Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Zusammenfassung

Gelatine Methacryloyl (GelMA) hat sich zu einem beliebten Biomaterial auf dem Gebiet des Bioprintings. Die Ableitung dieses Materials ist Gelatine, die aus Säugetierkollagen hydrolysiert wird. So verbleiben die Arginin-Glyin-Aspartinsäure(RGD)-Sequenzen und Zielmotive der Matrix-Metalloproteinase (MMP) auf den molekülen Ketten, die zur Zellbindung und -degradierung beitragen. Darüber hinaus sind die Formationseigenschaften von GelMA vielseitig. Die Methacrylamid-Gruppen ermöglichen es, dass ein Material unter Lichtbestrahlung in Gegenwart eines Photoinitiators schnell vernetzt wird. Daher ist es sinnvoll, geeignete Methoden zur Synthese dreidimensionaler (3D) Strukturen mit diesem vielversprechenden Material zu etablieren. Die geringe Viskosität schränkt jedoch die Bedruckbarkeit von GelMA ein. Hier werden Methoden zum 3D-Bioprinting von GelMA-Hydrogelen vorgestellt, nämlich die Herstellung von GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-Komplexstrukturen und Mikrofluidchips auf GelMA-Basis. Die daraus resultierenden Strukturen und die Biokompatibilität der Materialien sowie die Druckverfahren werden diskutiert. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll als Brücke zwischen zuvor verwendeten Biomaterialien und GelMA dienen und zur Etablierung von GelMA-basierten 3D-Architekturen für biomedizinische Anwendungen beitragen kann.

Einleitung

Hydrogele gelten als geeignetes Material im Bereich der Biofabrikation^1,2,3,4. Unter ihnen ist Gelatine Methacryloyl (GelMA) zu einem der vielseitigsten Biomaterialien geworden, ursprünglich im Jahr 2000 von Van Den Bulcke et al.⁵vorgeschlagen. GelMA wird durch die direkte Reaktion von Gelatine mit Methacrylanhydrid (MA) synthetisiert. Die Gelatine, die vom Säugetierkollagen hydrolysiert wird, besteht aus Zielmotiven der Matrix-Metalloproteinase (MMP). So können von GelMA erstellte dreidimensionale (3D) Gewebemodelle in vitro idealerweise die Wechselwirkungen zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix (ECM) in vivo imitieren. Darüber hinaus verbleiben Arginin-Glycin-Aspartinsäure (RGD)-Sequenzen, die in einigen anderen Hydrogelen wie Alginaten fehlen, auf den molekularen Ketten von GelMA. Dadurch ist es möglich, die Befestigung von gekapselten Zellen innerhalb der Hydrogelnetze zu realisieren⁶. Darüber hinaus ist die Formationsfähigkeit von GelMA vielversprechend. Die Methacrylamid-Gruppen auf den GelMA-Molekularketten reagieren mit dem Photoinitiator unter milden Reaktionsbedingungen und bilden bei Lichtbestrahlung kovalente Bindungen. Daher können die gedruckten Strukturen schnell vernetzt werden, um die entworfenen Formen auf einfache Weise zu erhalten.

Basierend auf diesen Eigenschaften, eine Reihe von Bereichen verwenden GelMA, um verschiedene Anwendungen durchzuführen, wie Tissue-Engineering, grundlegende Zytologie-Analyse, Arzneimittel-Screening, und Biosensing. Dementsprechend wurden auch verschiedene Fertigungsstrategien^{7,8,9,10,11,12,13,14}gezeigt. Es ist jedoch immer noch eine Herausforderung, 3D-Bioprinting auf Basis von GelMA durchzuführen, was auf seine grundlegenden Eigenschaften zurückzuführen ist. GelMA ist ein temperaturempfindliches Material. Während des Druckprozesses muss die Temperatur der Druckatmosphäre streng kontrolliert werden, um den physikalischen Zustand des Bioinks aufrechtzuerhalten. Außerdem ist die Viskosität von GelMA im Allgemeinen niedriger als bei anderen gängigen Hydrogelen (d. h. Alginat, Chitosan, Hyaluronsäure usw.). Beim Bau von 3D-Architekturen mit diesem Material¹⁵stehen jedoch andere Hindernisse auf dem Spiel.

Dieser Artikel fasst mehrere Ansätze für den von unserem Labor vorgeschlagenen 3D-Bioprinting von GelMA zusammen und beschreibt die gedruckten Proben (d. h. die Synthese von GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-Komplexstrukturen und GelMA-basierten mikrofluidischen Chips). Jede Methode hat spezielle Funktionen und kann in unterschiedlichen Situationen mit unterschiedlichen Anforderungen übernommen werden. GelMA-Mikrosphären werden durch ein elektrogestütztes Modul erzeugt, das zusätzliche externe elektrische Kraft bildet, um die Tröpfchengröße zu verkleinern. In Bezug auf GelMA-Fasern werden sie durch eine koaxiale Bioprinting-Düse mit Hilfe von viskosem Natriumalginat extrudiert. Darüber hinaus wird der Aufbau komplexer 3D-Strukturen mit einem Digital Light Processing (DLP) Bioprinter erreicht. Schließlich wird eine zweimalige Vernetzungsstrategie vorgeschlagen, um Mikrofluidchips auf GelMA-Basis zu bauen, die GelMA-Hydrogel und traditionelle mikrofluidische Chips kombinieren. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine signifikante Zusammenfassung der GelMA Bioprinting-Strategien in unserem Labor verwendet und kann andere Forscher in relativen Bereichen inspirieren.

Protokoll

1. Zellkultivierung

1. Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, das zur Kultur menschlicher Brustkrebszelllinien (MDA-MB-231) und menschlicher Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) verwendet wird.
2. Bereiten Sie DMEM mit L-Glutamin (DMEM/F-12), ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin, verwendet, um Knochenmark mesenchymale Stammzell (BMSC) Linien zu kulturen.
3. Stellen Sie die Kultivierungsumgebung auf 37 °C und 5%_CO2ein. Kultur MDA-MB-231, HUVEC und BMSC, und durchdurchdurchdies die Zellen in einem 1:2-Verhältnis, wenn 90% Zusammenfluss erreicht wird.

2. Herstellung von GelMA-Mikrosphären

1. Drucken Sie die Leuchte als Abbildung 1A mit Polymilchsäure (PLA) auf einem FDM-Drucker (FDM) (FUSED Deposition Modeling). Legen Sie zwei Metallringelektroden in die Halterung.
2. Verbinden Sie die beiden Metallringelektroden mit geschliffenen bzw. positiven Polen. Legen Sie die Metallplatte mit der Hochspannung unter der Ringelektrode verbunden und legen Sie eine Petrischale mit Siliziumöl als Tröpfchenempfänger auf die Metallplatte.
3. Gefriergetrocknetes GelMA (5% w/v) und Lithiumphenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinat (LAP, 0,5% w/v) in Dulbeccos phosphatgepufferter Salin (DPBS) als Bioink (10 ml) auflösen. Filtern Sie den Bioink durch einen 0,22 m Filter auf Sterilität und erhitzen Sie ihn in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.
4. Lösen Sie MDA-MB-231-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr bei 100 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
5. Entfernen Sie den Überstand. Mischen Sie das Zellpellet mit 1 ml zubereitetem Bioink, indem Sie es langsam pipetieren, um die Produktion von Blasen zu verhindern.
6. 1 ml Bioink (MDA-MB-231) in eine 3 ml sterile Spritze geben. Füttern Sie den Bioink mit der Kraft der Druckluft (0,5 kPa). Setzen Sie die Spritze auf die Halterung.
   HINWEIS: Die Druckumgebung sollte bei einer Temperatur von 30 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % streng kontrolliert werden.
7. Schalten Sie die Hochspannungsleistung ein und stellen Sie die Spannung auf 0 x 4 kV ein. Schalten Sie gleichzeitig das 405 nm Wellenlängenlicht ein, um die GelMA-Tröpfchen in 5 ml Siliziumöl zu vernetzen.
8. Gießen Sie den größten Teil des Siliziumöls weg, indem Sie die Petrischale dekantieren. Übertragen Sie das übrig gebliebene Siliziumöl und die GelMA-Mikrosphären mit einem Löffel in ein 15 ml Zentrifugalrohr.
9. 5 ml DPBS hinzufügen und die Mischung gleichmäßig schütteln. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 100 x g für 5 min und entfernen Sie die überstande Flüssigkeit.
10. Wiederholen Sie Schritt 2.9 3x.
11. Nehmen Sie die GelMA Mikrosphären mit einem Löffel heraus und kultialten Sie sie in DMEM in einer Petrischale bei 37 °C und 5% CO₂ für 3 Tage.
12. Entsorgen Sie das Medium und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Fix mit 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
13. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Permeabilisieren Sie mit 2 ml 0,5% nichtionischem Tensid (d. h. Triton X-100) für 5 min bei RT.
14. Entsorgen Sie das nichtionische Tensid und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Färben Sie sie mit 2 ml Tetramethylrhodin (TRITC) Phalloidin für 30 min in Dunkelheit bei RT.
15. Entsorgen Sie den TRITC und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Färben Sie sie mit 2 ml 4–,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 10 min in Dunkelheit bei RT.
16. Entsorgen Sie die DAPI und waschen Sie die Mikrosphären mit DPBS. Erfassen Sie die Morphologie mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.

3. Herstellung von GelMA Fasern

1. Bereiten Sie eine Koaxialdüse vor, wie in Abbildung 2Adargestellt. Befestigen Sie eine Innendüse (25 G, OD = 510 m, ID = 250 m) und die Außendüse (18 g, OD = 1200 m, ID = 900 m) mit Löten. Schließen Sie ein Glasrohr (Länge = 50 mm, Innendurchmesser = 1,2 mm) an das Ende der Koaxialdüse an.
2. Natriumalginatpulver (Na-Alg) auflösen, das unter ultraviolettem (UV) Licht 30 min in entionisiertem Wasser bei 2% (w/v) sterilisiert wird.
3. Bereiten Sie eine sterile Bioink-Lösung nach Schritt 2.3 vor. Erhitzen Sie die GelMA Bioink- und Na-Alg-Lösung in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.
4. Lösen Sie BMSCs-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr bei 100 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
5. Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit. Mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml vorbereitetem GelMA-Bioink, indem Sie es langsam pipetieren, um die Produktion von Blasen zu verhindern.
6. 2 ml Bioink (BMSCs) in eine 10 ml Spritze geben. 2 ml Na-Alg-Lösung in eine andere Spritze (10 ml) geben. Füttern Sie sie mit zwei Spritzenpumpen (hier Bioink bei 50 m/min und Na-Alg-Lösung bei 350 m/min).
   HINWEIS: Die Druckumgebung sollte bei einer Temperatur von 30 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % streng kontrolliert werden.
7. Schalten Sie das 405 nm Wellenlängenlicht ein, um das transparente Rohr zu bestrahlen, um die GelMA-Fasern zu vernetzen. Verwenden Sie eine Petrischale mit DPBS, um die Fasern zu erhalten.
8. Nehmen Sie die GelMA-Fasern mit einem Löffel aus DPBS heraus und beprägen Sie sie 3 Tage lang im präparierten DMEM/F-12 in 37 °C und 5%_CO2.
9. Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die GelMA-Fasern für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.

4. Herstellung komplexer 3D-GelMA-Strukturen

ANMERKUNG: Abbildung 3A zeigt die Fertigungsskizze der komplexen 3D-GelMA-Strukturen.

1. Wischen Sie den DLP-Bioprinter (Abbildung 3E) mit 75% Alkohol ab und setzen Ihn der UV-Bestrahlung 30 min für Sterilität aus.
2. Lösen Sie das gefriergetrocknete GelMA (10% w/v) und LAP (0,5% w/v) in DPBS auf. Fügen Sie Magenta-Pigment in die Lösung (3% v/v) ein, um die Druckgenauigkeit zu verbessern.
3. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 m Filter auf Sterilität und erhitzen Sie sie in einem 37 °C-Wasserbad für 15 min.
4. Erstellen Sie die 3D-Modelle mit CAD-Software (Computer-Aided Design). Importieren Sie die Modelldokumente in die obere Software (EFL) des angewendeten DLP-Biodruckers.
5. 10 ml zubereiteter Bioink in den Trog des DLP-Biodruckers geben.
6. Stellen Sie die Druckparameter in der oberen Software wie folgtein: Lichtintensität = 12 mW/cm2 , Bestrahlungsdauer = 30 s und Schnitthöhe = 100 m. Beginnen Sie mit dem Drucken.
7. Entfernen Sie die gedruckte Struktur aus dem Bioprinter und tauchen Sie sie in DPBS in eine Petrischale ein.
8. Lösen Sie die MDA-MB-231s-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen bei 100 x g für 5 min in einem 15 ml-Rohr, um ein Zellpellet zu erhalten.
9. Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit und mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml DMEM.
10. Fügen Sie 100 L Zellaufhängung auf die gedruckten Strukturen hinzu. Kultur für 3 Tage im vorbereiteten DMEM bei 37 °C und 5%_CO2.
11. Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die komplexen 3D-Strukturen für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.

5. Herstellung von Mikrofluidchips auf GelMA-Basis

ANMERKUNG: Abbildung 4A zeigt die Fertigungsskizze des Mikrofluidikchips auf GelMA-Basis.

1. Lösen Sie das gefriergetrocknete GelMA 10% (w/v) und LAP (0,5% w/v) in DPBS auf. Filtern Sie die GelMA-Lösung durch einen 0,22-mm-Filter auf Sterilität.
2. Sterilisieren Sie das Gelatinepulver 30 min unter UV-Licht und fügen Sie es der gelMA-LAP-Lösung hinzu, die in Schritt 5.1 zu einer Endkonzentration von 5% (w/v) hergestellt wird. Erhitzen Sie das Gemisch in einem 37 °C Wasserbad für 15 min.
3. Entwerfen Sie eine Gruppe von Formen (Abbildung 4B,C) mit CAD-Software und fertigen Sie sie mit Photopolymerharz auf einem DLP-Drucker.
4. Füllen Sie die Formen vollständig mit dem vorbereiteten Bioink.
5. Legen Sie die Formen in einen 4 °C Kühlschrank, um die Gelatine für 30 min zu vernetzen.
6. Entfernen Sie die Formen und entnichtgen sie mit einer Klinge die teilweise (physikalisch) vernetzten Hydrogelplatten aus den Formen.
7. Kombinieren Sie die beiden entformten Hydrogelplatten und verkleben Sie sie mit Hilfe von GelMA, indem Sie bei 405 nm für 1 min bestrahlen.
8. Lösen Sie die HUVECs-Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin-0,02% EDTA-Lösung für 3 min bei 37 °C. Zentrifugenzellen in einem 15 ml Zentrifugalrohr, um ein Zellpellet bei 100 x g für 5 min zu erhalten.
9. Entfernen Sie die überstande Flüssigkeit und mischen Sie das Zellpellet mit 2 ml DMEM.
10. Füllen Sie den Mikrokanal vollständig, indem Sie die Zellsuspension mit einer Düse und einer Spritze injizieren.
11. Drehen Sie den Chip alle 15 min während der nächsten 3 h auf den Kopf, um eine gleichmäßige und vollständige Zellaussaat zu erreichen. Die Chips in der Petrischale 3 Tage lang im präparierten DMEM bei 37 °C und 5%_CO2ankulturieren.
12. Befolgen Sie die Schritte 2.12-2.16, um die mikrofluidischen Chips für die morphologische Beobachtung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop vorzubereiten.

Ergebnisse

Bei der Herstellung von GelMA-Mikrosphären wurden die GelMA-Tröpfchen durch die externe elektrische Feldkraft getrennt. Wenn die Tröpfchen in das empfangende Siliziumöl fielen, blieben sie Standard-Sphäroid-Form ohne Schwänze. Dies liegt daran, dass sich die GelMA-Tröpfchen in einer wässrigen Phase befanden, während sich das Siliziumöl in einer Ölphase befand. Die Oberflächenspannung, die sich zwischen den beiden Phasen bildete, führte dazu, dass die GelMA-Tröpfchen eine Standard-Sphäroidform beibeließen....

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt mehrere Strategien zur Herstellung von GelMA 3D-Strukturen, nämlich GelMA-Mikrosphären, GelMA-Fasern, GelMA-komplexe Strukturen und Mikrofluidchips auf GelMA-Basis. GelMA verfügt über vielversprechende Biokompatibilitäts- und Formationsfähigkeit und ist im Bereich der Biofertigung weit verbreitet. Mikrosphärenstrukturen eignen sich für kontrollierte Wirkstofffreisetzung, Gewebekultivierung und Injektion in Organismen zur weiteren Therapie^21,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter membrane	Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope	OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100	Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China