JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью этого протокола является создание 3D-модели in vitro для изучения дифференциации связанных с раком фибробластов (CAFs) в опухолевой оптоподобной среде, которая может быть решена в различных системах анализа, таких как иммунофлюоресценция, транскрипция анализ и визуализация клеток жизни.

Аннотация

Определение идеальной модели для исследования in vitro имеет важное значение, главным образом при изучении физиологических процессов, таких как дифференциация клеток. В опухолевой стромы фибробласты-хозяина стимулируются раковыми клетками, чтобы дифференцироваться. Таким образом, они приобретают фенотип, который способствует микросреде опухоли и поддерживает прогрессирование опухоли. Используя сфероидную модель, мы создали такую 3D-модель in vitro, в которой мы проанализировали роль ламинина-332 и его рецептора и его рецептора в этом процессе дифференциации. Эта система сфероидной модели не только воспроизводит условия микроокружения опухоли более точным способом, но также является очень универсальной моделью, так как она позволяет различные исследования вниз по течению, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание как внутри-, так и внеклеточного маркеры, а также отложенные внеклеточные матричные белки. Кроме того, с помощью этой модели можно изучить транскрипционный анализ qPCR, цитометрию потока и клеточного вторжения. Здесь мы описываем протокол сфероидной модели для оценки роли интегрина ЦАФов No3 З1 и его эктопически отложенного лиганда, ламинина-332, в дифференциации и в поддержке вторжения раковых клеток поджелудочной железы.

Введение

Микросреда опухоли является очень сложной нишей и чрезвычайно важно для поддержания и прогрессирования опухолевых клеток1. Он образуется не только раковыми клетками, но и стромальными фибробластами. Опухолевые клетки окружены стромы, которая специфична и отличается от стромы нормальных тканей2. Laminin-332 является внеклеточным матричным белком эктопически выражается в строми различных опухолей, таких как аденокарцинома поджелудочной железы3. Кроме того, биохимический состав ECM, а также его биофизические свойства, такиекак жесткость и напряжение, изменения в опухоли объем4 . Эта опухоль строма, или "реактивная строма", вызвана адаптацией фибробластов к соседним раковым клеткам и набором других очень важных игроков, которые разрабатывают благоприятную и благоприятную среду для прогрессирования опухоли. Дифференциация стромальных фибробластов приводит к раку связанных фибробластов (CAF). Эти клетки могут быть идентифицированы с помощью различных маркеров, таких как плавный мышечный актин (ЗСМА)5 или нервный/глиальный антиген 2 (NG2)6.

Наиболее подходящая модель in vitro для повторения микроокружения опухоли (TME) с помощью CAFs трудно выбрать. Для такой модельной системы необходимо рассмотреть метод имитации физиологических параметров ТМЭ экономически эффективным и воспроизводимым способом. В рамках ТМЭ происходят различные процессы, такие как распространение, дифференциация, миграция и вторжение различных типов клеток. Эти клеточные процессы могут выполняться индивидуально с различными методами. Тем не менее, экспериментальные условия должны учитывать клеточные взаимодействия с опухолевой стромы ECM, так как жесткость субстрата влияет на процесс дифференциации CAF. Р.Г. Уэллс прокомментировал влияние матричной жесткости на поведение клеток и подчеркнул, что цитоскелетная организация и дифференциация статуса, наблюдаемые в клетках in vitro, могут быть артемовстовыми7. Различные стимулы, кажется, участвуют в дифференциации CAF, в том числе механическое напряжение5,7. Чтобы избежать этого, 2D мягкие субстраты могут быть возможными подходами для дифференциации исследований, так как они обходят проблему жесткой культуры блюдо пластика. Мягкая 2D поверхность, на которой фибробласты могут быть выращены, может быть коллагена-I покрытием полякриламид гели, в котором гель жесткость может манипулировать концентрацией полиакриламид и гель поперечный-ссылки. Стегея и образование богатых SMA стрессовых волокон усиливаются в фибробластах вместе с гель жесткость8. Эти результаты подчеркивают важность мягких подсашных лесов субстрата для более физиологических моделей дифференциации in vitro. Тем не менее, в наших руках экспериментальной воспроизводимости и визуализации этих гелей были сложными. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы изменили 2D мягкую систему субстрата для 3D сфероидной модели для дифференциации и исследований вторжения. Эта модель является более клинически актуальной и, подобно органоиду in vitro, резюмирует взаимодействия в виво-клеточных клетках, производство и осаждение ECM, а также поведение клеток9.

Сфероиды образуются, когда клетки не хватает субстрата придерживаться. Когда клетки остаются без клейкой поверхности, они объединяются, образуя более или менее сферическую структуру. Если сфероиды состоят из одного типа клеток, они называются гомосфероидами; если состоит из двух или более различных типов клеток они образуют гетеросфероиды.

Среди различных методов подготовки сфероидов, мы выполняем протокол с использованием неадекнтных круглых нижних 96-колодцев. Он очень эффективен в отношении затрат. Здесь мы производим как гомосфероиды фибробластов, CAF или CAFs не хватает integrin No3 подразделение для изучения процесса дифференциации и гетеросфероидов CAFs или integrin No 3 KO CAFs и поджелудочной железы клетки карциномы (AsPC-I и PANC-I) для изучения вторжения в окружающую матрицу.

Целью этих исследований было использование первичных ЦАФов, изолированных от биопсии карциномы поджелудочной железы человека. Тем не менее, биопсии для получения клеток являются скудными, и по этой причине, CAFs, используемых в этих исследованиях были увековечены с использованием лентивирус, содержащий HTERT. Они называются iCAFs, и их нормальные аналоги, первичные человеческие фибробласты поджелудочной железы, называются iNFs. Фибробласты поджелудочной железы человека и клетки карциномы поджелудочной железы, AsPC-I и PANC-I, являются коммерчески доступными.

Этот протокол был использован для изучения влияния взаимодействия ламинина-332-итегрина в процессе дифференциации CAF. Чтобы доказать специфику этого взаимодействия и его функции, ингибиторные соединения были использованы: BM2, моноклональное антитело, которое блокирует место связывания интегрина ламинин-332 No3 цепи10, или lebein 1, змея яд производные соединения, которое блокирует ламинин-связывающие атегрины No3 Х1, No6 и 7 -111,12.

Для анализа вторжения, клетки были трансуминированы с лентивирусом, содержащим cDNA кодирования либо mCherry (iCAFs и integrin No 3 KO iCAFs) или GFP (AsPC-I и PANC-I), чтобы различать различные типы клеток в гетеросфероидах. Трансдукция клеток, чтобы увековечить их и / или пометить их флуоресцентным протением (mCherry и GFP) выражение описано в предыдущем исследовании13, которые следует проконсультироваться для получения дополнительной информации.

протокол

1. 3D сфероиды как модель in vitro для дифференциации фибробластов/CAF с использованием различных ингибирующих соединений клеточной матрицы

  1. Смешайте 1 часть 6 мг/мл метилцеллюлозы раствор и 3 части клеточной культуры средств массовой информации, MEM дополнен 1% тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина для получения раствора образования сфероидов.
  2. Отрептить свежеоттая увековеченные нормальные фибробласты (iNFs), увековеченные CAF (iCAFs) или integrin No3'1 KO iCAF (проход до 25) в растворе образования сфероидов. При подготовке одной пластины 96 скважин, подготовить избыток сфероидов формирования раствора, 10 мл и добавить 75000 клеток, имея в виду, что каждый сфероид состоит из 750 клеток, и что 100 Л распространяются на каждый колодец пластины.
  3. Если цитокины или ингибиторы ингибирования ингибирования включены в исследование, добавить эти соединения в клеточной суспензии, для того, чтобы вставлять их в сфероиды во время их формирования. Обратите внимание, что iNF стимулируются с 10 нг/мл TGF-No1 для того, чтобы вызвать дифференциацию. При необходимости добавьте ингибиторные соединения вместе с TGF-No1, например, 20 мкг/мл BM2 или 10 мкг/мл лебейна 1.
  4. Подготовка CAF гомосфероидов таким же образом, но без tGF-No 1 стимул, так как они уже дифференцированы. Подготовка интегрин No 3 KO CAF homospheroids без добавления какого-либо соединения.
  5. Распределите раствор образования сфероидов на круглую нижнюю 96 многоколодцную пластину, добавив 100 л раствора в каждом колодце. Каждый раз, когда раствор сфероидов распределяется в скважинах, хорошо перемешайте, вставая вверх и вниз, несколько раз.
  6. Поместите пластину в инкубатор клеточной культуры на 24 ч, чтобы один сфероид, чтобы быть сформированным в каждом колодце.
  7. Соберите сфероиды примерно через 24 ч и используйте их для различных целей вниз по течению: иммунофлуоресцентное окрашивание, в режиме реального времени (RT) q-PCR и цитометрии потока. Для обнаружения экспрессии внутриклеточных антигенов, включая осаждение белков ECM в сфероиде, используйте иммунофлуоресцентное окрашивание. После распада сфероидов в одиночные клетки, количественно мембранно-якорный рецептор по цитометрии потока. Для обнаружения активации генов и транскрипционных изменений используйте RT q-PCR мРНК, изолированный от сфероидных клеток.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание сфероидов

  1. Соберите сфероиды примерно через 24 ч в одну 1,5 мл реакционную трубку на экспериментальное состояние или на протеин, который необходимо проанализировать. Например, поместите сфероиды iNF, стимулируемые TGF-No1, в трубку, отличаемую от контрольных ИНН, которые не речатся. Чтобы избежать разрыва сфероидов из-за слишком сильных сил сдвига, вырежьте конец кончика пипетки, чтобы увеличить обита. Включите не менее 5-10 сфероидов в одну реакционную трубку, чтобы позволить репликации и принять во внимание возможные потери во время стирки шагов.
  2. Centrifuge сфероидов со скамейкой верхней центрифуги около 30-60 с на 1000 х г. Тщательно удалите метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов.
  3. Вымойте 50 л 1x PBS. Повторите шаг центрифугации и тщательно удалите PBS путем пипетки, как описано в 2.2.
  4. В зависимости от белка, который будет окрашен, исправить с 50 qL 4% параформальдегида в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре (для ЗСМА, NG2 и атегрин No3 '1) или с 50 зл метанола в течение 10 мин при -20 КС (для ламина-332 субъединиц).
  5. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2.2-2.3.
  6. Пермяки клетки с 0,1% Triton-X в PBS в течение 4 мин при комнатной температуре.
  7. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  8. Инкубировать сфероиды в PBS, содержащий 5% FBS и 2% BSA, для 1 ч на RT, чтобы блокировать неспецифические сайты взаимодействия белка.
  9. Инкубировать сфероиды с 30 qL первичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA при 4 кв.м. Использовались следующие первичные антитела: анти-ЗСМА Cy-3 конъюгированные и анти-NG2 при 5 мкг/мл; BM2 анти-ламинин No3, 6F12 анти-ламин No3 и анти-ламинин No2 20 мкг/мл.
  10. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  11. Инкубировать сфероиды с 30 зл вторичных антител в PBS, 2,5% FBS и 1% BSA на RT в течение 90 мин. Следующие вторичные антитела, используемые были: Alexa 488 анти-кролик и анти-мышь (5 мкг/мл).
  12. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2,2-2,3 три раза.
  13. Инкубировать клетки с 30 злитроду dAPI окрашивающий раствор в течение 4 мин при комнатной температуре.
  14. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шагах 2.2-2.3.
  15. Поместите сфероиды на стеклянную горку, в каплю PBS, используя стеклянный труба Пастер.
  16. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе с помощью увеличения 10x. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стек (15-20 стек самолетов). Для установления лазерных настроек в микроскопе используйте сфероид, состоящий из клеток, отрицательных для антигена интереса, или сфероида, окрашенного только вторичным антителом. Повторное использование одинаковых параметров для всех образцов, которые будут сравниваться.
  17. Проанализируйте микроскопические изображения с помощью программного обеспечения ImageJ, опубликованного ранее14. Шаги обобщены на дополнительной рисунке 1. В качестве фона определите плотность встроенного сигнала области, свободной от клеток (ROI). Рассчитайте общую скорректированную флуоресценцию клеток (TCCF) по следующим словам:
    figure-protocol-5826
  18. Определите общую исправленную флуоресценцию (TCF) сфероидов, поскольку TCCF нормализуется в области сфероидов и количество стеков.
    figure-protocol-6037

3. RT q-PCR гомосфероидов

  1. Для выполнения RT-qPCR, собрать по крайней мере 288 сфероидов (соответствующих трем 96-коловидных пластин) в 50 мл реакционную трубку. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащие супернатант путем pipetting, не нарушая гранулы сфероидов.
  2. Вымойте 1 мл 1x PBS и перенесите сфероиды в реакционную трубку 1,5 мл. Centrifuge сфероидов со скамейкой верхней центрифуги около 30-60 с на 1000 х г. Тщательно удалите PBS путем pipetting, не нарушая гранулированных сфероидов.
  3. Диссоциатив сфероидов с 250 мг/мл коллагеназа B, 50 мкг/мл DNase I, 2% BSA, 1 мМ CaCl2 в PBS при 37 C в течение 30-45 минут, мягко вихревой и пульсирующий с перерывом в течение нескольких секунд каждые 5 минут.
  4. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 3.2.
  5. Изолировать общую РНК из клеток распавшиеся сфероиды с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК, в соответствии с инструкциями производителей.
  6. Обратный транскрибировать изолированные мРНК в кДНК с коммерческим комплектом, в соответствии с инструкциями производителей.
  7. Количественная оценка уровней транскрипции в репликациях в режиме реального времени PCR. Праймеры, используемые были: З-СМА: Fw 5 "-CCGACCGAATGCAGAAG ГА-3", Rev 5 "ACAGAGTTTTGCGCTCCGAA-3"15; Ламинин No 3 цепи: Fw 5 "-GCTCAGCTGTGTTGTGTGTTGTTTGA-3", Rev 5 "-TGTCTGCCTGCGCCAATAGC-3"16; Ламин No3 цепи: Fw 5 "-GGCAGATTAGGGCAGGCGAGGAGA-3" Rev 5 "-CGGACCTGCTGGGAGGAGGAGGT-3"17; Ламинин No 2 цепи: Fw 5 "-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3" Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 " 16; NG2: Fw 5'-CTGCAGGTCTATGTGTGTGTGTCGGTCA-3 "Rev 5"-TTGGCTTGACCCTACTATG-3" инегрин No3 подразделение: Fw 5'-AGGGGTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; ТОП-1: Fw 5"-CCAGACGGAAGCGCGGAAAC-3 "Rev 5"-GTCCAGGCCTATCTGAA-3"20.
  8. Исправьте значения Ct для Ct-значения эндогенного эталонного гена, такого как TOP-1, используя уравнение: 2- ЗСт. КТ (целевая выборка) - «Ct » (справочная выборка) и «Ct» Кт целевого гена или эталонного гена – TOP-I.

4. Анализ цитометрии потока экспрессии интегрина

  1. Для цитометрического анализа потока соберите не менее 288 сфероидов (соответствующих трем 96-колодульным пластинам) в реакционную трубку мощностью 50 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 х г и тщательно удалить метилцеллюлозы содержащего супернатант путем pipetting.
  2. Вымойте 1 мл 1x PBS и перенесите сфероиды в реакционную трубку 1,5 мл. Повторите шаг центрифугации и осторожно удалите PBS путем пипетки.
  3. Разъедините сфероиды, описанные в шаге 3.3.
  4. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 4.2.
  5. Чтобы блокировать неспецифические места связывания и предотвратить привязку соответствующих к обнаружению антител к FC-рецепторам (CD16, CD32 и CD64), инкубировать клетки в 100 ЗЛ PBS, содержащих 2% лошадиной сыворотки (или сыворотки другого вида животных, антителакоторых которых не будут используется в эксперименте) и 0,1% BSA в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия с вращением.
  6. В случае окрашивания внутриклеточных маркеров, исправить / пермяки клетки, как описано под шагом 2.2-2.5.
  7. Инкубировать клетки с первичными антителами в 100 л PBS, содержащих 2% сыворотки лошади и 0,1% BSA в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия с вращением. Разбавить первичные антитела до 10 мкг/мл.
  8. Вымойте со 100 л PBS - 0,1% BSA три раза, с центрифуги шаги в верхней скамейке центрифуги на 1000 х г между ними.
  9. Инкубировать клетки вторичными антителами в 100 л PBS, содержащих 2% сыворотки лошади и 0,1% BSA в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия с вращением. Разбавить вторичные антитела до 10 мкг/мл.
  10. Повторите шаг стирки, как это объясняется в шаге 4.7.
  11. Проанализируйте 2.0 x 104 окрашенных клетки в цитометре потока. Ворота для одиночных живых клеток через участок точки FSC-SSC и анализируют флуоресценцию закрытых клеток на канале, подходящем для выбранного флюорофора.

5. Вторжение ассси с использованием гетеросфероидов

  1. Подготовьте раствор образования сфероидов для гетеросфероидов, содержащих различные типы клеток и соответствующие среды, как обобщено в таблице 1. Клетки ранее были трансумцированы с лентивирусом, содержащим переносчики для выражения mCherry или GFP.
  2. Заполните 100 л раствора образования сфероидов в каждом колодце пластины и инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 ч, чтобы один сфероид образуется в каждом колодце.
  3. Приготовьте 60 мг/мл коллагена крысиного хвоста I, 30% коммерческой гелифицирующей матрицы и 2,5 мкг/мл ламинина-332 в реакционной трубке 1,5 мл. Быстро распределите 15 л в 3 скважинах камеры ангиогенеза. Вставлять по одному сфероиду в каждый колодец, уже содержащий гель.
  4. При необходимости быстро отрегулируйте расположение сфероида к центру колодца с помощью пипетки под микроскопом.
  5. Повторите шаги 5.2-5.3 для следующих гетеросфероидов и повторите еще раз для гомосфероидов.
  6. Инкубировать гели в инкубаторе на 1 ч, чтобы затвердеть, а затем аккуратно наложить гели с клеточной культуры среды.
  7. Изображение сфероидов флуоресценцией микроскопии в лазерном сканирующем микроскопе. Возьмите различные оптические поперечные сфероид на различных оптических плоскостях z-стека и в разное время точки вторжения (например, 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч).
  8. Проанализируйте изображения, подсчитывая количество вторгшихся раковых клеток. Вторжение клетки те, которые покинули сфероид и вошел в инвазивной области. Инвазивная область определяется как область кольца между внешними и внутренними периметрами, приведенными дальней вторгшейся клеткой, и сфероидной границей сфероида в начале экспериментов вторжения, соответственно, как указано на дополнительном рисунке 2 .

Результаты

Результаты этого экспериментального проекта опубликованы в Martins Cavaco et al.13, который рекомендуется для дальнейшего прочтения выводов, которые были сделаны из этих экспериментов.

Рисунок 1, репрезентативное и...

Обсуждение

Разработка соответствующей модели in vitro для изучения дифференциации CAF является сложной задачей. После использования различных подходов, мы пришли к выводу, что 3D сфероидная модель является более практичной, физиологической и клинически актуальной моделью, в которой взаимодействие ме...

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов. Этот материал отражает только мнения автора, и Европейский союз не несет ответственности за любое использование информации, содержащейся в нем.

Благодарности

Мы признаем помощь Барбары Шеддинг в подготовке BM2 и lebein-1. Мы признательны Огнес Ноэль за то, что она поделилась своим опытом в сфероидных анализах. Мы благодарим Соню Шелхаас и Михаэля Шефера за помощь в обработке трансфекции лентивирвейра в условиях S2. Мы признаем помощь Сабины фон Рорден в подготовке ЦАФов из ткани рака поджелудочной железы.

Исследования, приведившие к этим результатам, получили финансирование от Программы «Люди» (Marie Curie Actions) Седьмой рамочной программы Европейского союза FP7/2017-2013/ в соответствии с соглашением о предоставлении грантов REA (316610) J.A.E. Кроме того, J.A.E. и A.C.M.C. оказывали финансовую поддержку Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках кластера передового опыта «Клетки в движении» (EXC 1003-CiM). Этот проект также был поддержан Вильгельмом Сандером Стифтунгом (грант: 2016.113.1 до J.A.E.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetoneSIGMA-ALDRICH32201
Albumin Fraction V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) RabbitInvitrogenA11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 cell lineATCCKindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifugeFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)Fluka21074
CentrifugeThermo ScientificMultifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mLCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
Collagen-I, rat tailGibcoA10483-01
Confocal microscopeZeissLSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburTM
Gelifying matrixThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotypeDAKOX 0907
Horse SerumSIGMA-ALDRICH12449-C
Human Primary Pancreatic FibroblastsPELOBiotechPB-H-6201
IncubatorHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate, 96 wells, U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotypeSIGMA-ALDRICHI8765
Multi axle rotating mixerCATRM5 80V
PANC-IATCCKindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
ParaformaldehydeRiedel-de Haën16005
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205310
Rat IgG, isotypeInvitrogen10700
Reaction tubes, 1.5 mLGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FAdd glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
VórtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoatedIbidi81501

Ссылки

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment?. Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355 (2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco, ., C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14 (2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -. P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -. C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -. L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -. Z., Lin, R. -. Z., Chang, H. -. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150CAF3DqPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены