Dインビトロモデルシステムを設定し、この分化過程におけるラミニン-332とその受容体インテグリンα3β1の役割を解析した。このスフェロイドモデルシステムは、腫瘍微小環境条件をより正確な方法で再現するだけでなく、細胞内および細胞外の免疫蛍光染色などの異なる下流研究を可能にするので、非常に汎用性の高いモデルです。マーカー、ならびに沈着した細胞外マトリックスタンパク質。さらに、qPCRによる転写解析、フローサイトメトリーおよび細胞侵襲は、このモデルで研究することができる。ここでは、CAFのインテグリンα3β1およびその異位堆積リガンド、ラミニン-332の役割を評価するスフェロイドモデルのプロトコルを、分化および膵臓癌細胞の侵入を支持する。

概要

腫瘍微小環境は非常に複雑なニッチであり、腫瘍細胞1の維持および進行にとって非常に重要である。これは、癌細胞だけでなく、間質線維芽細胞によっても形成されます。腫瘍細胞は、正常組織2の間質と特異的かつ異なる間質に囲まれている。ラミニン-332は、膵臓腺癌3のような異なる腫瘍の間質で異なる腫瘍の間質で異なる細胞外マトリックスタンパク質を発現する。また、ECMの生化学的組成物および剛性および張力などの生体的性質も、腫瘍バルク4内で変化する。この腫瘍間質、または「反応性間質」は、隣接する癌細胞への線維芽細胞の適応および腫瘍進行のための有利で支持的な環境を開発する他の非常に重要なプレーヤーの募集によって引き起こされる。間質線維芽細胞の分化は癌関連線維芽細胞(CAF)をもたらす。これらの細胞は、α平滑筋アクチン(αSMA)5または神経/グリア抗原2(NG2)6などの異なるマーカーを用いて同定することができる。

腫瘍微小環境(TME)をCAFで要約するのに最も適したインビトロモデルを選択することは困難である。このようなモデルシステムについては、費用対効果が高く再現可能な方法でTMEの生理的パラメータを模倣する方法を考慮する必要があります。TME内では、異なる細胞タイプの増殖、分化、移行、および侵入などの異なるプロセスが発生します。これらの細胞プロセスは、異なる方法で個別に行うことができる。しかし、実験条件は、下層の剛性がCAF分化プロセスに影響を与えるので、腫瘍間質ECMとの細胞相互作用を考慮しなければならない。R.G.ウェルズは、細胞の行動に対するマトリックス剛性の影響についてコメントし、インビトロ培養細胞で観察された細胞骨格組織および分化状態が動脈実7である可能性があることを強調した。機械的緊張5、7を含むCAFの分化に異なる刺激が関与しているようです。これを回避するために、2D軟質基板は、硬い培養皿プラスチックの問題を回避するので、分化研究のためのアプローチが可能である可能性があります。線維芽細胞を成長させることができる柔らかい2D表面は、コラーゲン-Iコーティングポリアクリルアミドゲルであり、それによってゲル剛性は、ポリアクリルアミドおよびゲル架材の濃度によって操作することができる。αSMAリッチストレス繊維の接着および形成は、ゲル剛性8と共に線維芽細胞において増強される。これらの結果は、より多くの生理的なインビトロ分化モデルのための柔らかい基板足場の重要性を強調する。しかし、私たちの手の中では、これらのゲルの実験的再現性とイメージングは困難でした。これらの欠点を克服するために、分化と侵入研究のための3Dスフェロイドモデル用の2Dソフト基板システムを変更しました。このモデルは、より臨床的に関連し、インビトロオルガノイドと同様に、生体内細胞相互作用、ECM産生および沈着、ならびに細胞挙動9における要約を行う。

スフェロイドは、細胞が付着する基板を欠いているときに形成される。細胞が粘着面なしで放置されると、それらは多かれ少なかれ球状構造を形成するために凝集する。スフェロイドが1種類の細胞で構成されている場合、それらはホモスフェロイドと呼ばれています。2つ以上の異なる細胞タイプで構成される場合、それらはヘテロスフェロイドを形成する。

スフェロイド調製のための異なる方法の中で、我々は非付着ラウンドボトム96ウェルプレートを使用してプロトコルを実行します。コストに関しては非常に効果的です。ここでは、線維芽細胞、CAFまたはCAFの両方のホモスペロイドを生成し、CAFまたはインテグリンα3 KO CAFおよび膵管癌細胞(AsPC-IおよびPANC-I)の分化プロセスとヘテロスペロイドを調べるために、インテグリンα3サブユニットを欠いている。周囲のマトリックスに。

これらの研究の目的は、ヒト膵臓癌生検から単離された一次CAFを使用することにあった。しかしながら、細胞を得るための生検は乏しく、このため、これらの研究で使用されるCAFはHTERTを含むレンチウイルスを用いて不死化されている。それらはiCAFと呼ばれ、その正常な対応する原発性ヒト膵臓線維芽細胞はiNFと呼ばれる。ヒト膵線維芽細胞および膵管癌細胞、AsPC-IおよびPANC-Iが市販されている。

このプロトコルは、CAF分化プロセスにおけるラミニン-332-インテグリン相互作用の効果を研究するために使用された。この相互作用およびその機能の特異性を証明するために、阻害剤化合物が用された:BM2、ラミニニン結合部位を遮断するモノクローナル抗体であるラミニニン-332α3鎖10、またはレビン1、またはレビン1、およびスネーク毒由来化合物ラミニン結合インテグリンα3β1、α6β1およびα7β111、12.

侵入アッセイでは、細胞はmCherry(iCAFおよびインテグリンα3 KO iCAF)またはGFP(AsPC-IおよびPANC-I)をコードするcDNAを含むレンチウイルスを用いて、ヘテロスフェロイド中の異なる細胞型を区別するために変換された。それらを不死化し、蛍光タンパク質(mCherryおよびGFP)発現でそれらを標識する細胞の伝達は、以前の研究13で説明されています。

プロトコル

1. 細胞マトリックス相互作用の異なるTGF-β1阻害化合物を用いた線維芽細胞/CAF分化のためのインビトロモデルとしての3Dスフェロイド

  1. 6mg/mLメチルセルロース溶液の1部および細胞培養培地の3部を混合し、MEMは熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンの1%を補充し、スフェロイド形成溶液を得た。
  2. 新たに解凍された不死化された正常線維芽細胞(iNF)、不死化CAF(iCAF)またはインテグリンα3β1 KO iCAF(通路25まで)をスフェロイド形成溶液中で再中断する。1つの96ウェルプレートを調製する場合は、過剰なスフェロイド形成溶液を調製し、10mLを加え、75,000個の細胞を加え、各スフェロイドが750個の細胞によって構成され、プレートの各ウェルごとに100μLが分布することを念頭に置く。
  3. サイトカインまたはインテグリン阻害剤が研究に含まれている場合は、それらの形成中にスフェロイドにそれらを埋め込むために、細胞懸濁液にこれらの化合物を追加します。iNFは、分化をトリガするためにTGF-β1の10 ng/mLで刺激されることに注意してください。必要に応じて、20 μg/mL BM2 または 10 μg/mL のレビン 1 などの TGF-β1 と共に阻害剤化合物を追加します。
  4. CAFホモスペロイドは、すでに分化されているので、TGF-β1刺激なしで同じ方法で調製する。任意の化合物を添加することなく、インテグリンα3 KO CAFホモスペロイドを調出す。
  5. 各ウェルに溶液の100μLを加えて丸底96マルチウェルプレート上にスフェロイド形成溶液を分配する。スフェロイド溶液が井戸に分布するたびに、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
  6. 24時間の細胞培養インキュベーターにプレートを置き、各ウェルに1つのスフェロイドを形成できるようにします。
  7. 約24時間後にスフェロイドを収集し、異なる下流の目的のためにそれらを使用する:免疫蛍光染色、リアルタイム(RT)q-PCRおよびフローサイトメトリー。スフェロイド内のECMタンパク質の沈着を含む細胞内および細胞外抗原の発現を検出するには、免疫蛍光染色を使用する。スフェロイドを単一細胞に崩壊させた後、フローサイトメトリーにより膜アンカー受容体を定量する。遺伝子活性化と転写変化を検出するには、スフェロイド細胞から単離されたmRNAのRT q-PCRを使用します。

2. スフェロイドの免疫蛍光染色

  1. 約24時間後に、分析する実験条件またはタンパク質ごとに1本の1.5mL反応管にスフェロイドを集める。例えば、TGF-β1で刺激したiNFのスフェロイドを、処理されなかった対照iNFとは異なるチューブに入れます。せん断力が強すぎるためにスフェロイドが破裂しないように、ピペット先端の端を切ってオリフィスを拡大します。1つの反応管に少なくとも5〜10のスフェロイドを含め、反復を可能にし、洗浄工程中に起こりうる損失を考慮に入れる。
  2. 1,000 x gで約30-60 sのためのベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなく、ピペッティングによってメチルセルロース含有上清を慎重に取り除きます。
  3. 1x PBSの50 μLで洗浄します。遠心分離ステップを繰り返し、2.2 に記載されているように、ピペッティングによって PBS を慎重に取り外します。
  4. 染色するタンパク質に応じて、室温で20分間PBSで50 μLの4%パラホルムアルデヒドを固定し(αSMA、NG2およびインテグリンα3β1)、または-20°Cで10分間50μLのメタノールを10分間(ラミニン-332サブユニットの場合)に固定します。
  5. 手順 2.2-2.3 で説明されているように、洗浄手順を繰り返します。
  6. 室温で4分間PBSで0.1%のトリトン-Xで細胞を透過化します。
  7. 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
  8. 5%FBSおよび2%BSAを含むPBSでスフェロイドをインキュベートし、RTで1時間、非特異的タンパク質相互作用部位を遮断する。
  9. PBSで30μLの一次抗体、2.5%FBS、1%BSAを一晩4°Cでスフェロイドをインキュベートします。次の一次抗体を使用しました: 抗αSMA Cy-3共役と抗NG2 5 μg/mL;BM2抗ラミニンα3、6F12抗ラミニンβ3および抗ラミニンγ2 20 μg/mL。
  10. 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
  11. PBSで30μLの二次抗体、2.5%のFBS、1%のBSAをRTで90分間インキュベートします。使用した次の二次抗体は、Alexa 488抗ウサギおよび抗マウス(5 μg/mL)であった。
  12. 手順2.2-2.3で説明されているように、洗浄手順を3回繰り返します。
  13. 室温で4分間、DAPI染色液30μLで細胞をインキュベートします。
  14. 手順 2.2-2.3 で説明されているように、洗浄手順を繰り返します。
  15. ガラスパスツールピペを使用して、PBSの滴に、ガラススライド上にスフェロイドを置きます。
  16. 10倍の倍率を用いてレーザー走査顕微鏡で蛍光顕微鏡でスフェロイドを画像化する。Z スタック(15~20 スタック平面)の異なる光学面で、スフェロイドの異なる光学断面を取ります。顕微鏡でレーザー設定を確立するには、目的の抗原に対して陰性の細胞からなるスフェロイドを使用するか、二次抗体でのみ染色されたスフェロイドを使用する。比較するすべてのサンプルに対して同じ設定を再利用します。
  17. 以前に公開された ImageJ ソフトウェアを使用して顕微鏡画像を分析します 14.手順を補足図 1にまとめました。背景として、目的のセルフリー領域(ROI)の集積信号密度を決定する。補正された細胞蛍光(TCCF)の合計を次のように計算します。
    figure-protocol-2816
  18. SCCFがスフェロイドの面積とスタック数に正規化されたとして、スフェロイドの全補正蛍光(TCF)を決定します。
    figure-protocol-2952

3. ホモスペロイドのRT q-PCR

  1. RT-qPCRを実行するには、50 mL反応管に少なくとも288個のスフェロイド(3つの96ウェルプレートに対応)を収集します。1,000 x gで5分間遠心分離し、ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなくピペッティングしてメチルセルロース含有上清を慎重に除去する。
  2. 1x PBSの1 mLで洗浄し、1.5 mL反応管にスフェロイドを転送します。1,000 x gで約30-60 sのためのベンチトップ遠心分離機でスフェロイドを遠心分離します。ペレット化されたスフェロイドを邪魔することなく、ピペッティングによってPBSを慎重に取り外します。
  3. 4 mg/mLコラゲナーゼB、50μg/mL DNase I、2%BSA、PBSの1mM CaCl2を37°Cで約30~45分間、5分毎に数秒間断続的にボルテックスとパルスで250μLで解離します。
  4. ステップ 3.2 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
  5. メーカーの指示に従って、市販のRNA単離キットを使用して、崩壊したスフェロイドの細胞から総RNAを単離します。
  6. メーカーの指示に従って、単離したmRNAを市販のキットでcDNAに逆転写します。
  7. リアルタイム PCR による反復での転写レベルを定量化します。使用されたプライマーは:α-SMA:Fw 5'-CCGGGAATGCGAAGGAAG GA-3'、Rev 5'アカガグタットGCGCTCCGAA-3'15;ラミニン α3鎖: Fw 5 '-GCTCAGCTTTTTTTTTGA-3', Rev 5'-TGTCTCTCTCTCAATAGC-31';ラミニン β3 鎖: Fw 5 '-GGCAGGGTAGGGGGGGCGAGGAAA-3' Rev 5'-CGGACCTTTGGTAGTAGGGCCGTGT-3'17;ラミニン γ2鎖: Fw 5 '-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3' Rev 5'-TCGAGCAAAGAGATTTGG'3 16;NG2: Fw 5'-CTGCAGGTGTGTCA-3' Rev 5'-TTGGCTTGGCGATGATG-3'18;インテグリン α3 サブユニット: Fw 5'-AGGGGATTTAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATATAT-3'19;TOP-1: Fw 5'-CCAGACGGAAGCGGAAACAAC-3' Rev 5'-GTAGGAGGCTCTCTCTGAA-3'20.
  8. 式を使用してTOP-1などの内因性参照遺伝子のCt値のCt値を補正する: 2- ΔΔCt.ΔΔCt = ΔCt(標的試料)– ΔCt(参照試料)およびΔCt=標的遺伝子または参照遺伝子のCt – TOP-I.

4. インテグリン式のフローサイトメトリー分析

  1. フローサイトメトリック解析では、少なくとも288個のスフェロイド(3つの96ウェルプレートに相当)を50mL反応管に集みます。1,000 x gで5分間遠心分離し、ピペッティングによりメチルセルロース含有上清を慎重に除去する。
  2. 1x PBSの1 mLで洗浄し、1.5 mL反応管にスフェロイドを転送します。遠心分離ステップを繰り返し、ピペッティングでPBSを慎重に取り外します。
  3. ステップ 3.3 で説明されているように、スフェロイドを解除します。
  4. ステップ 4.2 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
  5. 非特異的結合部位を遮断し、Fcγ受容体(CD16、CD32、およびCD64)への検出関連抗体の結合を防ぐために、2%の馬血清を含むPBSの100 μLで細胞をインキュベートする(または別の動物種の血清、その抗体は、その抗体は、そうでないであろう。実験で使用)および回転と4 °Cで20分のための0.1%BSA。
  6. 細胞内マーカーを染色する場合は、ステップ2.2-2.5に記載されている細胞を固定/透過化します。
  7. 2%の馬血清および0.1%のBSAを含むPBSの100 μLの一次抗体で細胞をインキュベートし、回転を伴う4°Cで30分間。一次抗体を10 μg/mLに希釈します。
  8. PBS + 0.1% BSA の 100 μL で 3 回洗浄し、その間に 1,000 x gでトップ ベンチ遠心分離機の遠心分離ステップを使用します。
  9. 2%の馬血清および0.1%のBSAを含むPBSの100 μLで二次抗体で細胞をインキュベートし、回転を伴う4°Cで30分間。二次抗体を10 μg/mLに希釈する。
  10. ステップ 4.7 で説明したように、洗浄手順を繰り返します。
  11. フローサイトメーターで2.0 x 104染色細胞を分析します。FSC-SSCドットプロットを介した単一生細胞のゲートと、選択された蛍光素に適したチャネル上のゲート細胞の蛍光を分析する。

5. ヘテロスフェロイドを用いた侵入アッセイ

  1. 異なる細胞型および対応する培地を含むヘテロスフェロイドに対するスフェロイド形成溶液を、表1に要約する。細胞は以前、mCherryまたはGFP発現のベクターを含むレンチウイルスでトランスメオ化されていた。
  2. プレートの各ウェルに100μLのスフェロイド形成溶液を充填し、細胞培養インキュベーターでプレートを24時間インキュベートし、各ウェルに1つのスフェロイドを形成できるようにします。
  3. ラットテールコラーゲンIの2mg/mLを含むゼラチン状マトリックス混合物の60 μL、市販のゲル化マトリックスの30%、ラミニン-332の2.5 μg/mLを1.5mL反応管に調製します。μスライド血管新生室の3ウェルに15μLを迅速に分配する。既にゲルを含む各ウェルに1つのスフェロイドを埋め込みます。
  4. 必要に応じて、顕微鏡下のピペットで井戸の中心にスフェロイドの位置を迅速に調整します。
  5. 次のヘテロスペロイドの手順 5.2-5.3 を繰り返し、ホモスペロイドに対してもう一度繰り返します。
  6. インキュベーター内のゲルを1時間インキュベートして固化させ、次いで、細胞培養培地でゲルを静かにオーバーレイする。
  7. 蛍光顕微鏡でスフェロイドを画像化します。Zスタックの異なる光学面で、および侵略の異なる時点(例えば、0時間、24時間、48時間、72時間)で、スフェロイドの異なる光学断面を取ります。
  8. 侵入癌細胞の数を数えることによって画像を分析します。侵入細胞は、スフェロイドを残し、侵襲領域に入ったものです。侵襲領域は、最も遠い侵略細胞によって与えられた外側と内周の間のリング領域と、侵略実験の開始時のスフェロイド境界によってそれぞれ、補足図2で概説されているように定義される。 .

結果

この実験計画の結果は、マーティンス・カバコら13に掲載されており、これらの実験から得られた結論をさらに読むことをお勧めします。

図1は、免疫蛍光スフェロイドの代表的な画像で、不滅正常線維芽細胞と不死化CAF(図1A)の両方のインテグリンα3サブユニ?...

ディスカッション

CAFの分化を研究するための適切なインビトロモデルを開発することは困難な作業です。異なるアプローチを採用した後、我々は、3Dスフェロイドモデルは、不死化されたCAFを持つ膵癌細胞間の相互作用を研究することができる、より実用的で生理学的および臨床的に関連するモデルであると結論付けた。このモデルは、少なくとも短期的な培養条件(最大48時間)において、細胞培養プラスチッ?...

開示事項

著者は利益相反を宣言しない。この資料は著者の見解のみを反映し、欧州連合は、そこに含まれる情報を使用する可能性のあるいかなる使用についても責任を負いません。

謝辞

我々は、BM2とlebein-1を準備するバーバラ・シェディングの助けを認める。私たちは、スフェロイドアッセイにおける彼女の専門知識を共有するためのアグネス・ノエルを認めます。我々は、S2条件下でレンチウイルストランスフェクションを処理する彼らの助けにソーニャ・シェルハースとマイケル・シェーファーズに感謝します。我々は、膵臓癌組織からCAFを準備するサビーヌ・フォン・リューデンの支援を認める。

これらの結果につながる研究は、欧州連合の第7フレームワークプログラムFP7/2007-2013/REA交付協定n◦(316610)のJ.A.E.に基づき、人民プログラム(マリー・キュリー・アクション)から資金を受け取りました。さらに、J.A.E.とA.C.M.C.は、セル・イン・モーション・クラスター・オブ・エクセレンス(EXC 1003-CiM)内のドイツ・フォルシュチュンゲインシャフト(DFG)によって財政的に支援されました。このプロジェクトは、ヴィルヘルム・サンダー・スティフトゥン(助成金:2016.113.1からJ.A.E.)によっても支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetoneSIGMA-ALDRICH32201
Albumin Fraction V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) RabbitInvitrogenA11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 cell lineATCCKindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifugeFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)Fluka21074
CentrifugeThermo ScientificMultifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mLCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
Collagen-I, rat tailGibcoA10483-01
Confocal microscopeZeissLSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburTM
Gelifying matrixThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotypeDAKOX 0907
Horse SerumSIGMA-ALDRICH12449-C
Human Primary Pancreatic FibroblastsPELOBiotechPB-H-6201
IncubatorHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate, 96 wells, U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotypeSIGMA-ALDRICHI8765
Multi axle rotating mixerCATRM5 80V
PANC-IATCCKindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
ParaformaldehydeRiedel-de Haën16005
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205310
Rat IgG, isotypeInvitrogen10700
Reaction tubes, 1.5 mLGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FAdd glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
VórtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoatedIbidi81501

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