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要約

ショウジョウバエのアルコール感受性を測定する現在の方法は、ハエの群をテストするように設計されています。多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイを提供します。この方法は特殊なツールを必要とせず、共通の材料を使用して任意の研究室で行うことができます。

要約

ショウジョウバエメラノガスターは、アルコール感受性の遺伝的基盤を研究するための優れたモデルを提供します。ヒト集団の研究とは対照的に、ショウジョウバエモデルは遺伝的背景を厳密に制御することができ、同じ遺伝子型の事実上無制限の個体数は、規制上の制限なしに比較的低コストで十分に制御された環境条件下で迅速に飼育することができる。エタノールにさらされたハエは、姿勢制御の喪失、沈下、耐性の発達など、ヒトのアルコール中毒に似た生理学的および行動的変化を受ける。ここでは、多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイについて説明する。このアッセイは、アルコール暴露の同期開始を可能にするセットアップで、24ウェル細胞培養プレートに麻酔なしで導入された単一のハエのビデオ録画に基づいています。このシステムにより、1人の人が8時間の作業期間内に2,000個ものハエに対して個々のエタノール沈めデータを収集することができます。アッセイは、原則として、任意の揮発性物質への暴露の影響を評価するために拡張することができ、他のフライ種を含む他の昆虫に対する揮発性の急性毒性の影響を測定するために適用することができる。

概要

アルコール乱用・アルコール依存症研究所は、2015年に「アルコール使用障害」に指定された過度のアルコール摂取が米国の推定1600万人に影響を与えたと報告しています。アルコール乱用は、有害な生理学的影響の広い範囲を引き起こし、米国の主要な死因である。ヒトにおいて、感受性の低下、またはアルコールに対する応答の低レベルは、強力な遺伝要素を有し、アルコール使用障害11、2、3、42,3,4を発症するリスクが高いと関連している。ヒト集団の遺伝的リスク研究は、集団混和、多様な発達履歴および環境暴露、および他の神経精神状態としばしば混乱しているアルコール関連の型を定量化するための自己報告されたアンケートへの依存のために困難である。

ショウジョウバエメラノガスターは、,アルコール感受性5、6、7、86の遺伝的基盤を5研究するための優れたモデル7を8提供します。ショウジョウバエモデルは遺伝的背景を厳密に制御することができ、同じ遺伝子型の事実上無制限の個体数は、規制上の制限なしに比較的低コストで十分に制御された環境条件下で迅速に飼育することができます。ゲノム中の遺伝子の大部分を標的とする一般に入手可能な突然変異およびRNAiラインに加えて、完全なゲノム配列を有する205の近交系野生由来株の集団であるショウジョウバエメラノガスター遺伝基準パネル(DGRP)の入手可能性は、ゲノム全体の関連研究9,1010を可能にした。9このような研究は、エタノール11、12,への発達暴露時の発達時間および生存可能性への影響に関連する遺伝的ネットワークを同定した。基本的な生物学的プロセスの進化的な保全は、彼らの飛行の相手に人間の正射手を重ね合わせることによって翻訳推論を描くことを可能にする。

エタノールにさらされたハエは、姿勢制御8の喪失、沈下、及び耐性13、14、15,14の発達を含む、ヒトアルコール中毒に似た生理学的および行動的変化を15受ける。ショウジョウバエにおけるアルコール誘発性沈着は、インエブリオメーターを用いて定量することができる。,これらは、ハエが16、17、18を付けることができる斜めのメッシュパーティションを持つ122,17cmの長さの垂直ガラス柱です。少なくとも50個のハエのグループ(男女は別々に分析することができる)がカラムの上部に導入され、エタノール蒸気にさらされる。姿勢制御を失うハエは柱を通って落下し、1分間隔で収集されます。平均溶出時間は、アルコール中毒に対する感受性の尺度として機能する。ハエが最初の暴露から回復した後に2度目にアルコールにさらされると、平均溶,出時間13、15、19、2015,19のシフトから明らかなように、耐性を開発することができます。1320非,滑計アッセイは、アルコール沈め感受性および耐性12、13、14、21の発達に関連する遺伝子、遺伝的ネットワーク12,13、14および細胞経路の同定につながっているのに対し、アッセイは時間がかかり、低スループットであり、単一のハエにおけるアルコール感受性を測定するのに効果がない。21

精巧な不エブリオメーターのセットアップを必要としない代替エタノール沈積アッセイは、より便利な測定を可能にするが、スループットに依然として制限されており、一般的に個人21、22、23、24、25ではなくハエ群の分析21,22,23,24を25必要とする。単一のハエを評価すると、社会的行動に起因するグループ相互作用による交音効果の可能性を最小限に抑えることができます。ここでは、多数の単一ハエにおけるアルコール沈殿感度を評価するための、シンプルで低コストで高スループットのアッセイを提示します。

プロトコル

1. 試験装置の構築

  1. 段ボールのプレートの周りをトレースし、指定された領域を切り取ることによって、24ウェル細胞培養プレートのサイズの段ボールテンプレートを作成します。
  2. ステップ1.1の段ボールテンプレートを使用して、細胞培養板の大きさをメッシュする小さな昆虫スクリーンの部分をカットします。
  3. 熱い接着剤銃を使用してプレートの上部の周囲に熱い接着剤の小さなラインを配置し、開いた井戸の上にスクリーンメッシュを貼り付けることで、24ウェルの細胞培養プレートを準備します。
  4. 熱い接着剤銃を使用してステップ1.3から同じ細胞培養板の3つの側面のそれぞれに木製のクラフトスティックを固定します。変更された細胞培養プレートは、図 1Aと図2に示す実験用の設定に示すプレート図のようになります。
    注:少なくとも撮影室に収まる限り多くの細胞培養プレートを準備してください(下記参照)。

figure-protocol-581
図1:試験装置と撮影室の図。(A) 上部図。試験装置の上面、側面、および前面図がそれぞれ示されている。スクリーンメッシュは、24ウェルの細胞培養プレートの上に平らに横たわります。矢印で表される木製のクラフトスティックは、安定性とアライメントの援助のために3つの隣接する側面に取り付けられ、6つの井戸と4つの井戸を備えたプレートの側面に2つ付いています。すべての添付ファイルは、装置に熱く接着されています。(B) 下図アッセイの設定の上、側面、および前面の図がそれぞれ示されています。ボックスの右側に、蓋の開口部から開口部の背面まで、スリットレベルの底部から内側の表面までスリットがカットされます。ボックスの上部の穴は、地面に平行な表面が、最大のビデオ露出のために中心に配置されています。シェーディングボックスはビデオカメラを表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-1272
図2:アッセイシステムの写真。ビデオカメラはポリスチレンチャンバーの上に置かれ、レンズは切り抜き穴に挿入され、図1Bの図に示す。2組の修飾された24ウェル細胞培養プレートは、チャンバーの側面を通してスリットに挿入される照明パッドの上に置かれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 撮影室の建設

  1. ポリスチレンボックスの側面にあるビデオカメラレンズの大きさの穴を切断して、撮影室を作成します。ポリスチレンボックスの反対側の照明パッドの幅を追加スリットカットします。撮影室は、図1Bと図2に示す撮影室に似ているはずです。
  2. 照明パッドをスリットに挿入し、カメラを照明パッドの上のレンズホールに配置して、使用するための撮影室を準備します。
  3. すべての材料を配置し、制御された環境ですべての後続のテストを実行します, 好ましくは、約 30% 湿度、25 °C温度、均一な気流、および65 dB 未満の騒音レベルを持つ行動室.

3. 試験装置とハエの準備

  1. ピペット1mLの100%エタノールをスクリーンメッシュを通して各ウェルに入った。
  2. チーズクロスでスクリーンメッシュを乾かします。
  3. ステップ 1.1 で作成した段ボールテンプレートを使用して、細胞培養プレートの寸法にチーズクロスを 2 個カットします。ステップ3.2からエタノールを含む改変細胞培養板の乾燥スクリーンメッシュの上に置く。
  4. ステップ1.1で作成した段ボールテンプレートを一般的なガイドとしてトレースし、短い側面の1つでトレース領域を1〜2cm拡大することにより、薄くて柔軟なプラスチック製のまな板を作成します。薄く、柔軟なプラスチック製のまな板から拡張されたトレース領域を切り取ります。切断後、プラスチックが試験装置の3本の木製の工芸スティックの間に収まるようにしますが、1~2cmで片方の端に掛かっていることを確認してください。
  5. (オプション)吸引器を作成する必要がある場合は、最初にP1000ピペットチップを半分に切断して、図3に示すような吸引器を組み立てます。マウスピースとして機能する柔軟なチューブの〜30センチメートルの一端に大きな直径を持つ部分を挿入します。

figure-protocol-2747
図3:ハエがフレキシブルチューブに取り付けられた交換可能なマウスピースと綿ガーゼストッパー付きの広いボア血清学的ピペットで収集されるフライ吸引器。オペレータは麻酔なしで移動するためにピペットに単一のフライを吸引することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

  1. (オプション)吸引体アセンブリを完了するには、10cmの血清ピペットの広い端をガーゼで覆い、ハエがチューブに入るのを防ぎ、ピペット、ガーゼを最初にチューブの開いた端に挿入してフライチャンバーとして機能させます。アスピレーターは図 3に示すようなはずです。
  2. アスピレーター(図3、ステップ3.5および3.6)を用いて、1つのフライを別の24ウェル細胞培養プレートに吸引する。以前に吸引されたハエを含む井戸をカバーするために柔軟なプラスチックを使用してください。各フライのウェル位置と関連する遺伝子型または表現型情報を記録します。
  3. ハエを含む細胞培養プレートの上部にフレキシブルなプラスチックフラッシュを保持して、逃げ出を防ぎ、エタノールで改変された細胞培養プレートの上部にプレートを反転させます。柔軟なプラスチックのシートは、チーズクロスのシートの上に置く必要があります。クラフトスティックを使用してハエを含む反転細胞培養プレートを整列させ、エタノールで各井戸がハエを含む各ウェルに整列するようにします。
  4. 実験用のセットアップは図 2のようになります。

4. ハエのテスト

  1. 最大の視覚コントラストのために、照明パッドが完全な明るさで点灯していることを確認します。ビデオカメラで録画を開始します。
  2. ハエをエタノールにさらすために、チーズクロスを外さないで注意して、ウェルプレートと試験装置の間からプラスチックを慎重に取り除いてください。
  3. すべてのハエが姿勢制御を失ったら、ビデオ録画を終了します。すべてのハエが姿勢制御を失ったと疑われる場合は、プレートの中央をしっかりとタップして、すべてのハエが姿勢制御を完全に失うことを確認します。動きがある場合は、記録を続けます。動きが起こらないまで、定期的に(1~2分ごとに)タップを続けます。
  4. (オプション)ハエを素早く回収するには、テスト装置から天板だけを取り出し、チーズクロスの上で休んでいる鎮静したハエを明らかにする。吸引個々のハエは、回復のために選択された容器に飛びます。
  5. 改変細胞培養プレート内のエタノールを1mLの新鮮な100%エタノールに置き換え、エタノールの蒸発と加湿を制御し、アッセイ全体で一貫したエタノール暴露を維持します。チーズクロスでスクリーンメッシュを乾燥させます。
  6. 必要な数のサンプルに対して繰り返します。
    注: 最高のスループットを得る場合は、次のラウンドのハエをビデオ録画中に新しい細胞培養プレートに吸引します。ビデオ録画は後で確認できるため、プロトコルはここで一時停止できます。

5. フライセドレーション時間の決定

  1. ビデオ録画を見て、個々のフライの録音セドレーション時間。沈め時間は、ハエが完全な姿勢制御と運動能力を失う瞬間として定義されます。逆にフィルムを見て、精度を確保するために、フライが動き始める時間を記録することをお勧めします。

結果

2つの24ウェルマイクロタイタープレートは、わずか10分以内に48個の個々のハエで同時にデータを生成することができます。 13ラインRAL_555のハエは、ラインRAL_177よりも感度が低かった (図 4、表 2; p < 0.0001、ANOVA)。RAL_177の男性と女性は性的に二相性の効果を示さなかった(図4、表2;p>0.1、ANOVA)、ラインRAL_555の女性は男性よりもエタノール暴露に対する感受性が低かった(図4、表2;p<0.006、ANOVA)。同時に測定できるハエの数が多く、男女や異なる線を同時に測定する能力は、環境変動による誤差を減らすことで精度を高めることができます。

A。エタノールセドレーション時間(複数可)B。エタノールセドレーション時間(複数可)
女性男性女性男性
414365477423568309937742622460331498
201384498411523626791619197467455562
228364333440403267504744513570582506
440416404408422384970540369865533492
888283285322369287595550606392544345
1079519315393376284418709553308477388
718287432275206411366564558385576377
598337398279631372437692578460511412
241398364347374808665729484532425354
229423534386396628312576305334531506
388488451523322533682638420560548379
2525293754273305401045741708832509472
674401303401307311394675381477449784
303453351429525262540690520556495226
258483302389562319356615336454524590
346426385416596287626678840634677509

表1:エタノールのセレーション時間(A)DGRPs線の個々のハエの測定(a)DGRPラインRAL_177と(B)RAL_555別々の男女(n =48)。.表2、図 4も参照してください。

figure-results-4989
図4:DGRPラインのアルコール沈RAL_177時間およびRAL_555。バーは平均値を表し、誤差範囲は SEM (n = 48) を表します。RAL_177ハエの沈着時間は、RAL_55ハエ(p<0.0001、ANOVA)よりも少なかった。個々のデータポイントは表 1に示されています。男女と行の間のその他の統計的有意差は、テキストおよび表 2に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

分析バリエーションのソースDfSsF値P値
フル モデル プール行176962734.869<0.0001
セックス11050014.7570.0304
ラインXセックス1860213.8970.0498
エラー1884149491
モデル女性の削減行168512623.58<0.0001
エラー942730718
モデルの男性の削減行117052211.30.0011
エラー941418774
モデルRAL_177の削減セックス14730.0230.8800
エラー941943741
モデルRAL_555の削減セックス11905498.120.0054
エラー942205751

表2: 性別とDGRPライン間のセデレーション時間の分散の分析使用したモデルはYY=μ+L+L+L+Lx L µ LS+εであり、μは全体平均、LはDGRP線の固定効果(RAL_177、RAL_555)、Sは性別(男性、女性)の固定効果、LxSは相互作用項(固定S)、εは誤差項である。 ε S モデルY=μ+L+εεおよびµLYYY=μ+S+εε は、還元モデルに使用された。 µ Sライン、セックス、およびラインxセックスインタラクション用語はすべてα<0.05のフルモデルにおいて有意であった。性別およびDGRPラインRAL_555による還元モデルもα<0.01で有意であった。表1、図 4も参照してください。df = 自由度、SS = タイプ I 平方和。

ディスカッション

ここでは、ショウジョウバエメラノガスターにおけるエタノール暴露による沈殿時間を評価するための簡便で安価で高スループットな方法を提示する。グループ分析を必要とする多くの現在の方法とは異なり、このアッセイは、1人の人が8時間の作業期間内に〜2,000ハエの個々の沈め時間データを収集することを可能にします。私たちは、1人が約5分でセドレーション時間のために48ハエを獲得できることを発見しました。このままでは、約4時間で2,000ハエを獲得できますが、後で得点を行うことができます。私たちのアッセイでは、ほとんどのハエの沈め時間は、1mLのエタノールに曝露して5〜15分の範囲です。エタノールの濃度が低い、またはより少ない送達量は、より長い沈行時間をもたらす。

沈座時間を評価するための現在の方法では,、1人の個人,,,,,,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26の測定を容易に可能にすることなく、多数のハエをテストする必要があります。15,16,17,1825,26192021222324多くの電流鎮静および感受性アッセイは、エタノール暴露の結果としてハエの50%が鎮静される時点,であるST502222、23、24に依存する。23,24ハエのグループのST50を得ることがこのアッセイを開発するための主な動機ではなかったが、ビデオ録画は、個別にテストされたハエのグループのST50を確認し、任意の時点で所定の基準を満たすハエの割合(例えば、姿勢制御の喪失)を測定するために使用することができるので、現在の方法と比較してより高い有用性を示す。このようなビデオ分析には追加の時間が必要になることに注意してください。

現在の不安定計アッセイとは異なり、我々が記述する方法は、設定するための特殊なツールを必要とせず、共通の材料を使用して任意の実験室で行うことができます。この方法を用いて、我々は個々のハエのための信頼でき、一貫した沈めの時間を得ました。アッセイは、原則として、あらゆる揮発性物質への暴露の影響を評価するために拡張することができる。このアッセイはまた、他のハエ種を含む他の昆虫に対する揮発性物質の急性毒性の影響を測定するために適用することができる。個々の沈着時間データを使用して、DGRPなどの母集団内の表現型変動の程度を評価することができます。

小さな昆虫スクリーンメッシュを使用してエタノール溶液との直接接触を防ぎ、十分な量のエタノール蒸気を飛びに届けることを可能にしました。スクリーンメッシュの上に白いチーズクロスの層は、ハエと下の表面の間の視覚的なコントラストを提供し、ハエが画面メッシュに巻き込まれないようにし、姿勢制御の喪失のあいまいな決定につながる可能性があります。水と空気に多孔質である市販の膜は、一貫性のない結果を与え、エタノール蒸気に対して十分に浸透できなかった。ウェル内の飛び位置の結果としてエタノール暴露のばらつきを最小限に抑える均一に多孔質材料であるため、意図的に小さな昆虫スクリーンメッシュを使用しました。我々は、制御行動室、ハエに近い90%〜100%エタノールへのアクセス、均一なエタノール暴露を推奨するが、利用可能な材料に基づいて、このプロトコルに変更を加えることができます。

位置偏りを避けるために、細胞培養プレート内の飛び位置を複製間でランダム化する必要があります。このアッセイを複数日にわたって使用する必要があり、アッセイ結果に影響を与える可能性のある環境変動(例えば、気圧の変化)27の大規模な実験では、ハエを毎日同じ時間にテストし、特に異なる線や性別を比較する場合は、毎日同じ時間にテストし、日中と日単位の両方で無作為化することを強くお勧めします。

我々が開発した方法は、急性アルコール暴露の効果を測定するのに最も適しているが、消費データやモデリング中毒を得るためには適していません。しかし、このアッセイから得られるアルコール沈着感度データは、アルコール関連表現型の他の尺度と統合することができる。システムの1つの制限は、標準的な細胞培養プレートの垂直高さは、全体的な活動または移動の詳細な評価のためにビデオでは容易に追跡することができない垂直フライの動きを可能にすることです。ただし、この制限は、セテーション時間の正確な評価には影響しません。異なる遺伝子型のハエ(例えば、DGRP由来の外れ集団28)を使用する場合、このアッセイはまた、バルクDNAシーケンシングおよび極端なQTLマッピング29、3030のための対照的な表現型を有するハエのプール29を収集するために個々のハエを検索することを可能にする。全体的に、このアッセイは、多数の単一ハエに関するアルコール沈下データの迅速で安価な収集を可能にする。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、国立衛生研究所からTFCMおよびRRHAへの助成金DA041613およびGM128974によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well Cell Culture PlatesCorning3526Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
CheeseclothGenesee Scientific53-100Widely available.
EthanolDecon LabsV1001Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)Walmart550098612Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator)Honeywell North67622Widely available.
Illumination PadAmazon (AGPtek)ASIN B00YA9GP0GAny light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft SticksMichaels10334892Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator)Genesee Scientific24-165RLAny P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator)Genesee Scientific12-104
Small Insect Screen MeshLowe's (Saint-Gobain ADFORS)89322Any small insect screen mesh is suitable.
Testing ChamberInterior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator)Grainger9CUG7Widely available.
Video CameraCanon1959C001AAAny video camera is suitable.

参考文献

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