Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Resumo

Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.

Resumo

Gelatina methacriloyl (GelMA) tornou-se um biomaterial popular no campo da bioimpressão. A derivação deste material é a gelatina, que é hidrolisada do colágeno mamífero. Assim, as sequências de ácido arginina-glicina-aspartic (DRg) e motivos-alvo da metaloproteinase matriz (MMP) permanecem nas cadeias moleculares, que ajudam a alcançar o apego e degradação celular. Além disso, as propriedades de formação da GelMA são versáteis. Os grupos de metionlamia permitem que um material se torne rapidamente cruzado irradiação leve na presença de um fotoiniciador. Portanto, faz muito sentido estabelecer métodos adequados para sintetizar estruturas tridimensionais (3D) com este material promissor. No entanto, sua baixa viscosidade restringe a capacidade de impressão da GelMA. Aqui são apresentados métodos para realizar bioimpressão 3D de hidrogéis GelMA, ou seja, a fabricação de microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas GelMA e chips microfluídicos à base de GelMA. As estruturas resultantes e a biocompatibilidade dos materiais, bem como os métodos de impressão, são discutidas. Acredita-se que este protocolo pode servir como uma ponte entre biomateriais previamente aplicados e GelMA, bem como contribuir para a criação de arquiteturas 3D baseadas em GelMA para aplicações biomédicas.

Introdução

Acredita-se que os hidrogéis sejam um material adequado no campo da biofabricação^1,2,3,4. Entre eles, a gelatina methacriloyl (GelMA) tornou-se um dos biomateriais mais versáteis, inicialmente proposto s em 2000 por Van Den Bulcke et al.⁵. GelMA é sintetizado pela reação direta da gelatina com anidrido glicílico (MA). A gelatina, que é hidrolisada pelo colágeno mamífero, é composta por motivos-alvo da matriz metaloproteinase (MMP). Assim, os modelos de tecidos tridimensionais in vitro (3D) estabelecidos pela GelMA podem idealmente imitar as interações entre células e matriz extracelular (ECM) in vivo. Além disso, as sequências de ácido arginina-glicina-aspartic (DRg), que estão ausentes em alguns outros hidrogéis, como alginatos, permanecem nas cadeias moleculares do GelMA. Isso torna possível perceber o anexo de células encapsuladas dentro das redes de hidrogel^6. Além disso, a capacidade de formação da GelMA é promissora. Os grupos de metionlamia nas cadeias moleculares GelMA reagem com o fotoiniciador condições de reação leve e formam laços covalentes após a exposição à irradiação luminosa. Portanto, as estruturas impressas podem ser rapidamente cruzadas para manter as formas projetadas de uma maneira simples.

Com base nessas propriedades, uma série de campos utiliza o GelMA para realizar várias aplicações, como engenharia de tecidos, análise básica de citologia, triagem de medicamentos e biosensoriamento. Assim, várias estratégias de fabricação também foram demonstradas^{7,8,9,10,11,12,13,14.} No entanto, ainda é um desafio realizar bioimpressão 3D com base no GelMA, que se deve às suas propriedades fundamentais. GelMA é um material sensível à temperatura. Durante o processo de impressão, a temperatura da atmosfera de impressão tem que ser estritamente controlada, a fim de manter o estado físico do bioink. Além disso, a viscosidade do GelMA é geralmente menor do que outros hidrogéis comuns (ou seja, alginato, quitosana, ácido hialurônico, etc.). No entanto, outros obstáculos são enfrentados ao construir arquiteturas 3D com este material¹⁵.

Este artigo resume várias abordagens para a bioimpressão 3D de GelMA proposta pelo nosso laboratório e descreve as amostras impressas (ou seja, a síntese de microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas gelma e chips microfluidos à base de GelMA). Cada método tem funções especializadas e pode ser adotado em diferentes situações com diferentes requisitos. As microesferas GelMA são geradas por um módulo eletroassistido, que forma força elétrica externa extra para diminuir o tamanho das gotículas. Em termos de fibras GelMA, elas são extrucadas por um bico de bioimpressão coaxial com a ajuda de alginato de sódio viscoso. Além disso, o estabelecimento de estruturas 3D complexas é alcançado com um bioprinter de processamento de luz digital (DLP). Finalmente, propõe-se uma estratégia de cruzamento duas vezes para construir chips microfluídicos à base de GelMA, combinando hidrogel GelMA e chips microfluídicos tradicionais. Acredita-se que este protocolo é um resumo significativo das estratégias de bioimpressão GelMA usadas em nosso laboratório e pode inspirar outros pesquisadores em campos relativos.

Protocolo

1. Cultivo de células

1. Prepare o meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina, usado para cultura de células de câncer de mama humana (MDA-MB-231) e linhas de célula endotelial de veia umbilical humana (HUVEC).
2. Prepare o DMEM com l-glutamina (DMEM/F-12), complementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina, usado para cultura de células-tronco mesenquimais de medula óssea (BMSC).
3. Defina o ambiente de cultivo como 37 °C e 5% DE CO_2. Cultura MDA-MB-231, HUVEC e BMSC, e passar as células em uma proporção de 1:2 quando 90% de confluência é atingido.

2. Fabricação de microesferas GelMA

1. Imprima o dispositivo elétrico como a figura 1A com ácido poliláctico (PLA) em uma impressora fundida da modelagem da deposição (FDM). Coloque dois eletrodos de anel de metal no dispositivo elétrico.
2. Conecte os dois eletrodos de anel de metal com solo e postes positivos, respectivamente. Coloque a placa de metal conectada com a alta tensão abaixo do eletrodo anel e coloque uma placa de Petri com óleo de silício na placa de metal como um receptor de gotículas.
3. Dissolva gelma liofilizado (5% w/v) e fenil de lítio-2,4,6-trimetilbenzoylphosphinate (LAP, 0,5% w/v) na soro fisiola tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) como o bioink (10 mL). Filtre o bioink através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade e aqueça-o em um banho de água de 37 °C por 15 min.
4. Desagre as células MDA-MB-231 com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL a 100 x g por 5 min para obter uma pelota celular.
5. Retire o supernatant. Misture a pelota de célula com 1 mL de bioink preparado lentamente tubulação-lo para evitar a produção de bolhas.
6. Coloque 1 mL de bioink (MDA-MB-231) em uma seringa estéril de 3 mL. Alimente o bioink pela força do ar comprimido (~0.5 kPa). Coloque a seringa no dispositivo elétrico.
   NOTA: O ambiente de impressão deve ser estritamente controlado a uma temperatura de 30 °C e umidade de 50%.
7. Ligue a potência de alta tensão e definir a tensão como 0-4 kV. Simultaneamente, ligue a luz de comprimento de onda de 405 nm para cruzar as gotículas GelMA em 5 mL de óleo de silício.
8. Despeje a maior parte do óleo de silício de distância, decantando a placa de Petri. Transfira o óleo de silício restante e as microesferas GelMA para um tubo centrífuga de 15 mL usando uma colher.
9. Adicione 5 mL de DPBS e agite a mistura uniformemente. Centrífuga do tubo a 100 x g por 5 min e remover o fluido supernatant.
10. Repita o passo 2.9 3x.
11. Retire as microesferas GelMA com uma colher e cultirá-las em DMEM em uma placa de Petri a 37 °C e 5% CO₂ por 3 dias.
12. Descarte o meio e lave as microesferas com DPBS. Correção com 2 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) para 30 min à temperatura ambiente (RT).
13. Descarte a PFA e lave as microesferas com DPBS. Permeabilize com 2 mL de 0,5% surfactante nonionic (ou seja, Triton X-100) por 5 min na RT.
14. Descarte o surfactante nonionic e lave as microesferas com DPBS. Manchá-los com 2 mL de tetrametilrhodamina (TRITC) faloide por 30 min na escuridão em RT.
15. Descarte o TRITC e lave as microesferas com DPBS. Manchá-los com 2 mL de 4-,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 10 min na escuridão em RT.
16. Descarte o DAPI e lave as microesferas com DPBS. Capture a morfologia com um microscópio de fluorescência confocal.

3. Fabricação de fibras GelMA

1. Prepare um bico coaxial como mostrado na Figura 2A. Corrija um bico interno (25 G, OD = 510 μm, ID = 250 μm) e bico exterior (18 G, OD = 1200 μm, ID = 900 μm) com solda. Ligue um tubo de vidro (comprimento = 50 mm, diâmetro interno = 1,2 mm) até o final do bico coaxial.
2. Dissolva o pó de alginato de sódio (Na-Alg) que é esterilizado luz ultravioleta (UV) por 30 min em água deionizada a 2% (w/v).
3. Prepare uma solução de bioink estéril após o passo 2.3. Aqueça a solução GelMA bioink e Na-Alg em um banho de água de 37 °C por 15 min.
4. Desaparado bmscs células com 3 mL de 0,25% trypsin-0,02% solução EDTA para 3 min em 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL a 100 x g por 5 min para obter uma pelota celular.
5. Retire o fluido supernatant. Misture a pelota celular com 2 mL de bioink GelMA preparado lentamente por tubulação lentamente-lo para evitar a produção de bolhas.
6. Coloque 2 mL de bioink (BMSCs) em uma seringa de 10 mL. Coloque 2 mL de solução Na-Alg em outra seringa (10 mL). Alimente-os com duas bombas de seringa, respectivamente (aqui, bioink em 50 μm/min e solução Na-Alg em 350 μm/min).
   NOTA: O ambiente de impressão deve ser estritamente controlado a uma temperatura de 30 °C e umidade de 50%.
7. Ligue a luz de comprimento de onda de 405 nm para irradiar o tubo transparente para cruzar as fibras GelMA. Use uma placa de Petri com DPBS para receber as fibras.
8. Retire as fibras GelMA com uma colher de DPBS e cultizá-los por 3 dias no DMEM preparado / F-12 em 37 ° C e 5% CO₂.
9. Siga os passos 2.12-2.16 para preparar as fibras GelMA para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.

4. Fabricação de estruturas complexas de GelMA 3D

NOTA: Figura 3A mostra o esboço de fabricação das estruturas complexas gelma 3D.

1. Limpe o bioprinter DLP(Figura 3E)com 75% de álcool e expô-lo à irradiação UV por 30 min para esterilidade.
2. Dissolva o GelMA liofilizado (10% w/v) e LAP (0,5% w/v) na DPBS. Adicione pigmento comestível magenta na solução (3% v/v) para melhorar a precisão da impressão.
3. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade e aqueça-o em um banho de água de 37 °C por 15 min.
4. Construa os modelos 3D com software de design (CAD) auxiliado por computador. Importe os documentos do modelo para o software superior (EFL) do bioprinter DLP aplicado.
5. Adicione 10 mL de bioink preparado na calha do bioprinter dlp.
6. Defina os parâmetros de impressão no software superior da seguinte forma: intensidade de luz = 12 mW/cm^2,duração da irradiação = 30 s, e altura da fatia = 100 μm. Comece a imprimir.
7. Retire a estrutura impressa do bioprinter e mergulhe-a em DPBS em uma placa de Petri.
8. Desaque as células MDA-MB-231 com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas a 100 x g por 5 min em um tubo de 15 mL para obter uma pelota celular.
9. Retire o fluido supernatant e misture a pelota celular com 2 mL de DMEM.
10. Adicione 100 μL de suspensão celular nas estruturas impressas. Cultiuiná-los por 3 dias no DMEM preparado em 37 °C e 5% CO₂.
11. Siga os passos 2.12-2.16 para preparar as complexas estruturas 3D para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.

5. Fabricação de chips microfluídicos à base de GelMA

NOTA: Figura 4A mostra o esboço de fabricação do chip microfluídico baseado em GelMA.

1. Dissolva o GelMA liofilizado 10% (w/v) e LAP (0,5% w/v) em DPBS. Filtre a solução GelMA através de um filtro de 0,22 μm para esterilidade.
2. Esterilizar o pó de gelatina luz UV por 30 min e adicioná-lo à solução GelMA-LAP preparado no passo 5.1 para uma concentração final de gelatina de 5% (w/v). Aqueça a mistura em um banho de água de 37 °C por 15 min.
3. Projete um grupo de moldes(Figura 4B,C)com software CAD e fabrice-os com resina de fotopolímero em uma impressora DLP.
4. Preencha os moldes totalmente com o bioink preparado.
5. Coloque os moldes em um refrigerador de 4 °C para cruzar a gelatina por 30 min.
6. Retire os moldes e demoldo com uma lâmina parcialmente (fisicamente) cruzadas folhas de hidrogel dos moldes.
7. Combine as duas folhas de hidrogel demoldadas e vincule-as com a ajuda da GelMA irradiando a 405 nm por 1 min.
8. Desaque as células HUVECs com 3 mL de 0,25% de solução EDTA de 0,02% para 3 min a 37 °C. Células centrífugas em um tubo centrífuga de 15 mL para obter uma pelota celular a 100 x g por 5 min.
9. Retire o fluido supernatant e misture a pelota celular com 2 mL de DMEM.
10. Encha o microcanal totalmente injetando a suspensão celular com um bico e seringa.
11. Vire o chip de cabeça para baixo a cada 15 min durante os próximos 3 h para alcançar a semeadura de células uniforme e completa. Cultura as batatas fritas na placa de Petri por 3 dias no DMEM preparado em 37 °C e 5% CO₂.
12. Siga os passos 2.12-2.16 para preparar os chips microfluídicos para observação morfológica com microscópio de fluorescência confocal.

Resultados

Durante a fabricação das microesferas GelMA, as gotículas GelMA foram separadas pela força externa do campo elétrico. Quando as gotículas caíram no óleo de silício receptor, eles permaneceram forma esferóide padrão sem caudas. Isso ocorre porque as gotículas GelMA estavam em uma fase aquosa, enquanto o óleo de silício estava em uma fase de petróleo. A tensão superficial que se formou entre as duas fases fez com que as gotículas GelMA mantivessem uma forma esferóide padrão. Em termos de microesferas car...

Discussão

Este artigo descreve várias estratégias para fabricar estruturas 3D GelMA, ou seja, microesferas GelMA, fibras GelMA, estruturas complexas GelMA e chips microfluídicos à base de GelMA. A GelMA tem capacidade promissora de biocompatibilidade e formação e é amplamente utilizada no campo da biofabricação. As estruturas da microsfera são adequadas para liberação controlada de medicamentos, cultivo de tecidos e injeção em organismos para terapia adicional^21,22...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter membrane	Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope	OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100	Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China