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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Zusammenfassung

Die Definition des idealen Modells für eine In-vitro-Studie ist vor allem bei der Untersuchung physiologischer Prozesse wie der Zelldifferenzierung von entscheidender Bedeutung. Im Tumor stroma werden Wirtsfibroblasten von Krebszellen zur Differenzierung angeregt. So erwerben sie einen Phänotyp, der zur Tumormikroumgebung beiträgt und die Tumorprogression unterstützt. Mit Hilfe des Sphäroidmodells haben wir ein solches 3D-In-vitro-Modellsystem eingerichtet, in dem wir die Rolle von Laminin-332 und dessen Rezeptorintegrin 3-1 in diesem Differenzierungsprozess analysiert haben. Dieses Sphäroid-Modellsystem reproduziert nicht nur die Tumor-Mikroumgebungsbedingungen genauer, sondern ist auch ein sehr vielseitiges Modell, da es verschiedene nachgelagerte Studien ermöglicht, wie z. B. immunfluoreszierende Färbung ender intra- und extrazellulärer Marker sowie abgelagerte extrazelluläre Matrixproteine. Darüber hinaus können Transkriptionsanalysen durch qPCR, Durchflusszytometrie und zelluläre Invasion mit diesem Modell untersucht werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll eines Sphäroidmodells zur Bewertung der Rolle des INtegrins von CAFs und seines ektopisch abgelagerten Ligands Laminin-332 bei der Differenzierung und bei der Unterstützung der Invasion von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen.

Einleitung

Die Tumormikroumgebung ist eine sehr komplexe Nische und extrem wichtig für die Erhaltung und Progression der Tumorzellen1. Es wird nicht nur von den Krebszellen, sondern auch von stromalen Fibroblasten gebildet. Die Tumorzellen sind von einem Stroma umgeben, der spezifisch ist und sich von den Stroma normaler Gewebe2unterscheidet. Laminin-332 ist ein extrazelluläres Matrixprotein, das ektopisch im Stroma verschiedener Tumoren, wie z.B. des Pankreas-Adenokarzinoms3, exprimiert wird. Darüber hinaus verändern sich die biochemische Zusammensetzung des ECM und seine biophysikalischen Eigenschaften, wie Steifigkeit und Spannung, innerhalb der Tumormasse4. Dieser Tumor stroma, oder "reaktive se", wird durch eine Anpassung von Fibroblasten an die benachbarten Krebszellen und durch die Rekrutierung anderer sehr wichtiger Akteure verursacht, die ein günstiges und unterstützendes Umfeld für die Tumorprogression entwickeln. Die Differenzierung von stromalen Fibroblasten führt zu krebsassoziierten Fibroblasten (CAF). Diese Zellen können mit verschiedenen Markern identifiziert werden, wie z.B. mit dem glatten Muskelaktin (SMA)5 oder dem neuronalen/glialen Antigen 2 (NG2)6.

Das am besten geeignete In-vitro-Modell, um die Tumormikroumgebung (TME) mit CAFs zu rekapitulieren, ist schwer zu wählen. Die Methode, physiologische Parameter der TME kosteneffizient und reproduzierbar nachzuahmen, muss für ein solches Modellsystem in Betracht gezogen werden. Innerhalb der TME treten verschiedene Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Migration und Invasion der verschiedenen Zelltypen auf. Diese zellulären Prozesse können individuell mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt werden. Die experimentellen Bedingungen müssen jedoch die zellulären Wechselwirkungen mit dem Tumor stroma ECM berücksichtigen, da die Steifigkeit des Substrats den CAF-Differenzierungsprozess beeinflusst. R.G. Wells kommentierte die Auswirkungen der Matrixsteifigkeit auf das Zellverhalten und betonte, dass die zytoskelettale Organisation und der Differenzierungsstatus, die in in vitro kultivierten Zellen beobachtet wurden, artefactual sein könnten7. Verschiedene Reize scheinen an der CAF-Differenzierung beteiligt zu sein, einschließlich mechanischer Spannung5,7. Um dies zu vermeiden, könnten 2D-weiche Substrate mögliche Ansätze für Differenzierungsstudien sein, da sie das Problem der steifen Kulturschale Kunststoff umgehen. Eine weiche 2D-Oberfläche, auf der Fibroblasten angebaut werden können, können kollagen-I-beschichtete Polyacrylamidgele sein, wobei die Gelsteifigkeit durch die Konzentration von Polyacrylamid und dem Gel-Verlinker manipuliert werden kann. Die Haftung und Bildung von SMA-reichen Spannungsfasern wird in Fibroblasten zusammen mit der Gelsteifigkeit8verstärkt. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung weicher Substratgerüste für physiologischere In-vitro-Differenzierungsmodelle. In unseren Händen waren jedoch die experimentelle Reproduzierbarkeit und Bildgebung dieser Gele eine Herausforderung. Um diese Mängel zu überwinden, haben wir das 2D-Softsubstratsystem für ein 3D-Sphäroidmodell für Differenzierungs- und Invasionsstudien geändert. Dieses Modell ist klinisch relevanter und rekapituliert, ähnlich wie ein In-vitro-Organoid, in vivo Zell-Zell-Wechselwirkungen, ECM-Produktion und -Deposition sowie Zellverhalten9.

Sphäroide entstehen, wenn zellenein Substrat fehlt, an dem sie haften können. Wenn die Zellen ohne Klebefläche verlassen werden, aggregieren sie sich zu einer mehr oder weniger kugelförmigen Struktur. Wenn die Sphäroide aus einem Zelltyp bestehen, werden sie Homosphäroide genannt; wenn sie aus zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen bestehen, bilden sie Heterosphäride.

Unter den verschiedenen Methoden für die Sphäroid-Vorbereitung führen wir das Protokoll mit nicht haftenden runden 96-Well-Platten durch. Es ist sehr effektiv in Bezug auf die Kosten. Hier produzieren wir sowohl Homosphäoide von Fibroblasten, CAF oder CAFs ohne die Untereinheit integrin 3, um den Differenzierungsprozess und die Heterosphäroide von CAFs oder Integrin-KO-CAFs und Pankreaskanalkarzinomzellen (AsPC-I und PANC-I) zu untersuchen, um die Invasion zu untersuchen. in die umgebende Matrix.

Ziel dieser Studien war die Verwendung primärer CAFs, die aus biopsien humanen Pankreaskarzinomen isoliert wurden. Die Biopsien zur Gewinnung der Zellen sind jedoch knapp, und aus diesem Grund wurden die in diesen Studien verwendeten CAFs mit dem Lentivirus, das HTERT enthält, verewigt. Sie werden iCAFs genannt, und ihre normalen Gegenstücke, primäre menschliche Pankreas-Fibroblasten, werden als iNFs bezeichnet. Die menschlichen Pankreas-Fibroblasten und die Pankreaskanal-Karzinomzellen AsPC-I und PANC-I sind im Handel erhältlich.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Laminin-332-Integrin-Wechselwirkung im CAF-Differenzierungsprozess zu untersuchen. Um die Spezifität dieser Wechselwirkung und ihrer Funktion zu beweisen, wurden Inhibitorverbindungen verwendet: BM2, ein monoklonaler Antikörper, der die Integrin-Bindungsstelle die Laminin-332-Kette10oder Lebein 1 blockiert, eine von Schlangengift abgeleitete Verbindung, die die Laminin-Bindungs-Integrine , 3, 1, 11,12, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

Für den Invasionstest wurden Zellen mit Lentivirus transduziert, die cDNA-Codierung entweder mCherry (iCAFs und Integrin 3 KO iCAFs) oder GFP (AsPC-I und PANC-I) enthielten, um die verschiedenen Zelltypen in den Heterosphäroiden zu unterscheiden. Die Transduktion der Zellen, um sie zu verewigen und/oder sie mit fluoreszierender Proteinexpression (mCherry und GFP) zu kennzeichnen, wird in einer früheren Studie13beschrieben, die für weitere Informationen konsultiert werden sollte.

Protokoll

1. 3D-Sphäroide als In-vitro-Modell zur Fibroblasten-/CAF-Differenzierung unter Verwendung verschiedener TGF-1-Hemmverbindungen der Zell-Matrix-Wechselwirkung

  1. Mischen Sie 1 Teil von 6 mg/ml Methylcelluloselösung und 3 Teile der Zellkulturmedien, MEM ergänzt mit 1% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, um die Sphäroidbildungslösung zu erhalten.
  2. Resuspend frisch aufgetaut verewigte normale Fibroblasten (iNFs), verewigte CAF (iCAFs) oder Integrin 3-1 KO iCAF (Durchgang bis zu 25) in der Sphäroid-Formationslösung. Wenn Sie eine 96-Well-Platte vorbereiten, bereiten Sie einen Überschuss an Sphäroid-Bildungslösung, 10 ml und fügen Sie 75.000 Zellen, wobei zu berücksichtigen, dass jedes Sphäroid aus 750 Zellen besteht, und dass 100 l pro Bohrkörper der Platte verteilt sind.
  3. Wenn Zytokine oder Integrin-Inhibitoren in der Studie enthalten sind, fügen Sie diese Verbindungen der Zellsuspension hinzu, um sie während ihrer Bildung in die Sphäroide einzubetten. Beachten Sie, dass iNFs mit 10 ng/mL TGF-Nr. 1 stimuliert werden, um eine Differenzierung auszulösen. Fügen Sie gegebenenfalls Inhibitorverbindungen zusammen mit TGF-1 hinzu, wie z. B. 20 g/ml BM2 oder 10 g/ml Lebein 1.
  4. Bereiten Sie CAF-Homosphäride auf die gleiche Weise vor, jedoch ohne den TGF-1-Stimulus, da sie bereits differenziert sind. Bereiten Sie die Integrin-Homosphäroide von KO CAF 3 vor, ohne dass eine Verbindung zukommt.
  5. Verteilen Sie die Sphäroid-Formationslösung auf eine runde 96-Platte mit mehreren Bohrscheiben, indem Sie in jedem Bohrwert 100 l der Lösung hinzufügen. Jedes Mal, wenn die Sphäroid-Lösung in den Brunnen verteilt wird, gut mischen, indem Sie auf und ab, mehrmals.
  6. Legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator für 24 h, damit ein Sphäroid in jedem Brunnen gebildet werden kann.
  7. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h und verwenden Sie sie für verschiedene nachgeschaltete Zwecke: immunfluoreszierende Färbung, Echtzeit (RT) q-PCR und Durchflusszytometrie. Um die Expression von intra- und extrazellulären Antigenen, einschließlich der Ablagerung von ECM-Proteinen im Sphäroid, zu detektieren, verwenden Sie immunfluoreszierende Färbung. Nach dem Zerfall von Sphäroiden in einzelne Zellen, quantifizieren Membran-verankerten Rezeptor durch Durchflusszytometrie. Um Genaktivierung und Transkriptionsänderungen zu erkennen, verwenden Sie RT q-PCR von mRNA isoliert aus den Sphäroidzellen.

2. Immunfluoreszierende Färbung von Sphäroiden

  1. Sammeln Sie die Sphäroide nach ca. 24 h in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen pro Versuchszustand oder pro zu analysierendem Protein. Platzieren Sie z. B. die Sphäroide von iNFs, die mit TGF-1 stimuliert wurden, in ein Rohr, das sich von den Kontroll-iNFs unterscheidet, die nicht behandelt wurden. Um einen Bruch der Sphäroide durch zu starke Scherkräfte zu vermeiden, schneiden Sie das Ende der Pipettenspitze, um die Öffnung zu vergrößern. Fügen Sie mindestens 5-10 Sphäroide in ein Reaktionsrohr ein, um Replikationen zu ermöglichen und die möglichen Verluste während der Waschschritte zu berücksichtigen.
  2. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Entfernen Sie den Methylcellulose-haltigen Überstand vorsichtig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  3. Waschen Sie mit 50 l von 1x PBS. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren, wie in 2.2 beschrieben.
  4. Je nach zu färbendem Protein mit 50 l 4% Paraformaldehyd in PBS 20 Minuten bei Raumtemperatur (für SMA, NG2 und Integrin 3,1) oder mit 50 l Methanol für 10 min bei -20 °C (für Laminin-332-Untereinheiten) fixieren.
  5. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 erläutert.
  6. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1% Triton-X in PBS für 4 min bei Raumtemperatur.
  7. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  8. Inkubieren Sie die Sphäroide in PBS, die 5% FBS und 2% BSA enthalten, für 1 h bei RT, um unspezifische Protein-Interaktionsstellen zu blockieren.
  9. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 L Primärantikörpern in PBS, 2,5% FBS und 1% BSA bei 4 °C über Nacht. Es wurden folgende primäre Antikörper verwendet: Anti-SMA Cy-3 konjugiert und Anti-NG2 bei 5 g/ml; BM2 Anti-Laminin 3, 6F12 Anti-Laminin 3 und Anti-Laminin-Nr. 2 20 g/ml.
  10. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  11. Inkubieren Sie die Sphäroide mit 30 l sekundären Antikörpern in PBS, 2,5% FBS und 1% BSA bei RT für 90 min. Die folgenden sekundären Antikörper wurden verwendet: Alexa 488 Anti-Kaninchen und Anti-Maus (5 g/ml).
  12. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 dreimal erläutert.
  13. Inkubieren Sie die Zellen mit 30 l DAPI-Färbelösung für 4 min bei Raumtemperatur.
  14. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in den Schritten 2.2-2.3 erläutert.
  15. Legen Sie die Sphäroide auf eine Glasrutsche, in einem Tropfen PBS, mit einer Glas Pasteur Pipette.
  16. Stellen Sie die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laserscanmikroskop mit einer Vergrößerung von 10x ab. Nehmen Sie den unterschiedlichen optischen Querschnitt des Sphäroids auf verschiedenen optischen Ebenen eines Z-Stacks (15-20 Stapelebenen). Um die Lasereinstellungen im Mikroskop festzulegen, verwenden Sie ein Sphäroid, das aus Zellen besteht, die negativ für das Antigen von Interesse sind, oder ein Sphäroid, das nur mit dem sekundären Antikörper gefärbt ist. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für alle Zusnmuster wieder, die verglichen werden.
  17. Analysieren Sie die mikroskopischen Bilder mit ImageJ Software, wie zuvor veröffentlicht14. Die Schritte sind in Ergänzender Abbildung 1zusammengefasst. Bestimmen Sie als Hintergrund die integrierte Signaldichte einer zellfreien Interessenregion (ROI). Berechnen Sie die gesamte korrigierte Zellfluoreszenz (TCCF) wie:
    figure-protocol-6190
  18. Bestimmen Sie die gesamte korrigierte Fluoreszenz (TCF) der Sphäroide, da sich der TCCF auf den Sphäroidbereich und die Anzahl der Stapel normalisiert.
    figure-protocol-6422

3. RT q-PCR von Homosphäroiden

  1. Um RT-qPCR durchzuführen, sammeln Sie mindestens 288 Sphäroide (entsprechend drei 96-Well-Platten) in ein 50 ml Reaktionsrohr. Zentrifugieren Sie 5 min bei 1.000 x g und entfernen Sie den methylcellulosehaltigen Überstand sorgfältig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  2. Mit 1 ml 1x PBS waschen und die Sphäroide in ein 1,5 ml Reaktionsrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Sphäroide mit einer Tischzentrifuge für ca. 30-60 s bei 1.000 x g. Entfernen Sie die PBS vorsichtig durch Pipettieren, ohne die pelletierten Sphäroide zu stören.
  3. Dissoziieren Sie die Sphäroide mit 250 l von 4 mg/ml Kollagenase B, 50 g/ml DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl2 in PBS bei 37 °C für ca. 30-45 min, indem sie alle 5 Minuten sanft alle 5 Minuten sanft wirbeln und pulsieren.
  4. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 3.2 erläutert.
  5. Isolieren Sie die gesamte RNA aus den Zellen zerfallener Sphäroide mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit, gemäß den Anweisungen der Hersteller.
  6. Transkribieren Sie die isolierte mRNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen in cDNA.
  7. Quantifizieren Sie die Transkriptionsebenen in Replikationen durch Echtzeit-PCR. Die verwendeten Primer waren: '-SMA: Fw 5'-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3', Rev 5' ACAGAGTATGCGCTCCGAA-3'15; Laminin 3 Kette: Fw 5-GCTCCTGTTTGTGGTTGA-3, Rev 5-TGTCTGCCTCTGCCAATAGC-3"16; Laminin 3 Kette: Fw 5-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3- Rev 5-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3-17; Laminin -Kette Nr. 2: Fw 5-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3' Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 Rev 5-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 Untereinheit integrin 3: Fw 5'-AGGGGGGACCTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACTAC-3'19; TOP-1: Fw 5-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3" Rev 5-GTCCAGGCGCTCCTCTTGAA-3"20.
  8. Korrigieren Sie die Ct-Werte für den Ct-Wert eines endogenen Referenzgens wie TOP-1 mit der Gleichung: 2- .Ct. Ct = Ct (Zielprobe) – Ct (Referenzprobe) und Ct= Ct des Zielgens oder Referenzgens – TOP-I.

4. Durchflusszytometrieanalyse der Integrinexpression

  1. Für die zytometrische Durchflussanalyse sammeln Sie mindestens 288 Sphäroide (entsprechend drei 96-Well-Platten) in ein 50 ml Reaktionsrohr. Zentrifugieren Sie 5 min bei 1.000 x g und entfernen Sie den methylcellulosehaltigen Überstand vorsichtig durch Pipettieren.
  2. Mit 1 ml 1x PBS waschen und die Sphäroide in ein 1,5 ml Reaktionsrohr übertragen. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren.
  3. Dissoziieren Sie die Sphäroide, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
  4. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 4.2 erläutert.
  5. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und die Bindung nachweisrelevanter Antikörper an Fc-Rezeptoren (CD16, CD32 und CD64) zu verhindern, inkubieren Sie die Zellen in 100 l PBS, die 2 % Pferdeserum (oder Serum einer anderen Tierart, deren Antikörper nicht im Experiment) und 0,1% BSA für 20 min bei 4 °C mit Rotation.
  6. Bei der Färbung intrazellulärer Marker, fix/permeabilisieren Sie die Zellen wie unter Schritt 2.2-2.5 beschrieben.
  7. Inkubieren Sie die Zellen mit den primären Antikörpern in 100 l PBS, die 2% Pferdeserum und 0,1% BSA für 30 min bei 4 °C mit Rotation enthalten. Verdünnen Sie den primären Antikörper auf 10 g/ml.
  8. Waschen Sie mit 100 l PBS + 0,1% BSA dreimal, mit Zentrifugationsschritten in der oberen Bankzentrifuge bei 1.000 x g dazwischen.
  9. Inkubieren Sie die Zellen mit den sekundären Antikörpern in 100 l PBS, die 2% Pferdeserum und 0,1% BSA für 30 min bei 4 °C mit Rotation enthalten. Sekundärantikörper auf 10 g/ml verdünnen.
  10. Wiederholen Sie den Waschschritt, wie in Schritt 4.7 erläutert.
  11. Analysieren Sie 2,0 x 104 gebeizte Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor für einzelne lebende Zellen über das FSC-SSC-Punktdiagramm und analysieren die Fluoreszenz der Gated-Zellen auf dem Kanal, der für das ausgewählte Fluorophor geeignet ist.

5. Invasionstest mit Heterosphäroiden

  1. Bereiten Sie die Sphäroidbildungslösung für Heterosphäoide vor, die die verschiedenen Zelltypen und die entsprechenden Medien enthalten, wie in Tabelle 1zusammengefasst. Die Zellen waren zuvor mit Lentivirus-haltigen Vektoren für mCherry oder GFP-Expression transduziert worden.
  2. Füllen Sie 100 l der Sphäroid-Bildungslösung in jedem Brunnen der Platte und inkubieren Sie die Platte im Zellkultur-Inkubator für 24 h, damit in jedem Brunnen ein Sphäroid gebildet werden kann.
  3. Bereiten Sie 60 l gelatinöse Smatrixmischung vor, die 2 mg/ml Rattenschwanzkollagen I, 30 % der kommerziellen Gelifiermatrix und 2,5 g/ml Laminin-332 in einem 1,5 ml Reaktionsröhrchen enthält. Verteilen Sie schnell 15 l in 3 Brunnen der Angiogenesekammer. Einbetten Eines Sphäroids in jeden Brunnen, der bereits das Gel enthält.
  4. Bei Bedarf stellen Sie die Position des Sphäroids mit einer Pipette unter dem Mikroskop schnell auf die Mitte des Brunnens ein.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.3 für die nächsten Heterosphäroide und wiederholen Sie die Stolefürstoiden erneut für die Homsroide.
  6. Inkubieren Sie die Gele im Inkubator für 1 h, um zu erstarren und dann die Gele mit Zellkulturmedium sanft zu überlagern.
  7. Bildn die Sphäroide durch Fluoreszenzmikroskopie in einem Laserscanmikroskop. Nehmen Sie unterschiedliche optische Nutzprofile des Sphäroids auf verschiedenen optischen Ebenen eines Z-Stacks und zu verschiedenen Zeitpunkten der Invasion (z. B. 0 h, 24 h, 48 h und 72 h).
  8. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie die Anzahl der eindringenden Krebszellen zählen. Eindringende Zellen sind diejenigen, die das Sphäroid verlassen haben und in den invasiven Bereich eingedrungen sind. Der invasive Bereich ist definiert als der Ringbereich zwischen dem äußeren und inneren Umfang, der durch die am weitesten eingedrungene Zelle und durch die Sphäroidgrenze des Sphäroids zu Beginn der Invasionsexperimente angegeben wird, wie in der ergänzenden Abbildung 2 beschrieben. .

Ergebnisse

Die Ergebnisse dieses experimentellen Entwurfs werden in Martins Cavaco et al.13veröffentlicht, was für die weitere Lektüre der Schlussfolgerungen, die aus diesen Experimenten gezogen wurden, empfohlen wird.

Abbildung 1, ein repräsentatives Bild eines immunfluoreszierenden Sphäroids, zeigt die Immunfärbung der Integrin-Untereinheit 3 von sowohl verewigten normalen Fibro...

Diskussion

Die Entwicklung eines geeigneten In-vitro-Modells zur Untersuchung der CAF-Differenzierung ist eine schwierige Aufgabe. Nach der Anwendung verschiedener Ansätze kamen wir zu dem Schluss, dass ein 3D-Sphäroidmodell das praktischere, physiologischere und klinisch relevantere Modell ist, bei dem das Zusammenspiel von Pankreaskarzinomzellen mit verewigten CAFs untersucht werden kann. Dieses Modell verhinderte eine spontane Differenzierung von Fibroblasten aufgrund artefakter Stressoren wie Steifigkeit des Zellkulturkunstst...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. Dieses Material spiegelt nur die Ansichten des Autors wider, und die Europäische Union haftet nicht für jegliche Verwendung der darin enthaltenen Informationen.

Danksagungen

Wir würdigen Barbara Scheddings Hilfe bei der Vorbereitung des BM2 und lebein-1. Wir würdigen, dass er ihre Expertise in Sphäroid-Assays geteilt hat. Wir danken Sonja Schelhaas und Michael Schäfers für ihre Hilfe beim Umgang mit lentiviraler Transfektion unter S2-Bedingungen. Wir würdigen Sabine von Rüdens Unterstützung bei der Vorbereitung von CAFs aus Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe.

Die Zu diesem Ergebnis führten Forschungsarbeiten wurden aus dem People-Programm (Marie-Curie-Maßnahmen) des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union RP7/2007-2013/ im Rahmen der REA-Zuschussvereinbarung n. (316610) an J.A.E. finanziert. Darüber hinaus wurden J.A.E. und A.C.M.C. von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Exzellenzclusters Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM) finanziell unterstützt. Dieses Projekt wurde auch von der Wilhelm Sander Stiftung unterstützt (Zuschuss: 2016.113.1 an J.A.E.).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
AcetoneSIGMA-ALDRICH32201
Albumin Fraction V - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-MouseInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) RabbitInvitrogenA11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)Santa Cruzsc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320MilliporeAB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 cell lineATCCKindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifugeFisher Scientific50-589-620Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)Fluka21074
CentrifugeThermo ScientificMultifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mLCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
Collagen-I, rat tailGibcoA10483-01
Confocal microscopeZeissLSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburTM
Gelifying matrixThermoFisher ScientificA1413202Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotypeDAKOX 0907
Horse SerumSIGMA-ALDRICH12449-C
Human Primary Pancreatic FibroblastsPELOBiotechPB-H-6201
IncubatorHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate, 96 wells, U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG, isotypeSIGMA-ALDRICHI8765
Multi axle rotating mixerCATRM5 80V
PANC-IATCCKindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
ParaformaldehydeRiedel-de Haën16005
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205310
Rat IgG, isotypeInvitrogen10700
Reaction tubes, 1.5 mLGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702FAdd glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
VórtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoatedIbidi81501

Referenzen

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