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要約

ここで提示するゼラチンメタクリロイルの3Dバイオプリンティングのための方法である。

要約

ゼラチンメタクリロイル(GelMA)は、バイオプリンティングの分野で人気の生体材料となっています。この物質の導出はゼラチンであり、哺乳動物のコラーゲンから加水分解される。したがって、アルギニン-グリシンアスパラギン酸(RGD)配列およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の標的モチーフは分子鎖上に残り、細胞の付着および分解を達成するのに役立ちます。さらに、ゲルマの形成特性は汎用性が高い。メタクリルアミド基は、光開始剤の存在下で光照射下で物質が急速に架橋することを可能にする。したがって、この有望な材料と三次元(3D)構造を合成するための適切な方法を確立することは非常に理にかなっています。しかし、その低粘度はGelMAの印刷性を制限する。ここで提示するゲルマヒドロゲルの3Dバイオプリンティング、すなわちゲルマ微小球、ゲルマ繊維、ゲルマ錯体構造、およびゲルマベースのマイクロ流体チップの製造を行う方法を示します。得られた材料の構造と生体適合性、ならびに印刷方法について議論する。このプロトコルは、以前に適用された生体材料とGelMAとの間の橋渡し役となり、生物医学用途向けのGelMAベースの3Dアーキテクチャの確立に貢献できると考えられています。

概要

ヒドロゲルは、生体加工1、2、3、4の分野において適した材料であると考えられている。中でも、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)は、最も汎用性の高い生体材料の一つとなっており、当初はヴァンデンブルッケら5によって2000年に提案された。ゲルマは、無水メタルジド(MA)とゼラチンの直接反応によって合成される。哺乳動物コラーゲンによって加水分解されるゼラチンは、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の標的モチーフから構成される。したがって、GelMAによって確立されたインビトロ3次元(3D)組織モデルは、生体内の細胞と細胞外マトリックス(ECM)との相互作用を理想的に模倣することができる。さらに、アルギニン-グリシンアスパラギン酸(RGD)配列は、アルギン酸塩などの他のいくつかのヒドロゲルに存在しないが、GelMAの分子鎖上に残る。これにより、ヒドロゲルネットワーク6内の封入された細胞の付着を実現することができる。さらに、GelMAの形成能力は有望である。GelMA分子鎖上のメタクリルアミド基は、軽度の反応条件下でフォトイエーターと反応し、光照射への曝露時に共有結合を形成する。したがって、印刷された構造を迅速に架橋して、設計された形状を簡単な方法で維持することができます。

これらの特性に基づき、一連の分野ではGelMAを活用して、組織工学、基礎細胞学解析、薬物スクリーニング、バイオセンシングなど、さまざまな用途を行っています。従って、様々な製造戦略も実証されている7、8、9、10、11、12、13、14である。しかし、その根本的な特性に起因するGelMAに基づく3Dバイオプリンティングの実行は依然として困難です。ゲルマは温度に敏感な材料です。印刷プロセス中、バイオインクの物理的状態を維持するために印刷雰囲気の温度を厳密に制御する必要があります。また、GelMAの粘度は、一般に他の一般的なヒドロゲル(すなわち、アルギン酸塩、キトサン、ヒアルロン酸など)よりも低い。しかし、この材料15で3Dアーキテクチャを構築する際に他の障害に直面しています。

本稿では、本研究室が提案するGelMAの3Dバイオプリンティングに対するいくつかのアプローチをまとめ、印刷されたサンプル(すなわち、GelMA微小球、GelMA繊維、GelMA複合構造、およびゲルマベースのマイクロ流体チップの合成)について説明します。各方法には特殊な機能があり、要件の異なる状況で採用できます。GelMAマイクロスフィアは、液滴サイズを縮小するために余分な外部電気力を形成する電気支援モジュールによって生成されます。ゲルマ繊維の面では、それらは粘性アルギン酸ナトリウムの助けを借りて同軸バイオプリンティングノズルによって押し出される。さらに、複雑な3D構造の確立は、デジタル光処理(DLP)バイオプリンターで達成されます。最後に、GelMAハイドロゲルと従来のマイクロ流体チップを組み合わせたGelMAベースのマイクロ流体チップを構築する2回の架橋戦略が提案されています。このプロトコルは、私たちの研究室で使用されるGelMAバイオプリンティング戦略の重要な要約であり、相対的な分野で他の研究者を刺激する可能性があると考えられています.

プロトコル

1. 細胞培養

  1. ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を調製し、10%胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充し、ヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)ラインおよびヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)ラインを培養するために使用される。
  2. L-グルタミン(DMEM/F-12)でDMEMを調製し、10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充し、骨髄間葉系幹細胞(BMSC)ラインの培養に使用する。
  3. 培養環境を37°C、5%CO2に設定します。MDA-MB-231、HUVEC、およびBMSCを培養し、90%の合流に達した場合に1:2の比率で細胞を通過させた。

2. ゲルマ微小球の作製

  1. 融合蒸着モデリング(FDM)プリンタで、ポリ乳酸(PLA)を使用した器具を図1Aとして印刷します。2つの金属リング電極を器具に取り付けします。
  2. 2つの金属リング電極をそれぞれ接地極と正極で接続します。高電圧で接続された金属板をリング電極の下に置き、シリコンオイルを入れたペトリ皿を液滴受信機として金属板に置きます。
  3. ジルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に凍結乾燥ゲルマ(5%w/v)とフェニル-2,4,6,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP,0.5%w/v)をバイオインク(10mL)として溶解する。0.22μmフィルターでバイオインクをフィルター処理し、37°Cの水浴で15分間加熱します。
  4. MDA-MB-231細胞を3mLの3mLで0.25%トリプシン-0.02%EDTA溶液で37°Cで3分間取り外します。15 mL遠心管内の遠心細胞を100xgで5分間5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。
  5. 上清を取り除く。気泡の産生を防ぐためにゆっくりとピペットをして、調製されたバイオインクの1 mLで細胞ペレットを混合します。
  6. バイオインク(MDA-MB-231)を3mL滅菌注射器に1mL入れます。圧縮空気(〜0.5 kPa)の力でバイオインクを供給します。器具の上に注射器を置きます。
    メモ:印刷環境は30°C、湿度50%で厳重に管理する必要があります。
  7. 高電圧電源をオンにし、電圧を0-4 kVに設定します。同時に、405 nm波長光をオンにして、5 mL のシリコンオイルで GelMA 液滴を架橋します。
  8. ペトリ皿をデカントして、シリコンオイルの大部分を注ぎます。残ったシリコンオイルとGelMA微小球をスプーンを使用して15 mL遠心管に移します。
  9. 5 mL の DPBS を追加し、混合物を均一に振ります。チューブを100 x gで5分間遠心分離し、上清液を除去します。
  10. 手順 2.9 3x を繰り返します。
  11. スプーンでGelMA微小球を取り出し、37°Cでペトリ皿でDMEMで培養し、3日間5%CO2を与えます。
  12. 培地を廃棄し、DPBSで微小球を洗浄します。室温(RT)で30分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の2 mLで固定します。
  13. PFAを廃棄し、DPBSで微小球を洗浄します。RTで5分間0.5%の非イオン性界面活性剤(すなわち、Triton X-100)の2mLで透過する。
  14. 非イオン性界面活性剤を廃棄し、DPBSで微小球を洗浄します。RTで暗闇の中で30分間テトラメチルロダミン(TRITC)ファロイジンの2 mLでそれらを染色します。
  15. TRITCを廃棄し、DPBSで微小球を洗浄します。RTで暗闇の中で10分間、4-6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)の2 mLでそれらを染色します。
  16. DAPIを破棄し、DPBSで微小球を洗浄します。共焦点蛍光顕微鏡で形態を捕捉する。

3. ゲルマ繊維の製造

  1. 図 2Aに示すように、同軸ノズルを準備します。内側のノズル(25G、OD = 510 μm、ID = 250 μm)と外側ノズル(18 G、OD = 1200 μm、ID = 900 μm)をはんだ付けで固定します。ガラス管(長さ= 50mm、内径= 1.2mm)を同軸ノズルの端に接続します。
  2. 紫外線(UV)光の下で殺菌したアルギン酸ナトリウム(Na-Alg)粉末を2%(w/v)で脱イオン水で30分間溶解します。
  3. ステップ2.3に続く滅菌バイオインク溶液を調製する。GelMAバイオインクとNa-Alg溶液を37°水浴で15分間加熱します。
  4. 3 mL の 3 mL の BMSCs 細胞を 0.25% トリプシン-0.02% EDTA 溶液で 37 °C で 3 分間取り外します。15 mL遠心管内の遠心細胞を100xgで5分間5分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。
  5. 上清液を取り除く。気泡の産生を防ぐためにゆっくりとピペットをして、調製したGelMAバイオインクの2 mLで細胞ペレットを混合します。
  6. バイオインク(BMSC)を10 mLシリンジに2mL入れます。Na-Alg溶液の2 mLを別のシリンジ(10 mL)に入れます。それぞれ2つのシリンジポンプでそれらを供給します(ここでは、50μm/minのバイオインクと350μm/分のNa-Alg溶液)。
    メモ:印刷環境は30°C、湿度50%で厳重に管理する必要があります。
  7. 405 nm波長の光をオンにして透明なチューブを照射し、GelMAファイバーを架橋します。DPBSと一緒にペトリ皿を使用して繊維を受け取ります。
  8. DPBSからスプーンでゲルマ繊維を取り出し、37°Cおよび5%CO2で調製されたDMEM/F-12で3日間培養します。
  9. 手順2.12-2.16に従って、共焦点蛍光顕微鏡による形態観察用のGelMA繊維を調製します。

4. 複雑な3Dゲルマ構造の製作

注:図 3Aは、複雑な 3D GelMA 構造の製造スケッチを示しています。

  1. DLPバイオプリンター(図3E)を75%アルコールで拭き取り、滅菌のために30分間紫外線照射にさらします。
  2. DPBSで凍結乾燥ゲルマ(10%w/v)とLAP(0.5%w/v)を溶解します。マゼンタの食用顔料を溶液(3%v/v)に添加して、印刷精度を向上させます。
  3. 滅菌のために0.22μmフィルターで溶液をろ過し、37°水浴で15分間加熱します。
  4. コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して3Dモデルを構築します。適用された DLP バイオプリンターの上位ソフトウェア (EFL) にモデル ドキュメントをインポートします。
  5. DLPバイオプリンターのトラフに10mLの調製バイオインクを加えます。
  6. 上部ソフトウェアの印刷パラメータを次のように設定します: 光強度 = 12 mW/cm2、照射時間 = 30 s、スライス高さ = 100 μm。印刷を開始します。
  7. バイオプリンターから印刷された構造を取り出し、DPBSにペトリ皿に浸します。
  8. MDA-MB-231s細胞を3mLの3mLで取り外し、37°Cで3分間、トリプシン-0.02%EDTA溶液を取り外します。15mLチューブで5分間100xgで細胞を遠心分離し、細胞ペレットを得た。
  9. 上清液を取り出し、2mLのDMEMで細胞ペレットを混ぜます。
  10. 印刷された構造物に100μLのセル懸濁液を追加します。37°Cおよび5%CO2で調製されたDMEMで3日間培養する。
  11. 手順2.12-2.16に従って、共焦点蛍光顕微鏡による形態観察のための複雑な3D構造を準備します。

5. ゲルマベースのマイクロ流体チップの製造

メモ:図4Aは、GelMAベースのマイクロ流体チップの製造スケッチを示しています。

  1. DPBSで凍結乾燥ゲルマ10%(w/v)とLAP(0.5%w/v)を溶解します。0.22μmフィルターでGelMA溶液をフィルター処理し、滅菌性を求めます。
  2. 紫外線下でゼラチン粉末を30分間殺菌し、ステップ5.1で調製したGelMA-LAP溶液に5%(w/v)のゼラチンの最終濃度に添加します。37°水浴で15分間加熱します。
  3. CADソフトウェアで金型のグループ(図4B,C)を設計し、DLPプリンタでフォトポリマー樹脂で製造します。
  4. 準備したバイオインクで金型を完全に充填します。
  5. 4°Cの冷蔵庫に金型を入れ、ゼラチンを30分間架橋します。
  6. 金型から部分的に(物理的に)架橋されたヒドロゲルシートをブレードでデモルドします。
  7. 2枚のデムールドヒドロゲルシートを組み合わせ、405 nmで1分間照射することでGelMAの助けを借りて結合します。
  8. 3 mL の 3 mL の HUVEC セルを 0.25% トリプシン-0.02% EDTA 溶液で 37 °C で 3 分間取り外します。15mL遠心管中の遠心細胞を5分間100xgで細胞ペレットを得た。
  9. 上清液を取り出し、2mLのDMEMで細胞ペレットを混ぜます。
  10. ノズルとシリンジでセルサスペンションを注入してマイクロチャンネルを完全に充填します。
  11. 次の3時間ごとにチップを逆さまにして、均一で完全な細胞播種を実現します。37°Cおよび5%CO2で調製されたDMEMで3日間ペトリ皿のチップを培養する。
  12. 手順2.12-2.16に従って、共焦点蛍光顕微鏡による形態観察用マイクロ流体チップを準備します。

結果

GelMA微小球の製造中に、GelMA液滴は外部電界力によって分離された。液滴が受け入れシリコンオイルに落ちたとき、彼らは尾のない標準的な回転楕円体形状のままでした。これは、GelMA液滴が水相にあったのに対し、シリコンオイルは油相にあったためです。2つの相の間に形成された表面張力は、GelMA液滴が標準的な回転楕円体形状を維持する原因となった。細胞を積んだ微小球に関しては、?...

ディスカッション

この記事では、GelMA 3D構造、すなわちGelMAマイクロスフィア、GelMA繊維、GelMA複合構造、およびGelMAベースのマイクロ流体チップを製造するためのいくつかの戦略について説明します。GelMAは有望な生体適合性および形成能力を有し、生物加工の分野で広く使用されている。微小球構造は、制御薬物放出、組織培養、およびさらなる治療のための生物への注入に適している21、22、23、24、25。

開示事項

著者たちは何も開示する必要はない。

謝辞

この作品は、中国国家主要研究開発プログラム(2018YFA0703000)、中国国立自然科学財団(No.U1609207、81827804)、国立自然科学創造研究グループ科学基金が主催しました。中国の財団(第51821093)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filter membraneMillipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinterSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength lightSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzleSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscopeOLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinterSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printerSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL SoftwareSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatinSigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage powerSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehydeTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycinTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidinYeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China

参考文献

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