JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен метод 3D-биопечати желатина метакрилоила.

Аннотация

Гелатин метакрилоил (GelMA) стал популярным биоматериалом в области биопечати. Производным этим материалом является желатин, который гидролизмовается из коллагена млекопитающих. Таким образом, аргинин-глицин-аспарговая кислота (РГД) последовательности и целевые мотивы матричной металлопротеинаазы (ММП) остаются на молекулярных цепях, которые помогают достичь клеточной привязанности и деградации. Кроме того, свойства формирования GelMA являются универсальными. Группы метакриламида позволяют материалу быстро пересекаться под световым облучением в присутствии фотоинитиатора. Поэтому имеет смысл создать подходящие методы синтеза трехмерных (3D) структур с помощью этого перспективного материала. Однако его низкая вязкость ограничивает доступность GelMA. Здесь представлены методы проведения 3D-биопечати гидрогелей GelMA, а именно изготовление микросфер GelMA, волокон GelMA, сложных структур GelMA и микрофлюидных микрочипов на основе GelMA. Обсуждаются полученные структуры и биосовместимость материалов, а также методы печати. Считается, что этот протокол может служить мостом между ранее примененными биоматериалами и GelMA, а также способствовать созданию 3D-архитектурна на основе GelMA для биомедицинских приложений.

Введение

Гидрогели считаются подходящим материалом в области биофабрикации1,2,3,4. Среди них желатин метакрилоил (GelMA) стал одним из самых универсальных биоматериалов, первоначально предложенных в 2000 году Ван Ден Омке и др.5. ГельМА синтезируется непосредственной реакцией желатина с метакрилическим ангидридом (МА). Желатин, гидролизуемый коллагеном млекопитающих, состоит из целевых мотивов матричной металлопротеинаазы (ММП). Таким образом, трехмерные (3D) модели тканей In vitro, созданные GelMA, могут идеально имитировать взаимодействие между клетками и внеклеточной матрицей (ECM) in vivo. Кроме того, аргинин-глицин-аспарговая кислота (РГД) последовательности, которые отсутствуют в некоторых других гидрогелей, таких как альгинаты, остаются на молекулярных цепях GelMA. Это позволяет реализовать вложение инкапсулированных ячеек внутри гидрогелевыхсетей 6. Кроме того, возможности формирования GelMA является перспективным. Группы метакриламида на молекулярных цепях GelMA реагируют с фотоинитиатором в мягких условиях реакции и образуют ковалентные связи при воздействии облучения света. Таким образом, печатные структуры могут быть быстро перекрестные для поддержания разработанных форм простым способом.

Основываясь на этих свойствах, ряд областей используют GelMA для выполнения различных применений, таких как тканевая инженерия, основной анализ цитологии, скрининг наркотиков и биосенсирование. Соответственно, различные стратегии изготовления также были продемонстрирована7,8,9,10,11,12,13,14. Тем не менее, это все еще сложно провести 3D биопечать на основе GelMA, которая из-за его фундаментальных свойств. GelMA является чувствительным к температуре материалом. В процессе печати, температура атмосферы печати должна быть строго контролируется для того, чтобы поддерживать физическое состояние биоинки. Кроме того, вязкость GelMA, как правило, ниже, чем другие распространенные гидрогели (наоборот, альгинат, хитозан, гиалуроновая кислота и т.д.). Тем не менее, другие препятствия сталкиваются при строительстве 3D архитектуры с этим материалом15.

В этой статье кратко излагается несколько подходов к 3D-биопечати GelMA, предложенных нашей лабораторией, и описаны печатные образцы (т.е. синтез микросфер GelMA, волокон GelMA, сложных структур GelMA и микрофлюидных микрочипов на основе GelMA). Каждый метод имеет специализированные функции и может быть принят в различных ситуациях с различными требованиями. Микросферы GelMA генерируются электроусилитом модулем, который формирует дополнительную внешнюю электрическую силу для сокращения размера капли. С точки зрения волокон GelMA, они выдавливаются коаксиальным сопло биопечати с помощью вязких альгината натрия. Кроме того, создание сложных 3D-структур достигается с помощью биопринтера цифровой обработки света (DLP). Наконец, предлагается стратегия дважды перекрестных ссылок на создание микрофлюидных микрочипов на основе GelMA, сочетающих гидрогель GelMA и традиционные микрофлюидные чипы. Считается, что этот протокол представляет собой значительное резюме стратегий биопечати GelMA, используемых в нашей лаборатории, и может вдохновить других исследователей в относительной области.

протокол

1. Культивирование клеток

  1. Подготовьте модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM), дополненную 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином, используемой для культуры клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-231) и линиями эндотелиальной клеток молочной железы человека .
  2. Подготовка DMEM с L-глютамина (DMEM/ F-12), дополненный 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина, используется для культуры костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (BMSC) линий.
  3. Установите культивирование среды как 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Культура MDA-MB-231, HUVEC и BMSC, и прохождение клеток в соотношении 1:2, когда 90% слияния достигается.

2. Изготовление микросфер GelMA

  1. Печать светильника в виде рисунка 1А с полилактической кислотой (PLA) на сросшом моделировании осаждения (FDM). Поместите два металлических электрода кольца в прибор.
  2. Соедините два металлических кольца электродов с землей и положительными полюсами, соответственно. Поместите металлическую пластину, связанную с высоким напряжением ниже электрода кольца, и поместите чашку Петри с силиконовым маслом на металлическую пластину в качестве капельного приемника.
  3. Растворите лиофилизированный ГельМА (5% ж/v) и финил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP, 0,5% w/v) в фосфатно-буферизированном солине Дульбекко (DPBS) в качестве биоинка (10 мл). Фильтр биочернила через фильтр 0,22 мкм для стерильности и нагреть его в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут.
  4. Отсоединить клетки MDA-MB-231 с 3 мл 0,25% трипсин-0,02% EDTA раствор в течение 3 мин при 37 градусах Цельсия. Центрифуги клетки в 15 мл центробежной трубки на 100 х г в течение 5 минут, чтобы получить клетку гранулы.
  5. Удалите супернатант. Смешайте клеточные гранулы с 1 мл подготовленного биочернила, медленно пайпетируя его, чтобы предотвратить производство пузырьков.
  6. Поместите 1 мл биочернила (MDA-MB-231) в стерильный шприц 3 мл. Кормите биоинк силой сжатого воздуха (0,5 кПа). Положите шприц на светильник.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда печати должна строго контролироваться при температуре 30 градусов по Цельсию и влажности 50%.
  7. Включите высокую мощность напряжения и установите напряжение как 0'4 кВ. Одновременно включите свет длиной волны 405 нм, чтобы перекрестно переключать капли GelMA в 5 мл кремниевого масла.
  8. Налейте большую часть кремниевого масла прочь, декантируя чашку Петри. Перенесите оставшиеся кремниевые масла и микросферы GelMA в центробежную трубку 15 мл с помощью ложки.
  9. Добавить 5 мл DPBS и встряхнуть смесь равномерно. Centrifuge трубки на 100 х г в течение 5 мин и удалить супернатант жидкости.
  10. Повторите шаг 2.9 3x.
  11. Вынизвините микросферы GelMA ложкой и культивируете их в DMEM в чашке Петри при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 в течение 3 дней.
  12. Откажитесь от среды и промойте микросферы с помощью DPBS. Исправить с 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
  13. Откажитесь от PFA и промойте микросферы с помощью DPBS. Пермяки с 2 мл 0,5% неионический сурфактант (т.е. Тритон X-100) в течение 5 мин на RT.
  14. Откажитесь от неионического сурфактанта и промойте микросферы с помощью DPBS. Пятно их с 2 мл тетраметилродамина (TRITC) фаллоидина в течение 30 минут в темноте на RT.
  15. Откажитесь от TRITC и промойте микросферы с помощью DPBS. Пятно их с 2 мл 4-,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в течение 10 минут в темноте на RT.
  16. Откажитесь от DAPI и промойте микросферы с помощью DPBS. Захват морфологии с конфокальной флуоресценции микроскопом.

3. Изготовление волокон GelMA

  1. Подготовка коаксиального сопла, как показано на рисунке 2A. Исправьте внутреннее сопло (25 G, OD 510 мкм, ID - 250 мкм) и внешнюю сопло (18 Г, ОД - 1200 мкм, ID - 900 мкм) с пайкой. Подключите стеклянную трубку (длина 50 мм, внутренний диаметр 1,2 мм) к концу коаксиального сопла.
  2. Растворите порошок альгината натрия (Na-Alg), стерилизованный под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 30 мин в деионизированной воде при 2% (w/v).
  3. Подготовьте стерильный раствор биочернила после шага 2.3. Нагрейте раствор GelMA биоинки и Na-Alg на водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
  4. Отсоединить клетки BMSCs с 3 мл 0,25% трипсин-0,02% EDTA раствор в течение 3 мин при 37 градусов по Цельсию. Центрифуги клетки в 15 мл центробежной трубки на 100 х г в течение 5 минут, чтобы получить клетку гранулы.
  5. Удалите сверхнатантную жидкость. Смешайте клеточные гранулы с 2 мл подготовленного биоинки GelMA, медленно пайпетируя его, чтобы предотвратить производство пузырьков.
  6. Поместите 2 мл биочернила (BMSCs) в шприц 10 мл. Поместите 2 мл раствора Na-Alg в другой шприц (10 мл). Кормите их двумя шприц насосами, соответственно (здесь, биоинк на 50 мкм/мин и Na-Alg раствор на 350 мкм/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда печати должна строго контролироваться при температуре 30 градусов по Цельсию и влажности 50%.
  7. Включите 405 нм длина волны света, чтобы облучить прозрачную трубку, чтобы перекрестные волокна GelMA. Используйте чашку Петри с DPBS для получения волокон.
  8. Вынизвините волокна GelMA ложкой из DPBS и культивируете их в течение 3 дней в подготовленном DMEM/F-12 в 37 градусах и 5% CO2.
  9. Выполните шаги 2.12–2.16, чтобы подготовить волокна GelMA к морфологическим наблюдениям с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.

4. Изготовление сложных 3D-структур GelMA

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3А показан эскиз изготовления сложных 3D-структур GelMA.

  1. Протрите биопринтер DLP(Рисунок 3E) с 75% алкоголя и подвергать его УФ облучение в течение 30 минут для бесплодия.
  2. Растворите лиофилизированный GelMA (10% w/v) и LAP (0.5% w/v) в DPBS. Добавьте в раствор пурпурный съедобный пигмент (3% v/v), чтобы повысить точность печати.
  3. Фильтр раствора через фильтр 0,22 мкм для стерильности и нагреть его в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 15 минут.
  4. Создавайте 3D-модели с помощью программного обеспечения с помощью компьютера (CAD). Импорт ировать типовые документы в верхнее программное обеспечение (EFL) прикладного биопринтера DLP.
  5. Добавьте 10 мл приготовленного биочернила в корыто биопринтера DLP.
  6. Установите параметры печати в верхнем программном обеспечении следующим образом: интенсивность света - 12 мВт/см2,длительность облучения - 30 с, высота среза - 100 мкм. Начать печать.
  7. Удалите печатную структуру из биопринтера и погрузите ее в DPBS в чашку Петри.
  8. Отсоедините клетки MDA-MB-231s с 3 мл 0,25% трипсин-0,02% EDTA раствор в течение 3 мин при 37 градусов по Цельсию. Клетки центрифуги при 100 х г в течение 5 мин в трубке 15 мл для получения клеточной гранулы.
  9. Удалите супернатантную жидкость и смешайте клеточные гранулы с 2 мл DMEM.
  10. Добавьте 100 зляц суспензии на печатные структуры. Культура их в течение 3 дней в подготовленных DMEM на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  11. Выполните шаги 2.12–2.16, чтобы подготовить сложные 3D структуры для морфологического наблюдения с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.

5. Изготовление микрофлюидных микрочипов на основе GelMA

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 4А показан эскиз изготовления микрофлюидного чипа на основе GelMA.

  1. Растворите лиофилизированный ГельМА 10% (w/v) и LAP (0.5% w/v) в DPBS. Фильтр гельма раствор через 0,22 мкм фильтр для бесплодия.
  2. Стерилизировать порошок желатина под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут и добавьте его в раствор GelMA-LAP, подготовленный в шаге 5.1 до конечной концентрации желатина 5% (w/v). Нагрейте смесь на водяной бане 37 градусов в течение 15 минут.
  3. Дизайн группы форм(Рисунок 4B, C) с программным обеспечением CAD и производить их с фотополимерной мелисой на принтере DLP.
  4. Заполните формы полностью с готовым биочернила.
  5. Положите формы в холодильник 4 кВ, чтобы перекрестные желатин в течение 30 минут.
  6. Удалите формы и demold с лезвием частично (физически) перекрестные листы гидрогеля из форм.
  7. Объедините два демольдедных листа гидрогеля и свяжете их с помощью GelMA, облучая на уровне 405 нм в течение 1 мин.
  8. Отсоедините клетки HUVECs с 3 мл 0,25% трипсин-0,02% EDTA раствор в течение 3 мин при 37 градусов по Цельсию. Центрифуги клетки в 15 мл центробежной трубки для получения клеточной гранулы на 100 х г в течение 5 минут.
  9. Удалите супернатантную жидкость и смешайте клеточные гранулы с 2 мл DMEM.
  10. Заполните микроканал полностью путем введения клеточной подвески с соплом и шприцем.
  11. Переверните чип с ног на голову каждые 15 минут в течение следующих 3 ч для достижения равномерного и полного посева клеток. Культура чипсы в чашке Петри в течение 3 дней в подготовленных DMEM на 37 градусов по Цельсию и 5% CO2.
  12. Выполните шаги 2.12–2.16, чтобы подготовить микрофлюидные чипы для морфологического наблюдения с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Во время изготовления микросфер GelMA капли GelMA были отделены внешними силами электрического поля. Когда капли попали в приемное кремниевое масло, они оставались стандартной сфероидной формой без хвостов. Это потому, что капли GelMA были в вавной фазе, в то время как кремниевое масло было в ф...

Обсуждение

В этой статье описано несколько стратегий изготовления 3D-структур GelMA, а именно микросферы GelMA, волокна GelMA, сложные структуры GelMA и микрофлюидные микрочипы на основе GelMA. GelMA обладает многообещающей биосовместимостью и способностью к образованию и широко используется в области биофабри...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была организована Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0703000), Национальным фондом естественных наук Китая (No.U1609207, 81827804), Научным фондом творческих исследовательских групп Национальной естественной науки Фонд Китая (No 51821093).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm filter membraneMillipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinterSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength lightSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzleSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscopeOLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinterSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printerSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL SoftwareSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatinSigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage powerSuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehydeTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycinTangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidinYeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China

Ссылки

  1. Ahmed, E. M. Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review. Journal of Advanced Research. 6 (2), 105-121 (2015).
  2. Ashton, R. S., Banerjee, A., Punyani, S., Schaffer, D. V., Kane, R. S. Scaffolds based on degradable alginate hydrogels and poly(lactide-co-glycolide) microspheres for stem cell culture. Biomaterials. 28 (36), 5518-5525 (2007).
  3. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
  4. Saroia, J., et al. A review on biocompatibility nature of hydrogels with 3D printing techniques, tissue engineering application and its future prospective. Bio-Design and Manufacturing. 1 (4), 265-279 (2018).
  5. Van Den Bulcke, A. I., et al. Structural and Rheological Properties of Methacrylamide Modified Gelatin Hydrogels. Biomacromolecules. 1 (1), 31-38 (2000).
  6. Sun, M., et al. Synthesis and Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels and Their Recent Applications in Load-Bearing Tissue. Polymers. 10 (11), 1290 (2018).
  7. Gao, Q., et al. 3D printing of complex GelMA-based scaffolds with nanoclay. Biofabrication. 11 (3), 035006 (2019).
  8. Hassanzadeh, P., et al. Ultrastrong and flexible hybrid hydrogels based on solution self-assembly of chitin nanofibers in gelatin methacryloyl (GelMA). Journal of Materials Chemistry B. 4 (15), 2539-2543 (2016).
  9. McBeth, C., et al. 3D bioprinting of GelMA scaffolds triggers mineral deposition by primary human osteoblasts. Biofabrication. 9 (1), 015009 (2017).
  10. Nie, J., et al. Vessel-on-a-chip with Hydrogel-based Microfluidics. Small. 14 (45), 1802368 (2018).
  11. Shao, L., et al. Bioprinting of Cell-Laden Microfiber: Can It Become a Standard Product. Advanced Healthcare Materials. 8 (9), 1900014 (2019).
  12. Shao, L., et al. Fiber-Based Mini Tissue with Morphology-Controllable GelMA Microfibers. Small. 14 (44), 1802187 (2018).
  13. Xie, M., et al. Electro-Assisted Bioprinting of Low-Concentration GelMA Microdroplets. Small. 15 (4), 1804216 (2019).
  14. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  15. Schuurman, W., et al. Gelatin-Methacrylamide Hydrogels as Potential Biomaterials for Fabrication of Tissue-Engineered Cartilage Constructs. Macromolecular Bioscience. 13 (5), 551-561 (2013).
  16. Barbot, A., Decanini, D., Hwang, G. On-chip Microfluidic Multimodal Swimmer toward 3D Navigation. Scientific Reports. 6, 19041 (2016).
  17. Esmaeilsabzali, H., et al. An integrated microfluidic chip for immunomagnetic detection and isolation of rare prostate cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 18 (1), 22 (2016).
  18. Lee, J. M., Zhang, M., Yeong, W. Y. Characterization and evaluation of 3D printed microfluidic chip for cell processing. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), 5 (2016).
  19. Picot, J., et al. A biomimetic microfluidic chip to study the circulation and mechanical retention of red blood cells in the spleen. American Journal of Hematology. 90 (4), 339-345 (2015).
  20. Ren, K., Zhou, J., Wu, H. Materials for Microfluidic Chip Fabrication. Accounts of Chemical Research. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  21. Chen, H., et al. Covalently antibacterial alginate-chitosan hydrogel dressing integrated gelatin microspheres containing tetracycline hydrochloride for wound healing. Materials Science and Engineering: C. 70, 287-295 (2017).
  22. Fan, M., et al. Covalent and injectable chitosan-chondroitin sulfate hydrogels embedded with chitosan microspheres for drug delivery and tissue engineering. Materials Science and Engineering: C. 71, 67-74 (2017).
  23. Feng, J., et al. Preparation of black-pearl reduced graphene oxide-sodium alginate hydrogel microspheres for adsorbing organic pollutants. Journal of Colloid and Interface Science. 508, 387-395 (2017).
  24. Park, K. S., Kim, C., Nam, J. O., Kang, S. M., Lee, C. S. Synthesis and characterization of thermosensitive gelatin hydrogel microspheres in a microfluidic system. Macromolecular Research. 24 (6), 529-536 (2016).
  25. Zheng, Y., et al. Injectable Hydrogel-Microsphere Construct with Sequential Degradation for Locally Synergistic Chemotherapy. ACS Applied Materials, Interfaces. 9 (4), 3487-3496 (2017).
  26. Fernández de la Mora, J. The Fluid Dynamics of Taylor Cones. Annual Review of Fluid Mechanics. 39 (1), 217-243 (2006).
  27. Hsiao, A. Y., et al. Smooth muscle-like tissue constructs with circumferentially oriented cells formed by the cell fiber technology. PLoS ONE. 10, 0119010 (2015).
  28. Meng, Z. J., et al. Microfluidic generation of hollow Ca-alginate microfibers. Lab on a Chip. 16 (14), 2673-2681 (2016).
  29. Peng, L., Liu, Y., Gong, J., Zhang, K., Ma, J. Continuous fabrication of multi-stimuli responsive graphene oxide composite hydrogel fibres by microfluidics. RSC Advances. 7 (31), 19243-19249 (2017).
  30. Sugimoto, M., et al. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  31. Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
  32. Gao, G., et al. Tissue engineered bio-blood-vessels constructed using a tissue-specific bioink and 3D coaxial cell printing technique: a novel therapy for ischemic disease. Advanced Functional Materials. 27 (33), 1700798 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1543DGelMADLP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены