젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

요약

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

초록

젤라틴 메타크릴로일(GelMA)은 바이오프린팅 분야에서 인기 있는 생체 재료가 되었습니다. 이 물질의 파생은 포유류 콜라겐에서 가수 분해되는 젤라틴입니다. 따라서 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 서열과 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 표적 모티프는 분자 사슬에 남아 있어 세포 부착 및 분해를 달성하는 데 도움이 됩니다. 또한 GelMA의 형성 특성은 다재다능합니다. 메타크릴아미드 그룹은 광이니시에이터가 있는 경우 광조사 하에 물질이 빠르게 상호 연결될 수 있게 한다. 따라서 이 유망한 재료로 3차원(3D) 구조를 합성하는 데 적합한 방법을 확립하는 것이 좋습니다. 그러나 점도가 낮기 때문에 GelMA의 인쇄성이 제한됩니다. 여기에 제시된 겔마 하이드로겔의 3D 바이오프린팅, 즉 GelMA 마이크로스피어, GelMA 섬유, GelMA 복합 구조 및 GelMA 기반 미세 유체 칩의 제조를 수행하는 방법이 다 수 있습니다. 재료의 결과 구조 및 생체 적합성뿐만 아니라 인쇄 방법에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 이전에 적용된 생체 재료와 GelMA 사이의 다리 역할을 할 뿐만 아니라 생물 의학 응용 을 위한 GelMA 기반 3D 아키텍처의 설립에 기여할 수 있다고 믿습니다.

서문

하이드로겔은 생체 제조^분야에서적합한 재료로 생각된다^1,2,3,4. 그 중에서도 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)은 2000년 반 덴 불케 외^5에의해 처음 제안된 가장 다재다능한 생체 재료 중 하나가 되었다. GelMA는 메타크릴 무수 (MA)와 젤라틴의 직접적인 반응에 의해 합성됩니다. 포유류 콜라겐에 의해 가수분해되는 젤라틴은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)의 표적 모티브로 구성됩니다. 따라서 GelMA에 의해 확립된 시험관 내 3차원(3D) 조직 모델은 생체 내에서 세포와 세포외 매트릭스(ECM) 사이의 상호작용을 이상적으로 모방할 수 있다. 게다가, 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD) 서열은, 알긴염과 같은 몇몇 그밖 하이드로겔에서 결석하는, GelMA의 분자 사슬에 남아 있습니다. 이것은 하이드로겔 네트워크 내부의 캡슐화된 세포의 부착을 실현할 수 있게^{한다 6.} 또한, GelMA의 형성 능력은 유망하다. GelMA 분자 사슬에 있는 메타크릴아미드 단은 온화한 반응 조건의 광이니시에이터와 반응하고 광 조사에 노출시 공유 결합을 형성합니다. 따라서 인쇄된 구조는 신속하게 상호 연결되어 설계된 형상을 간단한 방식으로 유지할 수 있습니다.

이러한 특성에 기초하여 일련의 분야는 GelMA를 활용하여 조직 공학, 기본 세포학 분석, 약물 스크리닝 및 바이오센싱과 같은 다양한 응용 분야를 수행합니다. 따라서, 다양한 제조 전략은 또한^{7,8,9,10,11,12,13,14를}입증했다. 그러나 GelMA를 기반으로 한 3D 바이오프린팅을 수행하는 것은 여전히 어려운 일이며, 이는 근본적인 특성 때문입니다. GelMA는 온도에 민감한 물질입니다. 인쇄 과정에서, 생체 잉크의 물리적 상태를 유지하기 위해 인쇄 분위기의 온도를 엄격하게 제어해야합니다. 게다가, GelMA의 점도는 일반적으로 다른 일반적인 하이드로겔 (즉, 알긴산, 키토산, 히알루론산 등)보다 낮다. 그러나 이 재료^15로3D 아키텍처를 구축할 때 다른 장애물에 직면합니다.

이 문서는 우리 실험실에서 제안한 GelMA의 3D 바이오프린팅에 대한 몇 가지 접근법을 요약하고 인쇄된 샘플(즉, GelMA 마이크로스피어, GelMA 섬유, GelMA 복합 구조 및 GelMA 기반 미세 유체 칩의 합성)을 설명합니다. 각 메서드에는 특수 함수가 있으며 요구 사항이 다른 다양한 상황에서 채택할 수 있습니다. GelMA 마이크로스피어는 전기 보조 모듈에 의해 생성되며, 이는 액적 크기를 축소하기 위해 여분의 외부 전력을 형성합니다. GelMA 섬유의 관점에서, 그들은 점성 나트륨 알긴산의 도움으로 동축 바이오 프린팅 노즐에 의해 압출된다. 또한, 복잡한 3D 구조의 설립은 디지털 광 처리 (DLP) 바이오 프린터로 달성된다. 마지막으로 GelMA 하이드로겔과 기존 미세 유체 칩을 결합하여 GelMA 기반 미세 유체 칩을 구축하기 위한 두 번의 가교 전략이 제안되었습니다. 이 프로토콜은 우리의 실험실에서 사용되는 GelMA 바이오 프린팅 전략의 중요한 요약이며 상대 적인 분야에서 다른 연구자에 영감을 줄 수 있다고 믿어진다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. 인간 유방암 세포(MDA-MB-231) 라인과 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 라인을 배양하는 데 사용되는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)를 준비합니다.
2. 골수 중간엽 줄기 세포 (BMSC) 라인을 배양하는 데 사용되는 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙 토 마이신으로 보충 된 L-글루타민 (DMEM / F-12)로 DMEM을 준비하십시오.
3. 배양 환경을 37°C 및 5%_CO2로설정합니다. 배양 MDA-MB-231, HUVEC, 및 BMSC, 및 90% 합류에 도달할 때 1:2 비율로 세포를 통과한다.

2. 겔마 마이크로스피어의 제조

1. 융합증모델링(FDM) 프린터에서 폴리락틱산(PLA)을 사용하여 그림 1A로 설비를 인쇄합니다. 고정장치에 두 개의 금속 링 전극을 놓습니다.
2. 두 개의 금속 링 전극을 각각 접지 및 양극과 연결합니다. 고전압으로 연결된 금속 판을 링 전극 아래에 놓고 실리콘 오일이 있는 페트리 접시를 금속판에 액적 수신기로 놓습니다.
3. 동결 건조 GelMA (5 % w / v) 및 리튬 페닐 -2,4,6-트리메틸 벤조일 포스 피네이트 (LAP, 0.5 % w / v)를 덜베코의 인산 완충 식염수 (DPBS)에서 바이오 잉크 (10 mL)로 용해하십시오. 바이오잉크를 0.22 μm 필터를 통해 살균을 위해 걸친 다음 37°C 수조에서 15분 동안 가열합니다.
4. 3 mL의 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액을 37°C에서 3분 동안 분리MDA-MB-231 세포를 분리하였다. 15 mL 원심관에서 100 x g에서 5분 동안 원심분리세포를 세포 펠릿을 얻었다.
5. 상급체를 제거합니다. 기포의 생산을 방지하기 위해 천천히 파이펫팅하여 제조 된 바이오 잉크의 1 mL와 세포 펠릿을 혼합합니다.
6. 바이오 잉크 1 mL (MDA-MB-231)을 3 mL 멸균 주사기에 넣습니다. 압축 공기의 힘으로 바이오 잉크를 공급하십시오 (~0.5 kPa). 주사기를 고정장치에 놓습니다.
   참고 : 인쇄 환경은 30 ° C의 온도와 50 %의 습도에서 엄격하게 제어해야합니다.
7. 고전압 전원을 켜고 전압을 0−4 kV로 설정합니다. 동시에 405 nm 파장 빛을 켜서 실리콘 오일 5 mL에서 GelMA 방울을 교차 연결합니다.
8. 페트리 접시를 디캔팅하여 실리콘 오일의 대부분을 붓습니다. 남은 실리콘 오일과 GelMA 마이크로스피어를 숟가락을 사용하여 15 mL 원심관으로 옮김을 옮김.
9. DPBS 5 mL을 넣고 혼합물을 균일하게 흔들어 줍니다. 튜브를 100 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상수액을 제거하십시오.
10. 2.9 3x 단계를 반복합니다.
11. 37°C및 5% CO2에서 37°C 및 5% CO2에서 37°C및 5%_CO2에서 DMEM에서 스푼으로 겔마 마이크로스피어를 꺼내 서 3일 동안 배양한다.
12. 매체를 버리고 DPBS로 마이크로스피어를 세척합니다. 실온(RT)에서 30분 동안 2 mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
13. PFA를 버리고 DPBS로 마이크로스피어를 세척합니다. RT에서 5 분 동안 0.5 % nonionic 계면 활성제 (즉, 트리톤 X-100)의 2 mL로 투과하십시오.
14. 난비 계면 활성제를 버리고 DPBS로 마이크로 스피어를 씻습니다. RT에서 어둠 속에서 30 분 동안 테트라메틸호다민 (TRITC) 파할로이드 2 mL로 얼룩을 제거하십시오.
15. TRITC를 버리고 DPBS로 마이크로스피어를 세척합니다. RT에서 어둠 속에서 10 분 동안 4-6-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 2 mL로 얼룩을.
16. DAPI를 버리고 DPBS로 마이크로스피어를 세척합니다. 공초점 형광 현미경으로 형태를 캡처합니다.

3. 겔마 섬유의 제조

1. 그림 2A와같이 동축 노즐을 준비합니다. 납땜으로 내부 노즐(25G, OD = 510 μm, ID = 250 μm)과 외부 노즐(18G, OD = 1200 μm, ID = 900 μm)을 고정합니다. 유리 튜브(길이 = 50mm, 내경 = 1.2mm)를 동축 노즐 끝에 연결합니다.
2. 자외선(UV) 빛으로 멸균된 알긴산 나트륨(Na-Alg) 분말을 탈이온수에서 2%(v)에서 30분 간 용해합니다.
3. 2.3단계에 따라 멸균 바이오잉크 용액을 준비한다. GelMA 바이오잉크 와 Na-Alg 용액을 37°C 수조에서 15분 동안 가열합니다.
4. 3 mL의 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액을 37°C에서 3분 동안 분리한 BMSCs 셀. 15 mL 원심관에서 100 x g에서 5분 동안 원심분리세포를 세포 펠릿을 얻었다.
5. 상급 유체를 제거합니다. 세포 펠릿을 준비된 GelMA 바이오잉크의 2 mL와 혼합하여 천천히 파이펫팅하여 기포 생성을 방지합니다.
6. 바이오 잉크 (BMSC)의 2 mL를 10 mL 주사기에 넣습니다. Na-Alg 용액 2 mL을 다른 주사기(10mL)에 넣습니다. 두 개의 주사기 펌프로 각각 먹이십시오 (여기, 50 μm / min의 바이오 잉크 및 350 μm / min의 Na-Alg 용액).
   참고 : 인쇄 환경은 30 ° C의 온도와 50 %의 습도에서 엄격하게 제어해야합니다.
7. 405 nm 파장 빛을 켜고 투명 튜브를 조사하여 GelMA 섬유를 교차 연결합니다. 섬유를 받기 위해 DPBS와 페트리 접시를 사용합니다.
8. DPBS에서 숟가락으로 GelMA 섬유를 꺼내 37 °C 및 5 %_CO2에서제조 된 DMEM / F-12에서 3 일 동안 배양하십시오.
9. 2.12-2.16 단계를 수행하여 공초점 형광 현미경으로 형태학적 관찰을 위해 GelMA 섬유를 준비시다.

4. 복잡한 3D GelMA 구조의 제조

참고: 그림 3A는 복잡한 3D GelMA 구조의 제작 스케치를 보여줍니다.

1. DLP 바이오프린터(그림3E)를75%의 알코올로 닦아내고 자외선 조사에 30분 동안 노출하여 불임에 노출시다.
2. 동결 건조 된 GelMA (10 % w / v) 및 LAP (0.5 % w / v)를 DPBS에 녹입니다. 마젠타 식용 안료를 용액(3% v/v)에 첨가하여 인쇄 정확도를 향상시킵니다.
3. 0.22 μm 필터를 통해 용액을 걸과 살균하고 37°C 수조에서 15분 동안 가열합니다.
4. CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어로 3D 모델을 빌드합니다. 모델 문서를 적용된 DLP 바이오프린터의 상위 소프트웨어(EFL)로 가져옵니다.
5. DLP 바이오 프린터의 트로프에 준비된 바이오 잉크 10 mL을 추가합니다.
6. 위 소프트웨어의 인쇄 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 광도 = 12mW/cm^2,조사 기간 = 30s 및 슬라이스 높이 = 100 μm. 인쇄를 시작합니다.
7. 바이오 프린터에서 인쇄된 구조를 제거하고 페트리 접시에 DPBS에 담그고 있습니다.
8. 3mL의 0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액으로 MDA-MB-231s 세포를 37°C에서 3분 동안 분리합니다. 100 x g에서 15 mL 튜브에서 5 분 동안 원심 분리세포를 세포 펠릿을 얻었다.
9. 상류액을 제거하고 세포 펠릿을 DMEM 2 mL와 혼합합니다.
10. 인쇄된 구조물에 100 μL의 셀 서스펜션을 추가합니다. 37°C 및 5%_CO2에서제조된 DMEM에서 3일 동안 배양한다.
11. 2.12-2.16 단계를 수행하여 공초점 형광 현미경으로 형태학적 관찰을 위한 복잡한 3D 구조를 준비합니다.

5. GelMA 기반 미세 유체 칩 의 제조

참고: 그림 4A는 GelMA 기반 미세 유체 칩의 제작 스케치를 보여줍니다.

1. 동결 건조 된 GelMA 10 % (v) 및 LAP (0.5 % w / v)를 DPBS에 녹입니다. 0.22 μm 필터를 통해 GelMA 용액을 걸레로 걸수 있습니다.
2. 자외선 하에서 젤라틴 분말을 30분 동안 살균하고 5.1단계에서 제조된 GelMA-LAP 용액에 5%의 최종 농도(w/v)의 젤라틴 농도를 첨가합니다. 혼합물을 37°C 수조에서 15분 동안 가열합니다.
3. CAD 소프트웨어로 금형그룹(그림 4B,C)을설계하고 DLP 프린터에서 광중합체 수지로 제조합니다.
4. 준비된 바이오 잉크로 금형을 완전히 채웁니다.
5. 30 분 동안 젤라틴을 교차 연결하기 위해 4 ° C 냉장고에 금형을 넣습니다.
6. 몰드를 제거하고 블레이드로 부분적으로 (물리적으로) 가교 하이드로겔 시트를 몰드로부터 제거한다.
7. 두 개의 데올드 하이드로겔 시트를 결합하고 1 분 동안 405 nm에서 조사하여 GelMA의 도움으로 결합하십시오.
8. HUVECs 세포를 3 mL0.25% 트립신-0.02% EDTA 용액으로 37°C에서 3분 동안 분리합니다. 15 mL 원심관에서 원심분리세포를 5분 동안 100 x g에서 세포 펠릿을 얻었다.
9. 상류액을 제거하고 세포 펠릿을 DMEM 2 mL와 혼합합니다.
10. 노즐과 주사기로 셀 서스펜션을 주입하여 마이크로 채널을 완전히 채웁니다.
11. 다음 3시간 동안 15분마다 칩을 거꾸로 뒤집어 균일하고 완전한 셀 시드를 완성합니다. 37°C 및 5%_CO2에서제조된 DMEM에서 3일 동안 페트리 접시에 칩을 배양한다.
12. 2.12-2.16 단계를 수행하여 공초점 형광 현미경으로 형태학적 관찰을 위한 미세 유체 칩을 준비합니다.

결과

GelMA 마이크로스피어를 제조하는 동안, 겔마 방울은 외부 전기장 힘에 의해 분리되었다. 물방울이 수신 실리콘 오일에 떨어졌을 때, 그들은 꼬리없이 표준 스페로이드 모양으로 남아 있었다. 이는 GelMA 방울이 수성 상에 있었고 실리콘 오일이 오일 상에 있었기 때문입니다. 두 단계 사이에 형성된 표면 장력은 GelMA 방울이 표준 스페로이드 형상을 유지하도록 일으켰다. 셀-라덴 마이크로스피어의 관...

토론

이 문서에서는 GelMA 3D 구조, 즉 GelMA 마이크로스피어, GelMA 섬유, GelMA 복합 구조 및 GelMA 기반 미세 유체 칩을 제조하기 위한 몇 가지 전략을 설명합니다. GelMA는 유망한 생체 적합성 및 형성 능력을 가지고 있으며 생체 제조 분야에서 널리 사용됩니다. 마이크로스피어 구조는 조절약물 방출, 조직 배양 및 추가 치료를 위한 유기체내의 주입에 적합하다^21,22,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter membrane	Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope	OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100	Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China