JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı, immünofluorescence, transkripsiyon gibi farklı analiz sistemlerinde ele alınabilir bir tümör toplu benzeri ortamda, kanserle ilişkili fibroblastların (CAFs) farklılaşmasını incelemek için bir 3D in vitro modeli kurmaktır analiz ve yaşam hücresi görüntüleme.

Özet

Bir in vitro çalışma için ideal modelin tanımlanması, esas olarak hücrelerin farklılaşması gibi fizyolojik süreçler okurken esastır. Tümör stroma, ev sahibi fibroblastlar ayırt etmek için kanser hücreleri tarafından uyarılır. Böylece, tümör mikroortamına katkıda bulunan ve tümör ilerlemesini destekleyen bir fenotip elde ederler. Küroid modelini kullanarak, biz laminin-332 ve bu farklılaşma sürecinde α3β1 onun reseptör integral rolünü analiz hangi bir 3D in vitro model sistemi, kurdık. Bu küroid model sistemi sadece tümör mikroçevre koşullarını daha doğru bir şekilde üretmez, aynı zamanda çok yönlü bir modeldir, çünkü hem intra hem de ekstrüler olarak immünofluorescent boyama gibi farklı akış çalışmaları sağlar işaretleri, hem de yatırılmış ekstrellüler matris proteinleri. Dahası, qPCR tarafından transkripsiyonel analizler, akış sitometri ve hücresel invazyonu bu modelde incelenebilir. Burada, biz cafs ' ıntegrin α3β1 ve onun ektopik yatırılmış ligand, laminin-332, farklılaşma ve pankreas kanseri hücrelerinin istilasını destekleyen rolünü değerlendirmek için bir küroid model bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

Tümör mikroortamı çok karmaşık bir niş ve tümör hücrelerinin bakım ve ilerlemesi için son derece önemlidir1. Sadece kanser hücreleri tarafından değil, aynı zamanda stromal fibroblastlar tarafından da oluşur. Tümör hücreleri, normal dokuların stroma2özel ve farklı bir stroma ile çevrilidir. Laminin-332, pankreas adenokarsinoma3gibi farklı tümörlerin stroma içinde ekstrasellüler matris proteini ektopically ifade edilir. Dahası, ECM 'nin biyokimyasal bileşimi ve aynı zamanda rijitlik ve gerginlik gibi Biyofizik özellikleri, tümör dökme4içinde değişir. Bu tümör stroma veya "reaktif stroma", fibroblastların komşu kanser hücrelerine adaptasyon ve tümör ilerlemesi için olumlu ve destekleyici bir ortam geliştiren diğer çok önemli oyuncuların işe alınması ile kaynaklanır. Stromal fibroblastların farklılaşması kansere ilişkili fibroblastlar (CAF) ile sonuçlanır. Bu hücreler α-pürüzsüz Kas aksini (αSMA)5 veya neural/glial antijen 2 (NG2)6gibi farklı işaretçiler kullanılarak tanımlanabilir.

En uygun in vitro modeli ile tümörün MIKROORTAMıNı (TME) cafs ile reapitlemek için seçmek zordur. TME 'nin fizyolojik parametrelerini uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde taklit etme yöntemi, böyle bir model sistemi için dikkate alınmalıdır. TME içinde proliferasyon, farklılaşma, göç ve farklı hücre türlerinin istilası gibi farklı süreçler ortaya çıkar. Bu hücresel süreçler farklı yöntemlerle bireysel olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, deneysel koşulların tümör stroma ECM ile hücresel etkileşimleri dikkate almanız gerekir, çünkü substratum sertlik CAF farklılaşma sürecini etkiler. RG Wells matris sertlik hücre davranışına etkisi üzerine yorumladı ve siterografi organizasyonu ve in vitro kültürlü hücrelerde gözlenen farklılaşma durumunun artifaktüel olabilir vurgulanır7. Farklı uyaranlara, mekanik gerginlik5,7dahil CAF farklılaşma dahil gibi görünüyor. Bu önlemek için, 2D yumuşak substratlar farklılaşma çalışmaları için olası yaklaşımlar olabilir, onlar sert kültür çanak plastik sorununu atlatmak gibi. Yumuşak bir 2B yüzey, hangi fibroblastlar yetiştirilen olabilir, olabilir kollajen-I kaplamalı Poliakrilamid jelleri, böylece jel sertliği polimakrilid konsantrasyonu ve jel çapraz bağlayıcı tarafından manipüle edilebilir. ΑSMA zengin stres liflerinin yapışma ve oluşumu, jel sertliği8ile birlikte fibroblastlar içinde geliştirilmiştir. Bu sonuçlar, daha fazla fizyolojik in vitro farklılaşma modelleri için yumuşak substrat iskeleleri önemini vurgulmaktadır. Ancak, bizim elimizde bu jellerin deneysel yeniden üretilebilirliği ve görüntülenmesi zordur. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, ayrım ve invazyon çalışmaları için 2B yumuşak substrat sistemini bir 3D küre modeli olarak değiştirdik. Bu model daha klinik olarak ilgilidir ve bir in vitro organoid benzer, in vivo hücre-hücre etkileşimleri, ECM üretim ve biriktirme, yanı sıra hücre davranışı9reapitler.

Hücreleri uygun bir substrat eksikliği olduğunda kürler oluşur. Hücreler yapışkan bir yüzey olmadan bırakılırken, daha fazla veya daha az küresel bir yapı oluşturacak şekilde toplar. Eğer kürler bir hücre türünden oluşuyorsa, bunlar homospheroidler olarak adlandırılır; iki veya daha fazla farklı hücre türlerinden oluşan, heterospheroids oluşturur.

Küroid hazırlama için farklı yöntemler arasında, biz olmayan-yapışlı yuvarlak alt 96-kuyu plakaları kullanarak protokol gerçekleştirin. Maliyetlere göre çok etkilidir. Burada, biz fibroblastlar hem homospheroids üretmek, CAF veya cafs ıntegrin α3 altbirim farklılaşma sürecini incelemek için ve cafs veya ıntegrin α3 Ko cafs ve pankreatik kanal Karsinomu hücreler (ASPC-ı ve panc-ı) işgali çalışma çevreleyen matrisin içine.

Bu çalışmaların amacı, insan pankreas Karsinomu biyopsilerinde izole edilen birincil cafeleri kullanıyordu. Ancak, biyopsiler hücreleri elde etmek için az ve bu nedenle, bu çalışmalar kullanılan CAFs Lentivirus HTERT içeren kullanarak ölümsüzleşmiş olmuştur. Onlar ıcafs denir, ve onların normal meslektaşları, primer insan pankreas fibroblastlar, INFs olarak adlandırılır. İnsan pankreatik fibroblastlar ve pankreatik kanal Karsinomu hücreleri, AsPC-ı ve PANC-ı, ticari olarak mevcuttur.

Bu protokol, laminin-332-ıntegrin etkileşiminin CAF farklılaşma sürecinde etkisini incelemek için kullanılmıştır. Bu etkileşimin ve fonksiyonunun özgüllüğünü kanıtlamak için, inhibitör bileşikleri kullanıldı: km2, ıntegrin bağlayıcı sitesini engelleyen bir monoklonal antikor laminin-332 α3 Chain10, veya lebein 1, bir yılan zehiri türeyen bileşik laminin-bağlayıcı integrinler α3β1, α6β1 ve α7β111,12.

İnvazif tahlil için hücreler, heterokürlerde farklı hücre tiplerini ayırt etmek için mCherry (ıcafs ve ıntegrin α3 KO ıcafs) veya GFP (AsPC-I ve PANC-I) kodlaması içeren Lentivirus ile transpenoed edilmiştir. Hücrelerin dönüştürücü onları ölümsüzleştirmek ve/veya floresan protein (mCherry ve GFP) ifade onları etiketlemek için bir önceki çalışmada açıklanan13, daha fazla bilgi için danışılmalıdır.

Protokol

1. hücre matris etkileşimi farklı TGF-β1 inhibe bileşikleri kullanarak fibroblast/CAF farklılaşma için bir in vitro model olarak 3D kürler

  1. Mix 1 Bölüm 6 mg/mL metilselüloz çözeltisi ve 3 parça hücre kültürü medya, MEM ile tamamlayıcı 1% ısı-inaktive fetal Sığır serum (FBS) ve 1% penisilin/streptomisin küroid oluşumu çözeltisi elde etmek için.
  2. Resuspend yeni çözülür ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar (INFs), ölümsüzleştirilmiş CAF (ıcafs) veya ıntegrin α3β1 KO ICAF (25 ' e kadar geçiş) küroid oluşumu çözeltisi. 1 96 iyi plaka hazırlanırsa, bir aşırı küroid oluşumu çözeltisi hazırlamak, 10 mL ve 75.000 hücre eklemek, her küroid 750 hücreler tarafından oluşan aklınızda tutarak, ve bu 100 μL her iyi plaka başına dağıtılır.
  3. Eğer sitokinler veya ıntegrin inhibitörleri çalışmaya dahil edilir, bu bileşikleri hücre süspansiyona ekleyin, onların oluşumu sırasında küreler içine gömmek için. INFs 'in, farklılaşma tetiklemesi için 10 ng/mL TGF-β1 ile uyarılabilmesi gerektiğini unutmayın. Uygun olduğu durumlarda, 20 μg/mL BM2 veya 10 μg/mL lebein 1 gibi TGF-β1 ile birlikte inhibitör bileşikleri ekleyin.
  4. CAF homospheroidleri aynı şekilde hazırlayın ama TGF-β1 Stimulus olmadan, zaten farklılaşmış olduğundan. Entegre α3 KO CAF homospheroidleri herhangi bir bileşiğin eklenmesi olmadan hazırlayın.
  5. Her bir kuyu için 100 μL çözeltisi ekleyerek küroid oluşumu çözümünü yuvarlak alt 96 çok kuyu plakasına dağıtın. Her zaman küroid çözüm kuyularda dağıtılır, yukarı ve aşağı pipetleme ile iyi karıştırın, birkaç kez.
  6. Her kuyunda bir küre oluşturulmasına izin vermek için 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçoradaki plakayı yerleştirin.
  7. Yaklaşık 24 saat sonra kürleri toplayın ve farklı akış amaçları için bunları kullanın: immünofluorescent boyama, gerçek zamanlı (RT) q-PCR ve akış sitometri. İç ve iç-hücre dışı antijenlerin ifadesinin algılanması için, dil içinde ECM proteinlerinin birikmesi de dahil olmak üzere, immünofluorescent boyama kullanın. Kürlerin tek hücrelere dağıldıktan sonra, Akış sitometrisi ile membran bağlantılı reseptör ölçmek. Gen aktivasyonu ve transkripsiyonel değişiklikleri tespit etmek için, küre hücrelerinden yalıtılmış mRNA RT q-PCR kullanın.

2. kürlerin immünofluorescent boyama

  1. Yaklaşık 24 saat sonra bir 1,5 mL reaksiyon tüpü deneysel durum başına veya protein başına analiz edilecek sonra kürler toplayın. Örneğin, TGF-β1 ile uyarılan INFs 'in kürleri, tedavi edilmemiş kontrol Infsinden farklı bir tüpte yerleştirin. Çok güçlü kesme kuvvetleri nedeniyle kürlerin rüptürü önlemek için, Orifice büyütmek için pipet ucunun sonunu kesti. Tek bir reaksiyon tüpünde en az 5-10 küreler ekleyin, çoğaltır ve yıkama adımları sırasında olası kayıpları dikkate almak için.
  2. 1.000 x g'de yaklaşık 30-60 s için bir tezgah üst Santrifüjü ile kürleri santrifüjler. Metilselüloz içeren süpernatant 'ı pipetleme ile dikkatlice çıkarın, pelletli küreler rahatsız etmeden.
  3. 50 μL 1x PBS ile yıkayın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve 2,2 'de açıklandığı gibi PBS 'i pipetleme ile dikkatle kaldırın.
  4. Lekelenecek proteine bağlı olarak, PBS 'de 50 μL% 4 civarında formaldehite ile Oda sıcaklığında 20 dakika (αsma, NG2 ve ıntegrin α3β1 için) veya 10 dk-20 °c ' de 50 μL metanol ile (laminin-332 alt tesisleri için) düzeltin.
  5. 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  6. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca PBS 'de% 0,1 Triton-X ile hücreleri geçirgen.
  7. Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  8. 5% FBS ve% 2 BSA içeren PBS 'deki küreler, özel olmayan protein etkileşimi sitelerini engellemek için RT 'de 1 saat boyunca inküsler.
  9. PBS 'de 30 μL primer antikorlar,% 2,5 FBS ve 4 °C ' de% 1 BSA ile küreler bir gecede. Aşağıdaki primer antikorlar kullanıldı: Anti-αSMA Cy-3 konjuated ve anti-NG2 5 μg/mL 'de; BM2 Anti-laminin α3, 6F12 Anti-laminin β3 ve anti-laminin γ 2 20 μg/mL.
  10. Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  11. PBS 'de 30 μL ikincil antikorlar, 2,5% FBS ve 90 dk için RT 'de% 1 BSA ile küreler inküsler. Kullanılan aşağıdaki ikincil antikorlar: Alexa 488 Anti-tavşan ve anti-Mouse (5 μg/mL).
  12. Üç kez 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  13. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 30 μL DAPı boyama çözeltisi ile hücreleri inküser.
  14. 2.2-2.3 adımlarında açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  15. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, bir damla PBS içinde, bir cam slayt üzerinde küreler yerleştirin.
  16. Bir lazer tarama mikroskobu 10X büyütme kullanarak floresan mikroskopisi ile kürler görüntü. Bir z-yığınının farklı optik düzlemlerinde (15-20 yığın düzlemleri) farklı optik çapraz kesit alın. Mikroskopla lazer ayarlarını kurmak için, faiz antijen veya ikincil antikor ile lekelenmiş bir küroid için negatif hücrelerden oluşan bir küroid kullanın. Karşılaştırılacak tüm örnekleri için aynı ayarları yeniden kullanın.
  17. Daha önce14yayımlanan olarak ımagej yazılımı ile mikroskobik görüntüleri analiz edin. Adımlar ek Şekil 1' de özetlenmiştir. Arka plan olarak, hücre içermeyen bir ilgi alanı (YG) entegre sinyal yoğunluğunu belirleyin. Toplam düzeltilmiş hücre floresans (TCCF) olarak hesaplayın:
    figure-protocol-5452
  18. Genel olarak düzeltilmiş Floresan (TCF) ' i, TCCF 'nin bölge ve yığın sayısının normale döneceği şekilde belirleyin.
    figure-protocol-5649

3. RT q-PCR homospheroids

  1. RT-qPCR gerçekleştirmek için, en az 288 küre (3 96-kuyu plakalarına karşılık gelen) bir 50 mL reaksiyon tüpüne toplayın. 1.000 x g 'de 5 dakika Santrifüjlü ve pelleted küreler rahatsız etmeden pipetleme ile metilselüloz içeren süpernatant dikkatle çıkarın.
  2. 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve küreler 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın. 1.000 x g'de yaklaşık 30-60 s için bir tezgah üst Santrifüjü ile kürleri santrifüjler. PBS 'i pipetleme ile dikkatlice çıkarıp pelletli küreler rahatsız etmeden çıkarın.
  3. 250 μL, 4 mg/ml kolagenaz B, 50 μg/ml DNase ı,% 2 BSA, 1 mm CAcl2 ' de PBS 'de 37 °c ' de, yaklaşık 30-45 dakika boyunca, her 5 dakikada bir birkaç saniye boyunca zaman zaman yavaş bir şekilde vorherfer ve darbeli ile birlikte yer ayırın.
  4. 3,2 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  5. Üreticilerin talimatlarına göre, toplam RNA 'ya, ticari RNA yalıtım kiti kullanarak, söküsel kürlerin hücrelerinden yalıtın.
  6. Üreticinin talimatlarına göre, yalıtılmış mRNA 'yı ticari bir kit ile cDNA 'ya geri çevirir.
  7. Gerçek zamanlı PCR tarafından çoğaltır transkripsiyon seviyeleri ölçmek. Kullanılan astarlar: α-SMA: FW 5 ′-ccgaccgaatgcagaag GA-3 ′, Rev 5 ′ acagagtatttgcgctccgaa-3 ′15; Laminin α3 zincir: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′16; Laminin β3 zincir: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ Rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′17; Laminin γ2 zincir: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ Rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ 16; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ Rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′18; ıntegrin α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '19; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ Rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′20.
  8. ÜST-1 denklemi kullanarak: 2-δδctgibi bir endojen referans geni CT değeri için CT değerlerini düzeltin. ΔΔCt = ΔCt (hedef örnek) – ΔCt (referans numune) ve ΔCt = hedef geni veya referans geni BT – TOP-ı.

4. ıntegrin ifadesinin akış sitometri Analizi

  1. Akış cytometrik analiz için, en az 288 küre (3 96-kuyu plakalarına karşılık gelen) bir 50 mL reaksiyon tüpüne toplayın. 1.000 x g 'de 5 dakika santrifüj yapın ve metilselüloz içeren süpernatant 'i pipetleme ile dikkatlice çıkarın.
  2. 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve küreler 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktarın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve PBS 'i pipetleme ile dikkatle kaldırın.
  3. 3,3 adımda açıklandığı gibi kürler ayırmak.
  4. 4,2 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  5. Özel olmayan bağlama sitelerini engellemek ve Fcγ-reseptörlerine (CD16, CD32 ve CD64) algılama ile ilgili antikorların bağlanması önlemek için, 100 μL PBS% 2 at serumu (veya başka bir hayvan türünün serum içeren hücreleri inküye, antikorlar hangi olmayacaktır ) ve 0,1% BSA% 20 dk, 4 °C ' de dönme ile kullanılır.
  6. Hücre içi işaretleri boyama durumunda, 2.2-2.5 adım altında açıklandığı gibi hücreleri düzeltin/geçirgen.
  7. Hücreleri% 2 at serum içeren PBS 100 μL 'de ve döndürme ile 4 °C ' de 30 dakika boyunca% 0,1 BSA cinsinden primer antikorlar ile kulbinın. Primer antikor 10 μg/mL 'ye seyreltilmeli.
  8. 100 μL PBS + 0,1% BSA ile yıkayın üç kez, en üst tezgah santrifüjte santrifüj adımları ile 1.000 x g arasında.
  9. Hücreleri% 2 at serum içeren PBS 100 μL ve döndürme ile 4 °C ' de 30 dakika boyunca% 0,1 BSA cinsinden ikincil antikorlar ile Inkük. Sekonder antikor 10 μg/mL 'ye seyreltir.
  10. 4,7 adımda açıklandığı gibi yıkama adımını tekrarlayın.
  11. Bir akış cytometer 2,0 x 104 lekelenmiş hücreleri analiz edin. FSC-SSC nokta Arsa üzerinden tek canlı hücreler için kapı ve seçilen fluorophore için uygun kanalda Gated hücrelerin floresan analiz.

5. heterospheroids kullanarak istila tahlil

  1. Tablo 1' de özetlenen farklı hücre türlerini ve ilgili ortamları içeren heteroküroidler için küroid oluşumu çözümünü hazırlayın. Hücreler daha önce mCherry veya GFP ifadesi için vektörler içeren Lentivirus ile dönüştürücülü oldu.
  2. Tabakanın her bir kuyusu içinde küroid oluşumu çözeltisi 100 μL doldurun ve her iyi bir küre oluşturulmasına izin vermek için 24 saat hücre kültürü kuluçk plaka Inkük.
  3. 60 mg/mL sıçan kuyruk kollajen ı,% 30 ticari gelifying matris ve 2,5 μg/mL laminin-332 içeren, 1,5 mL 'lik reaksiyon tüpünde jelatinli matriks karışımının% 30unu hazırlayın. Μ-slayt anjiyogenez odasının 3 kuyularında 15 μL hızla dağıtın. Her iyi zaten jel içeren bir küroid embed.
  4. Gerekirse, mikroskopın altındaki pipet ile kürlerin yerini hızla kuyu merkezine ayarlayın.
  5. Sonraki heterospheroids için 5.2-5.3 adımlarını yineleyin ve homospheroidler için tekrar tekrarlayın.
  6. İnküyörün içindeki jelleri 1 saat boyunca katalatın ve daha sonra hücre kültürü ortamı ile jelleri nazikçe bindirin.
  7. Lazer tarama mikroskobu floresan mikroskopisi ile kürler görüntü. Bir z-yığınının farklı optik düzlemlerinde ve istilanın farklı zaman noktalarında (örn. 0 saat, 24 saat, 48 h ve 72 h) farklı optik çapraz kesit alın.
  8. İşgalci kanser hücrelerinin sayısını sayarak görüntüleri analiz edin. İşgalci hücreler, kürü terk eden ve invazif bölgeye giren olanlar. İnvazif alan, en uzağa işgal edilen hücre tarafından verilen dış ve iç Perimetreleri ile işgal deneylerinin başlangıcında, sırasıyla, ek Şekil 2 ' de özetlenen olarak küroların küre sınırına göre halka alanı olarak tanımlanır. .

Sonuçlar

Bu deneysel tasarımın sonuçları, Bu deneylerden çekilen sonuçlara ilişkin daha fazla okuma için tavsiye edilen Martins Cavaco ve al.13' te yayınlanmaktadır.

Şekil 1, immünofluorescent küroların temsili bir görüntüsü, hem ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlar ve ölümsüzleştirilmiş cafs (Şekil 1a), hem de immünofluor...

Tartışmalar

CAF farklılaşma çalışması için uygun bir in vitro model geliştirmek için zorlu bir iştir. Farklı yaklaşımlar istihdam ettikten sonra, biz bir 3D küroid modeli daha pratik olduğunu sonucuna, fizyolojik ve klinik olarak ilgili model, hangi ölümsüzleştirilmiş CAFs ile pankreas Karsinomu hücreleri arasında etkileşim incelenebilir. Bu model, hücre kültürü plastiğin sertliği, en azından kısa vadeli kültür koşullarında (48 h 'ye kadar) gibi artifaktüel stres nedeniyle fibroblastların spontan...

Açıklamalar

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor. Bu malzeme sadece yazarın görüşlerini yansıtır ve Avrupa Birliği, burada yer alan bilgilerden yapılmış olabilecek herhangi bir kullanımından sorumlu değildir.

Teşekkürler

Barbara Schedding 'in BM2 ve lebein-1 ' i hazırlamak için yaptığı yardımı kabul ediyoruz. Àgnes Noel 'i, uzmanlık alanındaki uzmanlığına göre paylaştığı için kabul ediyoruz. Biz S2 koşullarında lentiviral transfeksiyon ele yardım için Sonja Schelhaas ve Michael Schäfers teşekkür ederiz. Biz Pankreatik kanser dokusundan CAFs hazırlanması Sabine von Rüdenin yardımcı kabul.

Bu sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Birliği 'nin yedinci çerçeve programı olan FP7/2007-2013/REA hibe anlaşması uyarınca n ◦ (316610) kişi programı (Marie Curie Actions) J.A.E. için fon aldı Dahası, J.A.E. ve A.C.M.C., Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından, hücre içinde hareket kümesi mükemmellik (EXC 1003-CIM) içinde mali olarak destekleniyordu. Bu proje Ayrıca Wilhelm Sander Stiftung tarafından destekleniyordu (Grant: 2016.113.1 to J.A.E.).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetoneSIGMA-ALDRICH32201
Albumin Fraction V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) RabbitInvitrogenA11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 cell lineATCCKindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifugeFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)Fluka21074
CentrifugeThermo ScientificMultifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mLCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
Collagen-I, rat tailGibcoA10483-01
Confocal microscopeZeissLSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburTM
Gelifying matrixThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotypeDAKOX 0907
Horse SerumSIGMA-ALDRICH12449-C
Human Primary Pancreatic FibroblastsPELOBiotechPB-H-6201
IncubatorHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate, 96 wells, U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotypeSIGMA-ALDRICHI8765
Multi axle rotating mixerCATRM5 80V
PANC-IATCCKindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
ParaformaldehydeRiedel-de Haën16005
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205310
Rat IgG, isotypeInvitrogen10700
Reaction tubes, 1.5 mLGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FAdd glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
VórtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoatedIbidi81501

Referanslar

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?. Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco, ., C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -. C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmassay 150k rlerCAF3D modelfarkl la maimm nofluorescent boyamaqPCRak sitometriinvazyonekstrel ler matris jel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır