生体にインスパイアされたマイクロ電極を用いたソフトロボット

要約

バイオインスパイアされた足場は、機械的に堅牢で導電性のヒドロゲルを使用した柔らかいフォトリソグラフィ技術によって製造されています。マイクロパターン化ヒドロゲルは、指向性心筋細胞細胞の位置合わせを提供し、調整された作動方向をもたらす。フレキシブルな微小電極も足場に統合され、自己作動性心臓組織の電気制御性をもたらします。

要約

生体に影響を与えたソフトロボットシステムは、生体組織と生体材料を用いて生物を模倣し、現在のバイオロボティクスパラダイム、特に生物医学研究に革命を起こしています。人工的な生命のような作動ダイナミクスを再現することは、ソフトロボットシステムにとって非常に重要です。しかし、動作動作の正確な制御とチューニングは、現代のソフトロボットシステムの主な課題の1つです。この方法は、マイクロパターン化された刺傷上の心筋組織の収縮によって活性化され、制御される生命のような動きを有する電気的に制御可能なソフトロボットを製造するための低コストで、非常にスケーラブルで使いやすい手順を記述する光線状のヒドロゲル足場。柔らかいフォトリソグラフィー法を使用することで、マイクロパターン化ヒドロゲルベースの足場を含むソフトロボットシステムに複数のコンポーネントをカーボンナノチューブ(CNT)組み込みゼラチンメタクリロイル(CNT-GelMA)と組み込み可能にするポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)、フレキシブルゴールド(Au)微小電極、心筋組織。特に、ヒドロゲルのアライメントとマイクロパターンは、刺傷線の筋肉および軟骨構造を模倣するように設計されている。導電性CNT-GelMAヒドロゲルは、心筋細胞の成熟および収縮挙動を改善する細胞足場として機能し、機械的に堅牢なPEGDAヒドロゲルは軟骨状の構造をソフトロボット全体に支えます。金属ベースの微小電極の硬くて脆い性質を克服するために、高い柔軟性を持ち、心筋細胞の鼓動を妨げないようにできる蛇行パターンを設計しました。組み込まれた柔軟なAu微小電極は、柔らかいロボット全体に電気刺激を提供し、心臓組織の収縮行動を制御しやすくします。

概要

現代の最先端のソフトロボットは、クラゲ^1、2、刺す光線^2、タコ^3、バクテリア^4、精子⁵など、多くの生物の階層構造と筋肉ダイナミクスを模倣することができます。自然システムのダイナミクスとアーキテクチャを模倣すると、エネルギッシュで構造的な効率の両方の面でより高いパフォーマンスを提供しています⁶.これは、自然組織の柔らかい性質(例えば、10⁴-10^{9 Pa}の間のヤング率を有する皮膚または筋肉組織)に本質的に関連しており、標準的な設計アクチュエータと比較して、より高い自由度と優れた変形および適応性を可能にする(例えば、ヤングの係数は通常10^9-1012 Pa)^の間である。心筋ベースのソフトアクチュエータは、特に、機械的にベースのロボットシステム⁷と比較して、自己作動による優れたエネルギー効率とオートリペアおよび再生の可能性を示す。しかし、ソフトロボットの製造は、異なるコンポーネントを異なる物理的、生物学的、機械的特性を持つ1つのシステムに統合する必要性のために困難です。例えば、人工合成システムは、構造サポートを提供するだけでなく、その作動行動に影響を与え、調節するだけでなく、生きている生物学的システムと統合する必要があります。さらに、多くの微細加工方法では、過酷/細胞毒性プロセスと、生きている成分の生存率と機能を低下させる化学物質が必要です。そのため、ソフトロボットの機能を強化し、その動作を制御し、調節するために、新しいアプローチが必要です。

良好な生存率で生きている部品をうまく統合するために、ヒドロゲルベースの足場は柔らかいロボットのボディを作成する優秀な材料である。ヒドロゲルの物理的および機械的特性は、筋肉組織^8、9などの生体成分の微小環境を作り出すために容易に調整することができる。また、様々な微細加工技術を容易に採用でき、高忠実度^1,2,10の階層構造を作成します。柔軟な電子機器をソフトロボットに組み込み、電気刺激で動作を制御できます。例えば、光依存性電気生理学的活性化を示す電気起源細胞(例えば心筋細胞)を設計する光遺伝学的技術は、ビトロ²で魚の起尿運動を再現することができた光によって導かれたポリジメチルシロキサン(PDMS)ベースのソフトロボット刺線を開発するために使用されている。光遺伝学的技術は優れた制御性を示しているが、提示された研究は、従来の従来のシミュレーション方法である電気刺激を使用する。これは、柔軟な微小電極を介した電気刺激が、光遺伝学的技術に比べて容易かつ簡便であり、広範な開発プロセス¹¹を必要とするからである。柔軟な電子機器の使用は、長期的な刺激と標準/単純な製造プロセスだけでなく、調整可能な生体適合性および物理的および機械的特性^12、13を可能にすることができます。

ここでは、バイオインスパイア型ソフトロボットを作製する革新的な方法を提示し、操作された心筋組織の鼓動によって作動し、埋め込まれた柔軟なAu微小電極を介して電気刺激によって制御される。柔らかいロボットは刺す光線の筋肉そして軟骨の構造を模倣するように設計されている。刺線は、他の水泳種と比較して構造と動きを模倣しやすい生物です。筋肉は、導電性ヒドロゲルマイクロパターン上に心筋細胞を播種することによって、インビトロで再現される。既に報告したように、CNTなどの導電性ナノ粒子をGelMAヒドロゲルに組み込むことは、心臓組織の電気的結合性を向上させるだけでなく、優れたインビトロ組織構造および配置^8、9を誘導する。軟骨接合部は、システム全体の機械的に堅牢な基板として機能する機械的に堅牢なPEGDAヒドロゲルパターンを使用して模倣されます。サーペンチンパターンを有する柔軟なAu微小電極は、心臓組織を局所的および電気的に刺激するためにPEGDAパターンに埋め込まれる。

プロトコル

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に厳密に従って行われました。この議定書は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. ゲルマ合成

1. 50°Cの磁気攪拌機を用いて、100 mLのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)にゼラチン10gを溶かします。
2. ゼラチンプレポリマー溶液を50°Cで2時間攪拌しながら、8mLのメタクリル無水物をゆっくりと加え、反応したゼラチン溶液を予熱したDPBSで50°Cで希釈します。
3. 希釈した溶液を透析膜(分子量カットオフ = 12~14 kDa)に移し、脱イオン(DI)水に入れます。40°Cで透析を1週間程度行います。
4. 滅菌フィルター(細孔サイズ= 0.22 μm)を使用して透析ゲルマプレポリマー溶液をろ過し、溶液の25または30 mLを50 mLチューブに移し、-80°Cで2日間保存します。
5. 凍結乾燥したGelMAプレポリマー溶液を凍結乾燥乾燥し、5日間凍結乾燥した。

2. ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)プレポリマー溶液の調製

1. PegDA の 200 mg (MW = 1,000) を 2-ヒドロキシ-4-(2-ヒドロキシエトキシ) -2-メチルプロピオフェノン (写真イニシエーター、PI) の 5 mg (MW = 1,000) を DPBS の 1 mL に溶解します。
2. プレポリマー溶液を80°Cで5分間インキュベートする。

ゲルマコーティングCNT分散ストック溶液の3.

1. DPBSの4 mLに80mgのGelMA(バイオサーファクタントとして使用)を溶解し、20mgのCOOH官能化された多壁カーボンナノチューブ(MWCNT)をGelMAプレポリマー溶液に加えます。
2. MWCNT を含んだ GelMA プレポリマー溶液を 1 時間 (0.66Hz、100 ワット) で超音波処理します。
   注:超音波処理プロセス中、溶液は温度の上昇による溶媒の蒸発を防ぐために〜15°Cの水浴に浸す必要があります。

4. 5%ゲルマプレポリマー溶液を含有する1mg/mL CNTの調製

1. 80°Cで0.8 mLのDPBSで10分間、50mgのGelMAと5mg(総溶液の0.5%)を溶解します。
2. 準備したCNTストック溶液の0.2mLを加えます(ステップ3)。80°Cで10分間溶液をインキュベートした。

5.3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(TMSPMA)コーティングされたガラススライドの調製

1. 純粋なエタノールでガラスのスライド(厚さ= 1ミリメートル、サイズ= 5.08 cm x 7.62 cm)を洗浄します。
2. クリーニングされたスライドを250 mLビーカーに垂直に積み重ね、シリンジを使用してTMSPMAの3 mLをその上に広げます。TMSPMAの蒸発を防ぐために、ビーカーをアルミホイルで覆います。
3. スライドを80°Cのオーブンで1日間インキュベートします。
4. コーティングされたガラススライドを純粋なエタノールに浸して洗い、乾燥させます。
5. アルミ箔で包まれたコーティングされたガラススライドを室温(RT)に保存します。
   メモ:TMSPMAでコーティングされたガラススライドの表面に触れるのを最小限に抑えるようにしてください。

6. 柔軟なAu微小電極の製造

1. コンピュータ支援設計 (補足ファイル 3)を使用して、シャドウ マスクをデザインします。
2. シャドーマスクを製作し、購入する。
3. ガラススライド(厚さ= 1 mm、サイズ = 3 cm x 4 cm)をアセトンで洗浄し、圧縮空気銃で乾燥させます。
4. 両面テープを使用してガラス基板にシャドーマスクを取り付け、Eビームエバポレーターに入れ、チャンバー圧力が少なくとも^10-6トルに達するまで待ちます。
   注:2つのテープは、ガラスをホストするのに十分な距離とパターン全体に収まるほどの大きさで、サポートに手動で配置されました。このステップは45〜60分かかります。
5. Eビームエバポレーターで200nmの厚いAu層を堆積させる(例えば、デントンEE-4、真空^=10-6トール、電力=2.6%、レート=2Å/s)、ダイシングソーマシンを使用して製造された微小電極を切断する(電極サイズ= 7.38 mm x 8.9mm x 200nm)。

7. Au微小電極組み込み型微小パターン化多層ヒドロゲル足場の製造

注:この手順の結果は、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルが底層にあり、マイクロパターン化されたCNT-GelMAヒドロゲルが上にあり、Au微小電極が2つの層の間にある膜です。この構成は電極へのよりよい柔軟性を保障し、壊れる危険を制限する。

1. 2つのフォトマスクを設計し、作成して、マイクロパターン化されたPEGDA(1^番目のフォトマスク)とCNT-GelMAヒドロゲル(^第2フォトマスク)層を作成します。「補足ファイル 2–3」を参照してください。CADソフトウェアを使用して設計を行うことができます。
   メモ:図 2B、 Eを参照してください。
2. TMSPMAコーティングガラスに、市販の目に見えないテープ(厚み:50μm)を1層積み重ねて作られた50μmのスペーサーを置きます。TMSPMAコーティングガラスの上に20%PEGDAプレポリマー溶液を15μL注ぎ、金の微小電極で覆います。ガラススライド用の第1のフォトマスク(マイクロパターンPEGDA)を金のマイクロ電極の上に置き、110sの強度800 mW、8 cmの距離でUV光(320~390 nmフィルタの200W水銀蒸気短いアークランプ)に全体の構成物を露出させます。
   メモ:図 1Aを参照してください。
3. DPBSを追加してガラススライドを囲み、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルを5〜10分後にコーティングされていないガラス基板からAuマイクロ電極と一緒に取り外し、マイクロパターン化されたPEGDAヒドロゲルをAuで持つガラススライドを得るために慎重に電極。
   メモ:図 1Bを参照してください。TMSPMAコーティングにより、コンストラクトはコーティングされていないガラス基板からTMSPMAコーティングされた基板に移されます。このステップで Au マイクロ電極が簡単に切断されるため、慎重に取り外します (図 3)。
4. ペトリ皿の底に、市販の透明テープ(厚さ=50μm)を2層積み重ねて作った100μmのスペーサーを置きます。スペーサー間に20 μL CNT-GelMAプレポリマー溶液を塗布し、7.3で得られたガラススライドを反転させ、粘着テープで皿に固定します。
5. デバイスを上下逆に回転させ、2^つめのフォトマスクをスライドの上に置きます。200 sの強度の800 mWおよび8 cmの間隔の紫外線の下で露出する。
   メモ:図 1Cを参照してください。2番目のマスクのアライメントが重要です。
6. 得られた足場をDPBSと10%ウシ胎児血清(FBS)を含む細胞培養培地で洗浄する。
7. 細胞を播種する前に37°Cのインキュベーターに一晩放置してください。

8. 新生児ラット心筋細胞の分離と培養

1. 動物ケアに関する研究所の委員会によって承認されたプロトコルに従って、2日齢のスプレイグ・ドーリーラットから心臓を分離する⁸.
2. 冷たい部屋でHBSSでEDTAなしで0.05%トリプシンで一晩(約16時間)シェーカーに心臓片を置きます。
3. ピペットガンで心臓片を集め、トリプシンの量を最小限に抑え、10 mLの温かい心臓媒体(10%FBS、1%P/S、1%L-グルタミン)を50mLチューブに入れます。
4. 37 °Cの水浴中でゆっくりと旋回(~60rpm)7分間、10mLピペットでチューブから慎重にメディアを取り出し、心臓の破片をチューブに残します。
5. HBSSに0.1%コラゲナーゼタイプ2の7 mLを加え、37°Cの水浴で10分間旋回します。
6. 10 mLピペット10倍と軽く混ぜ、心臓の破片を混乱させる。1 mLピペットでチューブからメディアを取り出します。
7. HBSSに0.1%コラゲアーゼタイプ2の10mLを加え、37°Cの水浴で10分間素早く旋回し(約120~180rpm)、心臓片が溶解しているかどうかを確認します。
8. 10 mLピペットと混ぜ、1 mLピペットで繰り返して最後の心臓片を壊します。
9. 溶液が均一に見えたら、新しい50 mLチューブに70μmの細胞ストレーナーを置き、ストレーナーに一度に溶液1 mLをピペットします。
10. 37°Cで5分間180 x gで心臓細胞溶液を遠心分離する。
    注: まだいくつかの心臓の部分や粘液が溶解しなかった場合は、手順 8.7~8.9 を再度繰り返します。
11. 慎重に細胞ペレットの上のすべての液体を除去し、心臓媒体の2 mLで細胞を再懸濁.
12. 慎重に細胞を再懸濁し、それらを壊さないようにチューブ壁から心臓媒体の2 mLを追加します。
13. 中断した細胞をT175フラスコに加え、温かい心臓培地を一滴ずつドロップします。フラスコを37°Cのインキュベーターに1時間入れて、心臓線維芽細胞を底部に付着させる。
    注:この前めっきステップでは、心臓線維芽細胞はフラスコに付着し、心筋細胞は懸濁液中に残ります。
14. 心筋細胞を含むフラスコから培地を収集し、50 mLチューブに入れます。
15. 細胞を数え、37°Cで5分間260 x gで遠心分離する。
16. ステップ7で作製したソフトロボットの上に細胞を再サスペンドし、播種する。心筋細胞の特定の体積を1.95×106^細胞/mLの濃度で装置の全面に滴下する。
17. 37°Cでサンプルをインキュベートし、播種後1日目と2日目に2%FBSおよび1%L-グルタミンを用いて5mL細胞培養培地で培地を変更した。メディアの色が変わるたびにメディアを変更します。

9. アライメント解析のための細胞染色

1. メディアを取り出し、RTで5分間DPBSで洗います。
2. RTで20分間4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して細胞を固定します。その後、RTで5分間DPBSで洗浄します。
3. DPBSで0.1%トリトンの細胞を1時間RTで1時間洗浄し、PBSで3倍の洗浄を行い、RTで5分間インキュベートします。
4. DPBSで1時間のRTで10%ヤギ血清を有する細胞をインキュベートする。
5. DPBSの10%ヤギ血清中の10%ヤギ血清中の一次抗体(肉腫α-アクチニンおよびコネキシン-43)を用いて細胞を4°C〜14〜16時間インキュベートする。
6. RTでDPBSで3倍を5分間洗浄し、DPBSの10%ヤギ血清中の二次抗体を1時間1時間培養します。
7. RTでDPBSで3倍を5分間洗浄し、次にDI水中4',6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含むカウンターステイン細胞(1:1,000)をRTで10分間洗浄し、DPBSでDPBSを5分間洗浄します。
8. 逆レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて蛍光画像を撮影します。

10. アクチュエータのテストと行動評価

1. ソフトロボット上の心筋細胞の自然拍動
   1. 37 °Cで5日間のバイオインスピレーションアクチュエータをインキュベートし、1日目と2日目に必要な場合(メディアが黄色に変わったら)メディアをリフレッシュします。反転光学顕微鏡を使用して、毎日(5xおよび/または10x)画像を撮影します。収縮活動が始まると(一般的に3日目頃)、30秒/秒(5xおよび/または10x)で30秒の顕微鏡のライブウィンドウでビデオキャプチャソフトウェアを使用して細胞の動きを記録します。
   2. 5日目に、カバースライドでエッジから静かに持ち上げて膜を取り外します。
      注:細胞が強い鼓動を示す場合、膜は収縮の機械的作用のために、膜自体によって剥離します。
2. バルク電気信号刺激
   1. ホルダーとして3cm間隔のPDMSを使用して、心臓媒体を充填した6cmペトリ皿に2つのカーボンロッド電極を白金(Pt)ワイヤーで貼付します。その後、慎重にペトリ皿にソフトロボットを転送します。
   2. 50 msのパルス幅、DCオフセット値0V、ピーク電圧振幅0.5~6Vの平方波形を適用します。周波数は0.5、1.0、2.0 Hzの間で変動し、デューティサイクルはそれぞれ2.5%、5%、10%の間です。市販カメラを使用してマクロスケールの収縮を記録します。
3. Au微小電極による電気刺激
   1. Au微小電極積層多層ヒドロゲル足場の製造後、2つの銅線を、銀ペーストを用いた外部の正方形のポートを用いてAu電極に取り付けます。
   2. 銀ペーストを80°Cで5分間前治したPDMSの薄い層で覆います。その後、PDMSを完全に架橋するために、サンプルを45°Cのホットプレートに5時間置いた。
   3. 心筋細胞をシーディングした後、DC オフセット値 1 V、ピーク電圧振幅 1.5 ~ 5 V、周波数 0.5、1.0、および 2.0 Hz の周波数を持つ銅線に、方形波の電気刺激を適用します。

結果

Au微小電極組込バイオインスパイアソフトロボットの開発ステップのフロー図
ソフトロボットの設計の目的は、最小限の複雑さで泳ぐ動きを作動させることができる膜を構築することであった。構造は、時間の経過とともに繰り返し強い屈曲を維持することができなければならない (約 1 Hz) 強い鼓動を達成しながら、その形状を維持することができる.フォトマスクを用いてポ?...

ディスカッション

この方法を用いて、組み込まれたAuマイクロ電極によって制御される多層構造の足場に統合された自己作動性心臓組織を備えたバチドフィッシュのようなバイオインスピレーションソフトロボットの製造に成功しました。PEGDAおよびCNT-GelMAヒドロゲルで作られた2つの異なるマイクロパターン化ヒドロゲル層により、バイオインスパイア足場は良好な機械的安定性と理想的な細胞の整列と成熟?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL Beaker	PYREX	1000-250CNEa
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma-Aldrich	410896
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Milipore	M6514
37° Water bath	VWR	W6M
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
50mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	14-959-49A
70 µm Cell Strainer	Falcon	352350
80° incubator	VWR	1370GM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Antibiotic/Antimycotic solution	ThermoFisher Scientific	15240062
Anti-Connexin 43/GJAI antibody	Abcam	ab11370	Rabbit polyclonal
Anti-Sarcomeric α-actinin	Abcam	ab9465	Mouse monoclonal
Benchtop Freeze Dryers	Labconco	77500-00 K
Biosafety cabinet	Sterilgard	A/B3
Carbon rod electrodes	SGL Carbon Group	6971105
Centrifuge	Eppendorf	5804
CO2 incubator	Forma Scientific	3110
Collagenase, Type II, Powder	Gibco	17-101-015
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
COOH Functionalized Carbon Nanotubes	NanoLab	PD30L5-20-COOH
Dicing saw machine	Giorgio Technology	DAD-321
DMEM, High Glucose	Gibco	11-965-118
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-144
E-beam evaporator	CHA	57367
Fetal Bovine Serum	Gibco	10-437-028
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Type B, 300 bloom from porcine skin
Glass slide	VWR	48382-180
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red	Gibco	14-175-079
Inverted optical microscope	Olympus	CK40
Magnetic hotplate	Corning	PC-420
methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276695	Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor
Nunc EasYFlask 175cm2	ThermoFisher Scientific	159910
Olicscope	Siglent	SDS1052DL+
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	Electron Microscopy Sciences	15710
PDMS SYLGARD 184	Sigma-Aldrich	761036
Photomask	Mini micro stencil inc
Platinum wire	Alfa Aesar	AA43014BU
Polyethylene glycol dimethcrylate	Polysciences Inc.	15178-100
Regenerated Cellulose Dialysis Tubing	Fisherbrand	21-152-14
Silver Epoxy Adhesive	MG Chemicals	8330S
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	S2GPU02RE
Ultra sonicator	Qsonica	Q500
UV Curing System	OmniCure	S2000
Vortex mixer	Scientific Industry	SI-0246A
Waveform generator	Agilent	33500B
Wrap Aluminium foil	Reynolds	N/A