Биовдохновленный мягкий робот с инкорпорированными микроэлектродами

Резюме

Биовдохновленный эшафот изготовлен с помощью мягкой фотолитографии с использованием механически надежных и электрически проводящих гидрогелей. Гидрогели микрошаблона обеспечивают направленное выравнивание клеток кардиомиоцитов, что приводит к индивидуальному направлению привода. Гибкие микроэлектроды также интегрированы в эшафот, чтобы принести электрическую управляемость для самоактивации сердечной ткани.

Аннотация

Биовдохновленные мягкие роботизированные системы, имитирующие живые организмы с помощью инженерных мышечной ткани и биоматериалов, революционизируют нынешнюю парадигму биороботов, особенно в биомедицинских исследованиях. Воссоздание искусственной динамики активации, подобной жизни, имеет решающее значение для мягкой роботизированной системы. Однако точный контроль и настройка поведения активации по-прежнему представляет собой одну из главных задач современных мягких роботизированных систем. Этот метод описывает недорогие, высокомасштабируемые и простые в использовании процедуры для изготовления электрически управляемого мягкого робота с жизнеобразными движениями, которые активируются и контролируются сокращением сердечной мышечной ткани на микрошаблонированном жале лучоподобный гидрогелев. Использование мягких методов фотолитографии позволяет успешно интегрировать несколько компонентов в мягкую роботизированную систему, в ключая микрошаблонизированные гидрогельные леса с углеродными нанотрубками (CNT) встроенными желатиновым метакрилоломом (CNT-GelMA), поли (этиленгликоль) диакрилат (PEGDA), гибкие золотые (Au) микроэлектроды и сердечная мышечная ткань. В частности, выравнивание гидрогелей и микрошаблон предназначены для имитации структуры мышц и хряща луча жала. Электрически проводящий гидрогель CNT-GelMA действует как клеточная эшафот, которая улучшает созревание и сжатие поведения кардиомиоцитов, в то время как механически надежный гидрогель PEGDA обеспечивает структурную хрящевую поддержку всего мягкого робота. Чтобы преодолеть жесткий и хрупкий характер микроэлектродов на основе металла, мы разработали серпантин шаблон, который имеет высокую гибкость и может избежать препятствуя избиение динамики кардиомиоцитов. Включенные гибкие микроэлектроды Au обеспечивают электрическую стимуляцию через мягкого робота, что облегчает управление поведением сокращения сердечной ткани.

Введение

Современные современные мягкие роботы могут имитировать иерархические структуры и мышечную динамику многих живых организмов, таких как медузы^1,2,жало луч^2,осьминог³, бактерии^4,и сперма⁵. Имитация динамики и архитектуры природных систем обеспечивает более высокие показатели как с точки зрения энергетической, так и структурной эффективности⁶. Это внутренне связано с мягкой природой натуральных тканей (например, кожи или мышечной ткани с модулем молодых между 10⁴10⁹ Па), который позволяет более высокие степени свободы и превосходной деформации и адаптации по сравнению со стандартными инженерии приводов (например, модуля молодых обычно между 10⁹10¹² Па)⁶. Сердечные мышцы на основе мягкой активации, особенно, показывают превосходную энергоэффективность из-за их самоактивации, а также их потенциал для авторемонта и регенерации по сравнению с механически на основе роботизированной системы⁷. Тем не менее, изготовление мягких роботов является сложной задачей из-за необходимости интеграции различных компонентов с различными физическими, биологическими и механическими свойствами в одну систему. Например, инженерные синтетические системы должны быть интегрированы с живыми биологическими системами, не только обеспечивая их структурной поддержкой, но и влияя на их поведение активации. Кроме того, многие методы микрофабрикации требуют суровых/цитотоксических процессов и химических веществ, которые снижают жизнеспособность и функции любых живых компонентов. Поэтому необходимы новые подходы для повышения функциональности мягких роботов, а также для контроля и модулировать их поведение.

Для успешной интеграции живых компонентов с хорошей жизнеспособностью, гидрогель на основе эшафот является отличным материалом для создания тела мягкого робота. Физические и механические свойства гидрогеля можно легко настроить для создания микросреды для живых компонентов, таких как мышечные ткани^8,9. Кроме того, он может легко принять различные методы микрофабрикации, в результате чего создание иерархических структур с высокой точностью^1,2,10. Гибкие электронные устройства могут быть включены в мягкого робота для управления его поведением с помощью электрической стимуляции. Например, оптогенетические методы для инженера электрогенных клеток (например, кардиомиоциты), которые показывают светозависимую электрофизиологическую активацию, были использованы для разработки полидиметилсилоксана (PDMS) на основе мягкого роботизированного жгучего луча, управляемого светом, который смог воссоздать неугодное движение рыбы in vitro^2. Хотя оптогенетические методы показали отличную управляемость, представленная работа использует электрическую стимуляцию, обычный и традиционный метод моделирования. Это потому, что электрическая стимуляция с помощью гибких микроэлектродов легко и просто по сравнению с оптогенетических методов, которые требуют обширных процессов развития¹¹. Использование гибких электронных устройств может обеспечить долгосрочную стимуляцию и стандартные/простые процессы изготовления, а также настраиваемую биосовместимость и физические и механические свойства^12,13.

Здесь мы представляем инновационный метод для изготовления биовдохновленный мягкий робот, приведенный в действие избиение инженерии сердечной мышечной ткани и контролируется электрической стимуляции через встроенные гибкие микроэлектроды Au. Мягкий робот предназначен для имитации структуры мышц и хряща луча жала. Луч жала является организмом с относительно легко имитировать структуру и движение по сравнению с другими видами плавания. Мышцы воссозданы в пробирке путем посева кардиомиоцитов на электрически проводящем гидрогелевом микропатее. Как сообщалось ранее, включение электрически проводящих наночастиц, таких как CNT в гидрогель GelMA не только улучшает электрическое соединение сердечной ткани, но и вызывает отличную архитектуру ткани in vitro и расположение^8,9. Затем суставы хряща передисмоно используют механически надежный узор гидрогеля PEGDA, который действует как механически надежный субстрат всей системы. Гибкие микроэлектроды Au с серпантином узором встроены в шаблон PEGDA, чтобы локально и электрически стимулировать сердечную ткань.

протокол

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, соданными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был одобрен институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Бригама и женской больницы.

1. Синтез Гелма

1. Растворите 10 г желатина в 100 мл фосфатно-буферного сольниковых сотелей Дульбекко (DPBS) с помощью магнитного мешалки при 50 градусах Цельсия.
2. Добавить 8 мл метакрилова ангидрида медленно, помешивая желатиновый преполимерный раствор при 50 градусах По Цельсию в течение 2 ч. Разбавить отреагированный желатиновый раствор с разогретым DPBS при 50 градусах Цельсия.
3. Перенесите разбавленный раствор в диализные мембраны (молекулярное отсечение веса - 12-14 кДа) и поместите их в деионизированную (DI) воду. Выполните диализ при 40 градусах По Цельсию в течение примерно 1 недели.
4. Фильтр диализированного раствора GelMA преполимера с помощью стерильного фильтра (размер пор - 0,22 мкм) и перенесите 25 или 30 мл раствора в трубки 50 мл и храните при -80 градусов по Цельсию в течение 2 дней.
5. Заморозить-сухой замороженный раствор преполимера GelMA с помощью замораживания сушилки в течение 5 дней.

2. Приготовление поли (этиленгликоль) диакрилата (PEGDA) преполимерного раствора

1. Растворите 200 мг (20% от общего раствора) ПЕГДА (МВт - 1000) с 5 мг (0,5% от общего раствора) 2-гидрокси-4-(2-гидроксиец) -2-метилпропиофенон (фото-инициатор, PI) в 1 мл DPBS.
2. Инкубировать преполимерный раствор при 80 градусах по Цельсию в течение 5 мин.

3. Подготовка раствора CNT с покрытием GelMA

1. Растворите 80 мг GelMA (используется в качестве биосурфактанта) в 4 мл DPBS, а затем добавьте 20 мг функционализированных многостенных углеродных нанотрубок (MWCNTs) в преполимерный раствор GelMA.
2. Сноватите MWCNT-ладена GelMA преполимерный раствор для 1 ч (0,66 Гц, 100 Вт).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса звукоизоляции раствор должен быть погружен в водяную ванну при температуре 15 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить испарение растворителя из-за повышения температуры.

4. Приготовление 1 мг/мл CNT, содержащего 5% предполимерного раствора GelMA

1. Растворите 50 мг GelMA и 5 мг (0,5% от общего раствора) PI в 0,8 мл DPBS при 80 градусах По кв. м в течение 10 мин.
2. Добавьте 0,2 мл подготовленного акционерного раствора CNT (шаг 3). Вихрь и инкубировать раствор при 80 градусах по Цельсию в течение 10 мин.

5. Приготовление 3-(триметоксизил) пропил-метакрилата (TMSPMA) с покрытием стеклянной горки

1. Вымойте стеклянные горки (толщина 1 мм, размер 5,08 см х 7,62 см) с чистым этанолом.
2. Стек очищенные слайды вертикально в 250 мл стакан и распространение 3 мл TMSPMA на них с помощью шприца. Обложка стакан с алюминиевой фольгой для предотвращения испарения TMSPMA.
3. Инкубировать горки в духовке 80 градусов в течение 1 дня.
4. Вымойте покрытые стеклянные слайды, окунув их в чистый этанол, а затем высохнуть.
5. Храните покрытые стеклянные горки, завернутые в алюминиевую фольгу при комнатной температуре (RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь свести к минимуму прикосновение к поверхностям стеклянных горок, покрытых TMSA.

6. Изготовление гибких микроэлектродов АУ

1. Дизайн тени маски с помощью компьютерного дизайна(Дополнительный файл 3).
2. Изготовить и купить маску теней.
3. Вымойте стеклянную горку (толщина 1 мм, размер ю 3 см х 4 см) с ацетоном и высушите сжатой пневмоульной пушкой.
4. Прикрепите маску тени к стеклянным субстратам с помощью двусторонней ленты, затем поместите их в e-луч испаритель и ждать, пока давление камеры достигает по крайней мере 10^-6 Торр.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два куска ленты были размещены вручную на опору на достаточно коротким расстоянии, чтобы разместить стекло и достаточно большой, чтобы соответствовать всему шаблону. Этот шаг занимает около 45-60 мин.
5. Депозит 200 нм толщиной Au слой E-лучей испаритель (например, с Denton EE-4, вакуум No 10^-6 Торр, мощность ю 2,6%, скорость 2 к /с) и сократить изготовленные микроэлектроды с помощью dicing пилы машины (электроды размером 7,38 мм х 8,9 мм х 200 нм).

7. Изготовление микроэлектродной комплексной микроэлектронной гидрогеля Au

ПРИМЕЧАНИЕ: Результатом этой процедуры является мембрана, где микрошаблонированный гидрогель PEGDA находится в нижнем слое, микрошаблонный гидрогель CNT-GelMA находится на вершине, и микроэлектроды Au находятся между двумя слоями. Эта конфигурация обеспечивает лучшую гибкость электрода и ограничивает риск разрушения.

1. Дизайн и изготовление двух фотомасок для создания микрошаблоньированных PEGDA^(1-й фотомаска) и CNT-GelMA гидрогель^(2-й фотомаски) слоев. Смотрите Дополнительный файл 2-3. Конструкция может быть выполнена с помощью программного обеспечения CAD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 2B, E.
2. Поместите 50 мкм прокладки, сделанные путем укладки одного слоя коммерческой невидимой ленты (Толщина: 50 мкм) на TMSPMA покрытием стекла. Налейте 15 зл 20% p3dA преполимерный раствор поверх стекла с покрытием TMSPMA, а затем накройте золотым микроэлектродом. Поместите первую фотомаску для стеклянной горки (микропаттернPEG PEGDA) поверх золотого микроэлектрода и подвергните всю конструкцию ультрафиолетовому свету (200 Вт ртутного пара короткой дуговой лампы с фильтром 320-390 нм) при интенсивности 800 мВт и 8 см расстояния 110 сс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1A.
3. Добавить DPBS окружить стеклянный слайд и отделить микрошаблонированный гидрогель PEGDA вместе с микроэлектродами Au из непокрытого стеклянного субстрата тщательно после 5-10 мин, чтобы получить стеклянную горку, которая имеет микрошаблоньированный гидрогель PEGDA с Au микроэлектроды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1B. Благодаря покрытию TMSPMA конструкция передается из непокрытого стеклянного субстрата в тМС- Отсоедините тщательно, потому что микроэлектроды Au могут легко сломаться во время этого шага(рисунок 3).
4. Поместите 100 мкм прокладки, сделанные путем укладки двух слоев коммерческой прозрачной ленты (толщина 50 мкм) на дне чашки Петри. Депозит капли 20 Л CNT-GelMA преполимерный раствор между прокладками, а затем переверните стеклянную горку, полученную в 7.3 и зафиксировать его на блюдо с клейкой лентой.
5. Поверните устройство вверх дном и поместите^2-ю фотомаску поверх стеклянной горки. Выставляй под ультрафиолетовым светом на 800 мВт интенсивности и 8 см на расстоянии 200 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1C. Выравнивание второй маски имеет важное значение.
6. Вымойте полученные эшафот с DPBS и с клеточной культуры среды, которая включает в себя 10% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS).
7. Оставьте их на ночь в инкубаторе 37 градусов по Цельсию перед посевом клеток.

8. Изоляция и культура неонатального крысиного кардиомиоцита

1. Изолировать сердца от 2-дневного Sprague-Dawley крыс следующие протоколы, утвержденные Комитетом Института по уходу за животными⁸.
2. Положите кусочки сердца на шейкер на ночь (около 16 ч) в 0,05% трипсин без EDTA в HBSS в холодной комнате.
3. Соберите части сердца с пипеткой пушки и свести к минимуму количество трипсина, а затем положить их в 50 мл трубки с 10 мл теплых сердечных носителей (10% FBS, 1% P / S, 1% L-глутамин).
4. Вихрь медленно (60 об/мин) в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 7 мин. Удалите средства массовой информации тщательно из трубки с 10 мл пипетки и оставить части сердца в трубке.
5. Добавьте 7 мл из 0,1% коллагеназа типа 2 в HBSS и закружите в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут.
6. Смешайте с 10 мл пипетки 10x осторожно, чтобы нарушить части сердца. Удалите носители из трубки с помощью пипетки 1 мл.
7. Добавьте 10 мл коллагеназа типа 2 в HBSS и быстро закружайтесь (120–180 об/мин) в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем проверьте, растворяются ли части сердца.
8. Смешайте с 10 мл пипетки, а затем повторить с 1 мл пипетка, чтобы разбить последние части сердца.
9. Как только раствор выглядит однородным, поместите 70 мкм ячейки ситечко на новую трубку 50 мл и пипетки раствор 1 мл в то время, на ситечко.
10. Центрифуги раствор клеток сердца при 180 х г в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если Есть еще некоторые части сердца или слизи, которые не растворяются, повторите шаги 8,7-8,9 снова.
11. Тщательно удалите всю жидкость над клеточной гранулой и повторно наденьте клетки в 2 мл сердечных носителей.
12. Добавьте 2 мл сердечных носителей от стенки трубки тщательно, чтобы повторно приостановить клетки и избежать их разрушения.
13. Добавьте взвешенные клетки в колбу T175 с теплой сердечной каплей.капля за каплей. Положите колбу в инкубатор 37 градусов по Цельсию на 1 ч, чтобы сердечные фибробласты прикрепиться ко дну.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе preplating, сердечные fibroblasts прикрепляют сярторную колбу пока cardiomyocytes останут в средстве подвески.
14. Соберите носители из колбы, которая содержит кардиомиоциты и положить его в трубку 50 мл.
15. Подсчитайте клетки, затем центрифуги на 260 х г в течение 5 мин при 37 градусах По Цельсию.
16. Resuspend и семян клетки на вершине изготовлены мягкий робот в шаге 7. Налейте определенный объем сердечных носителей с кардиомиоцитами в концентрации 1,95 и 10⁶ клеток / мл падение за каплей на всю поверхность устройства.
17. Инкубировать образцы при 37 градусах Цельсия и изменить средства массовой информации с 5 мл клеточной культуры средств массовой информации с 2% FBS и 1% L-глютамин на первый и второй дней после посева. Изменяйте средства массовой информации каждый раз, когда цвет носителя меняется.

9. Клеточное окрашивание для анализа выравнивания

1. Удалите средства массовой информации и мыть с DPBS в течение 5 минут на RT.
2. Исправьте клетки с помощью 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин на RT. Затем мыть с DPBS в течение 5 минут на RT.
3. Инкубировать клетки с 0,1% тритон в DPBS на RT для 1 ч. Вымойте 3x с PBS в течение 5 мин на RT.
4. Инкубировать клетки с 10% козьей сыворотки в DPBS на RT в течение 1 ч.
5. Инкубировать клетки с первичным антителом (саркомерик и коннексин-43) в 10% козьей сыворотки в DPBS при 4 кс для 14-16 ч.
6. Вымойте 3x с DPBS в течение 5 мин на RT. Инкубировать клетки со вторичным антителом в 10% козьей сыворотки в DPBS на RT в течение 1 ч.
7. Вымойте 3x с DPBS в течение 5 минут на RT, затем противопотаные клетки с 4',6-диамидино-2-фенилинол (DAPI) в воде DI (1:1,000) в течение 10 минут на RT. Вымойте 3x с DPBS в течение 5 минут на RT.
8. Возьмите флуоресценции изображения с помощью перевернутого лазерного сканирования конфокальный микроскоп.

10. Тестирование и оценка поведения актуаторов

1. Спонтанное избиение кардиомиоцитов на мягком роботе
   1. Инкубировать биовдохновленные приводы при 37 градусах по Цельсию в течение 5 дней и обновлять носители в день 1 и 2 и при необходимости (т.е. когда средства массовой информации желтеют). Используйте перевернутый оптический микроскоп для ежедневного получения изображений (5x and/or 10x). Запись движения клеток с помощью программного обеспечения захвата видео на живом окне микроскопа для 30 с на 20 кадров в секунду (5x и / или 10x), когда сократительная активность начинается (как правило, около дня 3).
   2. На 5-й день отсоедините мембраны, аккуратно подняв с края крышку горкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки показывают сильное поведение избиения, мембраны будут отделяться сами по себе из-за механического действия сокращений.
2. Массовая электрическая стимуляция сигнала
   1. Используя 3 см расположены PDMS в качестве держателя, прикрепите два электрода углеродного стержня с платиновой (Pt) проволокой в 6-сантиметровом чашке Петри, наполненной сердечными носителями. Затем осторожно перенесите мягкого робота в чашку Петри.
   2. Нанесите квадратную форму волны с шириной 50 мс, dc смещение значение 0 V, и пиковое напряжение амплитуда между 0,5 и 6 V. Частота варьируется от 0,5, 1,0 и 2,0 Гц с циклом пошлины между 2,5%, 5% и 10%, соответственно. Запись макромасштабных сокращений с помощью коммерчески доступной камеры.
3. Электрическая стимуляция с микроэлектродов АУ
   1. После изготовления АУ микроэлектродов интегрированных многослойных гидрогель эшафот, прикрепить два медных проводов к Электродам Au, хотя внешний квадратный порт с использованием серебряной пасты.
   2. Обложка серебряной пасты с тонким слоем PDMS предваряется при 80 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Затем положите образцы на горячую тарелку при 45 градусах по Цельсию в течение 5 ч, чтобы полностью перекрестные PDMS.
   3. После посева кардиомиоцитов нанесите квадратный волновой электрический стимул на медные провода с компенсационным значением DC 1 V, амплитуда пикового напряжения между 1,5 и 5 В и частотами 0,5, 1,0 и 2,0 Гц соответственно.

Результаты

Диаграмма потока шагов для развития Au микроэлектродов-инкорпорированных биовдохновленный мягкий робот
Целью мягкого робота была построение мембраны, способной активировать плавательное движение с минимальной сложностью. Структура должна быть в состоянии поддерживать си...

Обсуждение

Используя этот метод, мы смогли успешно изготовить батоидный рыбоподобный биовдохновленный мягкий робот с интегрированной самоактивирующейся сердечной тканью на многослойной структурированной эшафоте, которая контролируется встроенными микроэлектродами Au. Благодаря двум различн?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL Beaker	PYREX	1000-250CNEa
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma-Aldrich	410896
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Milipore	M6514
37° Water bath	VWR	W6M
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
50mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	14-959-49A
70 µm Cell Strainer	Falcon	352350
80° incubator	VWR	1370GM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Antibiotic/Antimycotic solution	ThermoFisher Scientific	15240062
Anti-Connexin 43/GJAI antibody	Abcam	ab11370	Rabbit polyclonal
Anti-Sarcomeric α-actinin	Abcam	ab9465	Mouse monoclonal
Benchtop Freeze Dryers	Labconco	77500-00 K
Biosafety cabinet	Sterilgard	A/B3
Carbon rod electrodes	SGL Carbon Group	6971105
Centrifuge	Eppendorf	5804
CO2 incubator	Forma Scientific	3110
Collagenase, Type II, Powder	Gibco	17-101-015
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
COOH Functionalized Carbon Nanotubes	NanoLab	PD30L5-20-COOH
Dicing saw machine	Giorgio Technology	DAD-321
DMEM, High Glucose	Gibco	11-965-118
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-144
E-beam evaporator	CHA	57367
Fetal Bovine Serum	Gibco	10-437-028
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Type B, 300 bloom from porcine skin
Glass slide	VWR	48382-180
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red	Gibco	14-175-079
Inverted optical microscope	Olympus	CK40
Magnetic hotplate	Corning	PC-420
methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276695	Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor
Nunc EasYFlask 175cm2	ThermoFisher Scientific	159910
Olicscope	Siglent	SDS1052DL+
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	Electron Microscopy Sciences	15710
PDMS SYLGARD 184	Sigma-Aldrich	761036
Photomask	Mini micro stencil inc
Platinum wire	Alfa Aesar	AA43014BU
Polyethylene glycol dimethcrylate	Polysciences Inc.	15178-100
Regenerated Cellulose Dialysis Tubing	Fisherbrand	21-152-14
Silver Epoxy Adhesive	MG Chemicals	8330S
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	S2GPU02RE
Ultra sonicator	Qsonica	Q500
UV Curing System	OmniCure	S2000
Vortex mixer	Scientific Industry	SI-0246A
Waveform generator	Agilent	33500B
Wrap Aluminium foil	Reynolds	N/A