Robô macio bioinspirado com microeletrodos incorporados

Resumo

Um andaime bioinspirado é fabricado por uma técnica de fotolitografia macia usando hidrogéis mecanicamente robustos e eletricamente condutores. Os hidrogéis micropadronizados fornecem alinhamento direcional das células cardiomiócitos, resultando em uma direção personalizada de atuação. Microeletrodos flexíveis também são integrados ao andaime para trazer controle elétrico para um tecido cardíaco auto-atuante.

Resumo

Sistemas robóticos macios bioinspirados que imitam organismos vivos usando tecido muscular projetado e biomateriais estão revolucionando o paradigma atual da biorobótica, especialmente na pesquisa biomédica. Recriar dinâmica suação artificial semelhante à vida é crucial para um sistema robótico suave. No entanto, o controle preciso e a sintonia do comportamento de atuação ainda representam um dos principais desafios dos sistemas robóticos macios modernos. Este método descreve um procedimento de baixo custo, altamente escalável e fácil de usar para fabricar um robô macio eletricamente controlável com movimentos semelhantes à vida que é ativado e controlado pela contração de tecido muscular cardíaco em uma picada micropadronizada andaime de hidrogel como raios. O uso de métodos de fotolitografia macia torna possível integrar com sucesso vários componentes no sistema robótico macio, incluindo andaimes à base de hidrogel micropadronizados com nanotubos de carbono (CNTs) embutidos de gelatina (CNT-GelMA), diacrito de poli(etileno glicol) (PEGDA), microeletrodos flexíveis de ouro (Au) e tecido muscular cardíaco. Em particular, o alinhamento dos hidrogéis e o micropadrão são projetados para imitar a estrutura muscular e cartilagem do raio de picada. O hidrogel CNT-GelMA eletricamente condutor age como um andaime celular que melhora o comportamento de maturação e contração de cardiomiócitos, enquanto o hidrogel PEGDA mecanicamente robusto fornece suporte estrutural semelhante à cartilagem para todo o robô macio. Para superar a natureza dura e frágil dos microeletrodos à base de metal, projetamos um padrão serpentino que tem alta flexibilidade e pode evitar dificultar a dinâmica de espancamento dos cardiomiócitos. Os microeletrodos Au flexíveis incorporados fornecem estimulação elétrica em todo o robô macio, facilitando o controle do comportamento de contração do tecido cardíaco.

Introdução

Robôs macios modernos de última geração podem imitar as estruturas hierárquicas e a dinâmica muscular de muitos organismos vivos, como a água-viva^1,2, raio de picada^2,polvo^3,bactérias⁴, e^esperma5. Imitar a dinâmica e a arquitetura dos sistemas naturais oferece maiordesempenho em termos de eficiência energética e estrutural⁶. Isso está intrinsecamente relacionado à natureza macia do tecido natural (por exemplo, tecido de pele ou músculo com o módulo de um Jovem entre 10^{4 -109} Pa) que permite graus mais elevados de liberdade e deformação superior e adaptabilidade quando comparado com atuadores projetados padrão (por exemplo, um módulo de Jovem geralmente entre 10⁹-10¹² Pa)⁶. Atuadores macios à base de músculos cardíacos, especialmente, mostram eficiência energética superior devido à sua auto-atuação, bem como seu potencial de autoreparo e regeneração quando comparados a um sistema robótico de base mecânica⁷. No entanto, a fabricação de robôs macios é desafiadora devido à necessidade de integrar diferentes componentes com diferentes propriedades físicas, biológicas e mecânicas em um único sistema. Por exemplo, sistemas sintéticos projetados precisam ser integrados com sistemas biológicos vivos, não apenas fornecendo-lhes suporte estrutural, mas também influenciando e modulando seu comportamento de atuação. Além disso, muitos métodos de microfabricação requerem processos e produtos químicos severos/citotóxicos que diminuem a viabilidade e a função de quaisquer componentes vivos. Portanto, novas abordagens são necessárias para melhorar a funcionalidade dos robôs macios e controlar e modular seu comportamento.

Para integrar com sucesso componentes vivos com boa viabilidade, um andaime à base de hidrogel é um excelente material para criar o corpo de um robô macio. As propriedades físicas e mecânicas de um hidrogel podem ser facilmente sintonizadas para criar microambientes para componentes vivos, como tecidos musculares^8,9. Além disso, pode facilmente adotar várias técnicas de microfabricação, resultando na criação de estruturas hierárquicas com alta fidelidade^1,2,10. Dispositivos eletrônicos flexíveis podem ser incorporados ao robô macio para controlar seu comportamento com estimulação elétrica. Por exemplo, técnicas optogenéticas para projetar células eletrogênicas (por exemplo, cardiomiócitos), que mostram uma ativação eletrofisiológica dependente da luz, têm sido usadas para desenvolver um raio de picada robótico macio baseado em polidimetilexino (PDMS) guiado pela luz que foi capaz de recriar o movimento undulatório do peixe in vitro². Embora as técnicas optogenéticas tenham mostrado excelente controle, o trabalho apresentado utiliza estimulação elétrica, um método convencional e tradicional de simulação. Isso porque a estimulação elétrica através de microeletrodos flexíveis é fácil e simples em comparação com técnicas optogenéticas, que requerem extensos processos de desenvolvimento¹¹. O uso de dispositivos eletrônicos flexíveis pode permitir estimulação a longo prazo e processos de fabricação padrão/simples, bem como biocompatibilidade tunable e propriedades físicas e mecânicas^12,13.

Aqui, apresentamos um método inovador para fabricar um robô macio bioinspirado, acionado pela batida de tecido muscular cardíaco projetado e controlado por estimulação elétrica através de microeletrodos Au flexíveis incorporados. O robô macio foi projetado para imitar a estrutura muscular e cartilagem do raio de picada. O raio de picada é um organismo com uma estrutura e movimento relativamente fáceis de imitar em comparação com outras espécies de natação. Os músculos são recriados in vitro por sedar cardiomiócitos em um micropadrão de hidrogel eletricamente condutor. Como relatado anteriormente, incorporar nanopartículas eletricamente condutoras como a CNT no hidrogel GelMA não só melhora o acoplamento elétrico do tecido cardíaco, mas também induz uma excelente arquitetura e arranjo de tecido in vitro^8,9. As articulações de cartilagem são então imitadas usando um padrão de hidrogel PEGDA mecanicamente robusto que age como o substrato mecanicamente robusto de todo o sistema. Microeletrodos Au flexíveis com padrão serpentino estão incorporados no padrão PEGDA para estimular local e eletricamente o tecido cardíaco.

Protocolo

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações no Guia de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) de Brigham e Hospital da Mulher.

1. Síntese gelMA

1. Dissolva 10 g de gelatina em 100 mL do salo tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) usando um agitador magnético a 50 °C.
2. Adicione 8 mL de anidrito metocrílico lentamente enquanto mexe a solução pré-polímero de gelatina a 50 °C por 2 h. Diluir a solução de gelatina reaquecida com DPBS pré-aquecido a 50 °C.
3. Transfira a solução diluída para membranas de diálise (corte de peso molecular = 12-14 kDa) e coloque-as em água deionizada (DI). Faça diálise a 40 °C por cerca de 1 semana.
4. Filtrar a solução de pré-polímero GelMA dialado usando um filtro estéril (tamanho do poro = 0,22 μm) e transfira 25 ou 30 mL da solução para tubos de 50 mL e armazene a -80 °C por 2 dias.
5. Congele a solução pré-polímero gelma congelada usando um secador de congelamento por 5 dias.

2. Preparação da solução pré-polímero poli(etileno glicol) (PEGDA)

1. Dissolver 200 mgs (20% da solução total) de PEGDA (MW = 1.000) com 5 mg (0,5% da solução total) de 2-hidroxi-4-(2-hidroxyethoxy)-2-metilpropiophenona (foto-iniciador, PI) em 1 mL de DPBS.
2. Incubar a solução pré-polímero a 80 °C por 5 min.

3. Preparação da solução de estoque dispersa CNT revestida de GelMA

1. Dissolva 80 mg de GelMA (usado como biosurfactante) em 4 mL de DPBS e, em seguida, adicione 20 mg de nanotubos de carbono multiparedeizados de COOH (MWCNTs) na solução pré-polímero GelMA.
2. Sonicate a solução pré-polímero GelMA carregada de MWCNT por 1 h (0,66Hz, 100 Watt).
   NOTA: Durante o processo de sonsoação, a solução deve ser imersa em um banho de água a ~15 °C para evitar a evaporação do solvente devido ao aumento da temperatura.

4. Preparação de 1 mg/mL CNT contendo solução pré-polímero GelMA de 5%

1. Dissolver 50 mg de GelMA e 5 mgs (0,5% da solução total) de PI em 0,8 mL de DPBS a 80 °C para 10 min.
2. Adicione 0,2 mL da solução de ações CNT preparada (passo 3). Vórtice e incubar a solução a 80 °C por 10 min.

5. Preparação de um tocracrito revestido de 3(trimethoxysilyl)propyl (TMSPMA)

1. Lave os slides de vidro (espessura = 1 mm, tamanho = 5,08 cm x 7,62 cm) com etanol puro.
2. Empilhe os slides limpos verticalmente em um béquer de 250 mL e espalhe 3 mL de TMSPMA em cima deles usando uma seringa. Cubra o béquer com papel alumínio para evitar a evaporação do TMSPMA.
3. Incubar os slides em um forno de 80 °C por 1 dia.
4. Lave os slides de vidro revestidos mergulhando-os em etanol puro, depois seque.
5. Guarde os slides de vidro revestidos envoltos em papel alumínio à temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Tente minimizar o toque nas superfícies dos slides de vidro revestidos de TMSPMA.

6. Fabricação dos microeletrodos Au flexíveis

1. Projete uma máscara de sombra usando design auxiliado por computador (Arquivo Complementar 3).
2. Fabricar e comprar uma máscara de sombra.
3. Lave o escorregador de vidro (espessura = 1 mm, tamanho = 3 cm x 4 cm) com acetona e seque com uma pistola de ar comprimida.
4. Conecte a máscara de sombra aos substratos de vidro usando fita dupla lateral, em seguida, coloque-as em um evaporador de feixe eletrônico e espere até que a pressão da câmara atinja pelo menos 10^-6 Torr.
   NOTA: As duas fitas foram colocadas manualmente no suporte a uma distância curta o suficiente para hospedar o vidro e grandes o suficiente para se adequar em todo o padrão. Este passo leva em torno de 45-60 min.
5. Deposite uma camada Au de 200 nm de espessura por evaporador de feixe eletrônico (por exemplo, com Denton EE-4, vácuo = 10^-6 Torr, potência = 2,6%, taxa = 2 Å/s) e corte os microeletrodos fabricados usando uma máquina de serra de dicing (tamanho eletrodos = 7,38 mm x 8,9 mm x 200 nm).

7. Fabricação de um andaime multicamada sed multicamadas integrado a ua

NOTA: O resultado deste procedimento é uma membrana onde um hidrogel PEGDA micropadronizado está na camada inferior, um hidrogel CNT-GelMA micropadronizado está por cima, e os microeletrodos Au estão entre as duas camadas. Essa configuração garante uma melhor flexibilidade ao eletrodo e limita o risco de quebra.

1. Projete e forje duas máscaras fotográficas para criar as camadas PEGDA^(1ª fotomáscara) micropadronizadas e as camadas de hidrogel CNT-GelMA (fotomáscara 2^nd). Consulte o Arquivo Suplementar 2-3. O design pode ser feito usando o software CAD.
   NOTA: Veja figura 2B, E.
2. Coloque espaçadores de 50 μm feitos empilhando uma camada de fita invisível comercial (Espessura: 50 μm) em um vidro revestido TMSPMA. Despeje 15 μL de 20% de solução de pré-polímero PEGDA em cima do vidro revestido TMSPMA e cubra com microeletrodo dourado. Coloque a 1ª fotomáscara para o slide de vidro (PEGDA micropadronizado) em cima do microeletrodo dourado e exponha toda a construção à luz UV (200 W vapor de lâmpada de arco curto vapor de mercúrio com filtro de 320-390 nm) a 800 mW de intensidade e 8 cm de distância para 110 s.
   NOTA: Veja a Figura 1A.
3. Adicione DPBS para cercar o escorregador de vidro e desative o hidrogel PEGDA micropadronizado junto com os microeletrodos Au do substrato de vidro não revestido cuidadosamente após 5-10 min para obter o slide de vidro que tem o hidrogel PEGDA micropadronizado com o Au microeletrodos.
   NOTA: Veja a Figura 1B. Devido ao revestimento TMSPMA, a construção é transferida do substrato de vidro não revestido para o tmspma revestido. Desapare-se cuidadosamente porque os microeletrodos Au podem quebrar facilmente durante esta etapa (Figura 3).
4. Coloque 100 μm espaçadores feitos empilhando duas camadas de fita transparente comercial (espessura = 50 μm) na parte inferior de uma placa de Petri. Deposite uma gota de 20 μL SOLUÇÃO pré-polímero CNT-GelMA entre os espaçadores e, em seguida, gire o slide de vidro obtido em 7.3 e fixe-o no prato com fita adesiva.
5. Gire o dispositivo de cabeça para baixo e coloque a fotomáscara de 2^nd em cima do slide de vidro. Expor luz UV a 800 mW de intensidade e 8 cm de distância para 200 s.
   NOTA: Veja a Figura 1C. O alinhamento da 2ª máscara é importante.
6. Lave o andaime obtido com DPBS e com meio de cultura celular que inclui 10% de soro bovino fetal (FBS).
7. Deixe-os durante a noite na incubadora de 37 °C antes de semear as células.

8. Cardiomiócitos de ratos neonatais isolamento e cultura

1. Isolar corações de ratos sprague-dawley de 2 dias de idade seguindo protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais⁸do Instituto .
2. Coloque as peças do coração no shaker durante a noite (cerca de 16 h) em 0,05% de trypsin sem EDTA no HBSS em uma sala fria.
3. Colete os pedaços do coração com uma arma de pipeta e minimize a quantidade de trippsina, em seguida, coloque-os em um tubo de 50 mL com 10 mL de mídia cardíaca quente (10% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamina).
4. Redemoinho lentamente (~60 rpm) em um banho de água de 37 °C por 7 min. Remova a mídia cuidadosamente do tubo com uma pipeta de 10 mL e deixe as peças do coração no tubo.
5. Adicione 7 mL de 0,1% coloagenase tipo 2 em HBSS e gire em um banho de água de 37 °C por 10 min.
6. Misture com uma pipeta de 10 mL 10x suavemente para interromper as peças do coração. Remova a mídia do tubo com uma pipeta de 1 mL.
7. Adicione 10 mL de 0,1% coloagenase tipo 2 em HBSS e gire rapidamente (~120-180 rpm) em um banho de água de 37 °C por 10 min, em seguida, verifique se as peças do coração estão se dissolvendo.
8. Misture com uma pipeta de 10 mL, depois repita com uma pipeta de 1 mL para quebrar as últimas peças do coração.
9. Uma vez que a solução pareça homogênea, coloque um filtro de célula de 70 μm em um novo tubo de 50 mL e pipeta a solução 1 mL de cada vez no filtro.
10. Centrífuga a solução de células cardíacas em 180 x g por 5 min a 37 °C.
    NOTA: Se ainda houver alguns pedaços de coração ou muco que não se dissolveram, repita os passos 8.7-8.9 novamente.
11. Remova cuidadosamente todo o líquido acima da pelota celular e resuspendeu as células em 2 mL de mídia cardíaca.
12. Adicione 2 mL de mídia cardíaca da parede do tubo cuidadosamente para resuspender as células e evite quebrá-las.
13. Adicione as células suspensas em um frasco T175 com queda de mídia cardíaca quente por queda. Coloque o frasco em uma incubadora de 37 °C por 1 h para permitir que fibroblastos cardíacos se conectem à parte inferior.
    NOTA: Nesta etapa de pré-plating, os fibroblastos cardíacos se ligarão ao frasco enquanto os cardiomiócitos permanecerão no meio de suspensão.
14. Colete a mídia do frasco que contém os cardiomiócitos e coloque-o em um tubo de 50 mL.
15. Conte as células, depois centrífuga sem 260 x g por 5 min a 37 °C.
16. Resuspender e semea as células em cima do robô macio fabricado na etapa 7. Despeje volume específico de mídia cardíaca com os cardiomiócitos a uma concentração de 1,95 × 10⁶ células/mL queda por queda em toda a superfície do dispositivo.
17. Incubar as amostras a 37 °C e mudar a mídia com 5 mL cell culture media com 2% FBS e 1% L-glutamina no primeiro e no segundo dias após a semeação. Mude a mídia toda vez que a cor da mídia muda.

9. Coloração celular para análise de alinhamento

1. Remova a mídia e lave com DPBS por 5 min na RT.
2. Fixar as células usando 4% de paraformaldeído (PFA) por 20 min na RT. Em seguida, lave com DPBS por 5 min na RT.
3. Incubar as células com 0,1% de tritão em DPBS na RT por 1h. Lave 3x com PBS por 5 min na RT.
4. Incubar as células com 10% de soro de cabra na DPBS na RT por 1h.
5. Incubar as células com um anticorpo primário (sarcomeric α-actinin e connexin-43) em 10% de soro de cabra em DPBS a 4 °C por ~14-16 h.
6. Lave 3x com DPBS por 5 min na RT. Incubar as células com o anticorpo secundário em 10% de soro de cabra em DPBS na RT por 1 h.
7. Lave 3x com DPBS por 5 min na RT, depois contra-manchas com 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em água DI (1:1.000) por 10 min na RT. Wash 3x com DPBS por 5 min na RT.
8. Tire imagens de fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser invertido.

10. Teste de actuator e avaliação de comportamento

1. Espancamento espontâneo dos cardiomiócitos no robô macio
   1. Incubam atuadores bioinspirados a 37 °C por 5 dias e atualizem a mídia nos dias 1 e 2 e quando necessário (ou seja, quando a mídia fica amarela). Use um microscópio óptico invertido para tirar imagens diariamente (5x e/ou 10x). Movimentos de células recordes usando software de captura de vídeo na janela ao vivo do microscópio por 30 s a 20 quadros por segundo (5x e/ou 10x) quando a atividade contraída começa (geralmente por volta do dia 3).
   2. No dia 5, desapego as membranas levantando suavemente da borda com um slide de tampa.
      NOTA: Se as células apresentarem um forte comportamento de espancamento, as membranas se desprenderão sozinhas devido à ação mecânica das contrações.
2. Estimulação de sinal elétrico a granel
   1. Usando um PDMS espaçado de 3 cm como suporte, afixadois eletrodos de barras de carbono com fio platina (Pt) em uma placa petri de 6 cm cheia de mídia cardíaca. Em seguida, transfira cuidadosamente o robô macio para a placa de Petri.
   2. Aplique uma forma de onda quadrada com largura de pulso de 50 ms, dc offset value 0 V e amplitude de tensão de pico entre 0,5 e 6 V. A frequência varia entre 0,5, 1,0 e 2,0 Hz com ciclo de plantão entre 2,5%, 5% e 10%, respectivamente. Grave contrações de macroescala usando uma câmera comercialmente disponível.
3. Estimulação elétrica com os microeletrodos Au
   1. Após a fabricação de andaimes multicamadas multicamadas integrados a microeletrodos au, conecte dois fios de cobre aos eletrodos Au, embora uma porta quadrada externa usando pasta de prata.
   2. Cubra a pasta prateada com uma fina camada de PDMS precurada a 80 °C por 5 min. Em seguida, coloque as amostras em uma placa quente a 45 °C por 5 h para cruzar totalmente o PDMS.
   3. Após semear cardiomiócito, aplique um estímulo elétrico de ondas quadradas nos fios de cobre com o valor de deslocamento DC 1 V, amplitude de tensão máxima entre 1,5 e 5 V, e frequências de 0,5, 1,0 e 2,0 Hz, respectivamente.

Resultados

Diagrama de fluxo dos passos para o desenvolvimento do robô macio bioinspirado de microeletrodo incorporado a ua
O objetivo do design de robôs macios era construir uma membrana capaz de atuar um movimento de natação com mínima complexidade. A estrutura deve ser capaz de sustentar fortes flexões repetidamente ao longo do tempo (cerca de 1 Hz) e ser capaz de manter sua forma enquanto alcança uma forte batida. Ao cruzar seletivamente o polímero usando fotomáscaras, fabricamos um andaime hierárq...

Discussão

Usando este método, conseguimos fabricar com sucesso um robô macio bioinspirado em peixes batoides com um tecido cardíaco auto-atuante integrado em um andaime estruturado multicamadas que é controlado por microeletrodos Au incorporados. Devido a duas camadas distintas de hidrogel micropadronizado feitas de hidrogéis PEGDA e CNT-GelMA, o andaime bioinspirado mostrou boa estabilidade mecânica e alinhamento e maturação celular ideal. A camada padrão PEGDA, que serve como uma articulação de cartilagem da arquitetu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL Beaker	PYREX	1000-250CNEa
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma-Aldrich	410896
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	Milipore	M6514
37° Water bath	VWR	W6M
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
50mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	14-959-49A
70 µm Cell Strainer	Falcon	352350
80° incubator	VWR	1370GM
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11037
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Antibiotic/Antimycotic solution	ThermoFisher Scientific	15240062
Anti-Connexin 43/GJAI antibody	Abcam	ab11370	Rabbit polyclonal
Anti-Sarcomeric α-actinin	Abcam	ab9465	Mouse monoclonal
Benchtop Freeze Dryers	Labconco	77500-00 K
Biosafety cabinet	Sterilgard	A/B3
Carbon rod electrodes	SGL Carbon Group	6971105
Centrifuge	Eppendorf	5804
CO2 incubator	Forma Scientific	3110
Collagenase, Type II, Powder	Gibco	17-101-015
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
COOH Functionalized Carbon Nanotubes	NanoLab	PD30L5-20-COOH
Dicing saw machine	Giorgio Technology	DAD-321
DMEM, High Glucose	Gibco	11-965-118
DPBS without Calcium and Magnesium	Gibco	14-190-144
E-beam evaporator	CHA	57367
Fetal Bovine Serum	Gibco	10-437-028
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Type B, 300 bloom from porcine skin
Glass slide	VWR	48382-180
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red	Gibco	14-175-079
Inverted optical microscope	Olympus	CK40
Magnetic hotplate	Corning	PC-420
methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	276695	Contains 2,000ppm topanol A as inhibitor
Nunc EasYFlask 175cm2	ThermoFisher Scientific	159910
Olicscope	Siglent	SDS1052DL+
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16%	Electron Microscopy Sciences	15710
PDMS SYLGARD 184	Sigma-Aldrich	761036
Photomask	Mini micro stencil inc
Platinum wire	Alfa Aesar	AA43014BU
Polyethylene glycol dimethcrylate	Polysciences Inc.	15178-100
Regenerated Cellulose Dialysis Tubing	Fisherbrand	21-152-14
Silver Epoxy Adhesive	MG Chemicals	8330S
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System	Millipore	S2GPU02RE
Ultra sonicator	Qsonica	Q500
UV Curing System	OmniCure	S2000
Vortex mixer	Scientific Industry	SI-0246A
Waveform generator	Agilent	33500B
Wrap Aluminium foil	Reynolds	N/A