非肝細胞293T-NE-3NRs細胞におけるB型肝炎ウイルス感染のモデル化

要約

本稿では、新たに設計された293T細胞(293T-NE-3RS、ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)および伝統的な肝細胞(HepG2-NE、ヒトNTCPを発現する)におけるB型肝炎ウイルス(HBV)感染の詳細なプロトコルについて説明する。

要約

HBVは主にヒト肝細胞に感染するが、腎臓や精巣などの肝外組織に感染することも分かっていない。それにもかかわらず、細胞ベースのHBVモデルは、機能的HBV受容体、タウロコレート共輸送ポリペプチド(NTCP)を過剰発現するヘパトーマ細胞株(HepG2およびHuh7など)に限定される。ここでは、モデル細胞株として293T-NE-3ノール(293T過剰発現ヒトNTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα)およびHepG2-NE(HepG2過剰発現NTCP)を用いた。  これらの細胞株におけるHBV感染は、HepG2.2.15からの濃縮HBVウイルス粒子または標的細胞株との共培養HepG2.2.15を用いて行った。HBcAgに対するHBcAg免疫蛍光をHBV感染を確認するために実施した。ここで提示される2つの方法は、非肝細胞株におけるHBV感染を研究するのに役立ちます。

概要

B型肝炎は20億人以上の人々の生活に影響を与え、公衆衛生に対する大きな脅威の1つです。世界中で約2億5,700万人が慢性B型肝炎ウイルス(HBV)に感染しており、社会に大きな負担を与えています^。肝細胞は、腎臓や精巣などの非肝組織におけるHBVおよび他の細胞に感染した唯一の細胞ではなく、このウイルス^22、33にも感染している。現在、HBV感染細胞モデルは、非肝細胞系モデルの数が少ないヒト肝細胞に限定されている。これは、HBV感染および非肝組織のHBV関連病理の研究を妨げる。ここでは、非肝細胞293T細胞および肝細胞におけるHBV感染を研究するためのプロトコルを提示する。

タウロコレート酸共輸送ポリペプチド(NTCP)は、ヒトB型肝炎およびD型肝炎ウイルス⁴の機能受容体である。肝細胞核因子4α(HNF4α)、レチノイドX受容体α(RXRα)およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α(PPARα)は、HBVのウイルス性栄養を制限する肝富化転写因子である。それらは、HBVプレゲノムRNA合成を促進し、非ヘパトーマ細胞ライン⁵におけるHBV複製を支持することが確認されている。我々は、NTCP(HepG2-NE)を発現するHepG2細胞株、NTCP(293T-NE)を発現する293T細胞株、および4つの宿主遺伝子を発現する293T細胞株の3つの異なる細胞株を構築した。NTCP、HNF4α、RXRαおよびPPARα(293T-NE-3ノール)。HBV感染のための2つの方法は、293T-NE-3DRに基づいて開発された(図1)。第1の方法は、24時間の高いウイルスゲノム同等性(高いGEq(150)、DMSOおよびPEG8000を有する293T-NE-3ノンの接種を使用する。2番目の方法は、293T-NE-3NをHepG2.2.15と共培養し、DMSOおよびPEG8000なしでHBV粒子(約1.83)を生成し、自然条件を密接にエミュレートする。

HepG2.2.15細胞は、HepG2線に由来し、感染性HBVを慢性分泌し、ならびにサブウイルス粒子を培地^66,77に分泌する。シクロスポリンA(CsA)は、異種移植片拒絶反応の抑制のために臨床的に用いられる免疫抑制剤である。研究は、CsAがNTCPのトランスポーター活性を阻害し、NTCPの大きなエンベロープタンパク質⁸への結合を遮断することによって培養肝細胞へのHBVの侵入を阻害することを示している。

HepG2-NE細胞は陽性対照として用いたのに対し、CsA処理細胞は陰性対照として用いた。陽性対照群と陰性対照群と比較することで、HBV感染においてどの宿主遺伝子が重要な役割を果たすかを調べることができる。さらに、HBV感染のこのモードを介して、HBV感染に関与する他の新しいメカニズムまたは宿主遺伝子を見つけることもできます。

プロトコル

培養は、ヘプG2.2.15細胞およびHBV感染からの上清の収集は、バイオセーフティレベルII(P2)またはバイオセーフティレベルIII(P3)の実験室で行われるべきである。実験室の安全慣行に従って、実験室の人員の安全を確保し、HBV実験を行う前に、すべてHBsAb陽性のワクチン接種と検出を行う必要があります。次のステップに進む前に、すべてのステップでセルの状態を確認します。ヒト血清サンプルは、シャントー大学医科大学の機関審査委員会が得た承認に従って使用された。

1. HepG2.2.15細胞培養

注意:HepG2.2.15細胞上清、HepG2.2.15細胞上清濃縮物およびHepG2.2.15に接触するすべての先端、フラスコ、プレートおよび管は、一晩2%のビデュードに浸漬された後に処分されるべきである。

1. 液体窒素からHepG2.2.15細胞を含むバイアルを取り出し、37°Cの水浴でバイアルを軽く旋回して解凍します。
   注:汚染の可能性を減らすために、キャップを水の外に保管してください。解凍は急速に行う必要があります(約2分)。
2. 細胞が解凍されるとすぐに水浴からバイアルを取り出し、70%エタノールで消毒します。
   注: この時点から、厳しい無菌条件下ですべての手順を実行します。
3. 細胞を25cm2組織培養²フラスコに移し、4 mLの完全な培養培地(10%FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン0.1mg/mLを含むDMEM)を加える。5%CO2の加湿インキュベーターで37°Cの細胞をインキュベート₂する。

2. HepG2.2.15細胞培養上清の収集

1. T25フラスコでは培養HepG2.2.15細胞を37°Cで、5%CO2は加湿インキュベーターで_{培養する。 2}3日ごとにメディアを変更します。
2. 50 mL遠心分離管に細胞上清を集める。蓋をしっかり閉め、パラフィンフィルムで包みます。
3. HBVウイルスを活性に保つために-20°CでHepG2.2.15上清を保管してください。

3. HepG2.2.15上清を濃縮する

1. HepG2.2.15上清を-20°Cから取り出し、4°Cで解凍します。
2. 細胞断片を除去するには、HepG2.2.15上清を0.45μmの膜で濾過し、新しい50 mL遠心分離チューブを使用します。まず、10mLのDMEMを10%FBSでフィルタリングしてから、ウイルスを濾過し、次に細胞培養上清を濾過する。
3. フィルタされた上清の14 mLをウイルス濃縮器カラムに加え、蓋を閉じます。水平回転遠心分離機で35分間3,200 x gの柱を遠心分離します。HepG2.2.15上清濃縮物(約200μL)を1.5mLチューブに回収します。
4. DMEMを200 μL添加してDMEMでカラムを1回洗浄し、1.5mLチューブに集めます。

4. 上清濃縮物中HBVDNAの検出

1. 乾いたブロックヒーターをオンにし、温度を100°Cに設定します。
2. HepG2.2.15上清濃縮物中のHBV DNAの濃度が標準曲線範囲内であることを確認するには、1.5 mLのマイクロ遠心チューブに190μLのDMEMに10μLのHepG2.2.15上清濃縮物を加えて濃縮物を20倍に希釈します。HepG2.2.15上清の200 μLを加え、 陰性対照(健康ドナーからのHBV陰性血清)、HBV陽性対照(HBV患者からのHBV陽性血清)およびキットに提供される定量的参照の4つの希釈(2.0 x 10 6、2.0 x 10^5、2.0x¹⁰4、2.0 x 10³ GEq /mL)をそれぞれ分離する。⁶
3. キットから450 μLのHBV DNA抽出バッファーを、上記の8つの1.5 mLチューブに加え、15 sの渦を15 sでスピンダウンし、100°Cで10分間、ドライブロックヒーターで10分間インキュベートします。室温で5分間12,000 x gの遠心分離機。
4. 氷の上に置かれたPCRチューブに27μLのPCRマスターミックスと3μLのTaqポリメラーゼ酵素を加えます。
   注:キットに用意されているPCRマスターミックスは、HBV DNAの保存領域に対するプライマーを含んでいます。
5. 氷の上に置かれたPCRチューブに20μLの遠心化上清液を加えます。しっかりと覆い、10 sでスピンダウンします。
6. リアルタイム PCR マシンで以下の条件を使用してください: 2 分間 93 °C、45 s の 93 °C の 10 サイクル、60 s の 55 °C が続きます。その後、30 sの93°Cの30サイクル、45sの55°CがリアルタイムPCRを実行します。
   注:市販キットで提供されるマスターミックスは、HBV DNAの保存領域に対してプライマーを有する。
7. 取得した Ct 値をエクスポートし、表 1と図 2に示すように標準曲線を生成します。
8. 標準曲線に基づいて、表2に示すようにHepG2.2.15上清濃縮物20倍のHBVDNA濃度を算出する。HepG2.2.15上清濃縮物のHBVDNA濃度を計算する(表2)。
9. HepG2.2.15上清濃縮物をアリコートに分け、使用するまで-80°Cで保管します。

5. HepG2-NEおよび293T-NE-3NRs細胞のインビトロ感染

1. DMEM/F-12で次の感染媒体を準備する:10%FBS、 4 mMグルタミンサプリメント、0.1 mM NEAA、1 mMナトリウムピルビン酸、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、1 μg/mLプルミシン、40 ng/mLデキサメタゾン、20 μg/mLヒドロキサゾンおよび5g/mLインスリン。4 °Cで保管。
   注:これらのNTCP陽性細胞は、ピューロマイシン耐性⁹である。
2. 48ウェルプレートの5ウェルに0.1%ゼラチンを加え、各ウェルに200 μLを加えます。プレートを37°Cで2時間インキュベートし、上清を捨てる。プレートを37°Cで2時間インキュベートします。
3. 種子 HepG2-NE 密度で 1 x 10⁴細胞 2 ウェルのそれぞれ.種子293T-NE-3NRs細胞は、それぞれ2つのウェル中の1×104細胞の密度で(1μmol/Lのオールトランスレチノイン酸と1mmol/L最終濃度のクロフィブリン酸を培地に加えて、RXRαおよびPPARα核ホルモン受容体を活性化した)。⁴1 x 10⁴細胞の密度で1ウェルで293T-NEをシード。
   注:0.25%トリプシンを使用してサブ合流で細胞を通過させる。セル番号をカウントし、セルを適切な密度にシードします。
4. 24時間加湿インキュベーターで37°C、5%CO2の細胞をインキュベートし、24時間後に細胞を観察し、細胞が健康であれば感染を進めます。₂
5. 表3に記載されているように感染複合体を調製し、HBV(HepG2.2.15上清濃縮物)、DMSO、PEG8000および感染培地を1.5 mLマイクロ遠心分離管に加える。DmSOで5mMの濃度に溶解してCsA在庫を準備し、-20 ºCで在庫を維持します。CsAの働く解決は5 μMである。48ウェルプレートのウェルあたり1×10⁴細胞をシードします。150 GEq/細胞で細胞に感染するHepG2.2.15上清濃縮物(HBV 1.5063×10⁷ GEq/mLを含む)を100μL加えます。
6. 各ウェルに500μLの感染複合体を加え、37°Cで細胞をインキュベートし、₂加湿インキュベーターで5%CO2を24時間培養します。
7. 培地を交換する前に、500 μLのPBSで細胞を2回洗浄します。各ウェルに培地1mLを加えます。細胞状態が悪く、一部のセルが浮いている場合は、直接培地を変更します。これは感染の1日目です。2日ごとに穏やかに培地を交換してください。
8. 11日目に、500 μLのPBSで細胞を2回洗浄し、免疫蛍光を求めて氷冷メタノールで細胞を固定します。

6. HepG2.2.15 共文化と HepG2-NE / 293T-NE-3ノール / 293T-NE

1. 6ウェルプレートの5ウェルに0.1%ゼラチンの1 mL/ウェルを追加します。プレートを37°Cで2時間インキュベートし、上清を捨てます。プレートを37°Cでもう一度2時間インキュベートし、井戸を完全に乾燥させます。
2. 2つのウェルにHepG-NEの1 x 10⁵細胞/ウェル、2つの井戸に293T-NE-3ノール、プレートの1ウェルに293T-NE。HepG2.2.15のシード1 x 10⁵細胞/ウェルを、別の6ウェルプレートに5つの膜インサート(24mm、0.4 μmの細孔径、コーティングなし)に塗布します。37°Cで細胞をインキュベートし、5%CO2を加湿インキュベーターで24時間培養する。₂
3. 24時間後、細胞が全て接着性と良好な状態にある場合は、共培養の準備をする。6ウェルプレートと細胞膜の挿入物に培地を捨てます。膜インサートにHepG2.2.15を付けて、ピンセットでHepG-NE、293T-NE-3ノール、293T-NEを播種した6ウェルプレートに入れる。37°Cで細胞をインキュベートし、5%CO2を加湿インキュベーターで、3〜4日ごとに培地を交換する。₂
   注:グループを次のように設定します: まあ1:293T-NEのHepG 2.2.15との共文化;さて2:HepG2-NEとHepG 2.2.15との共文化。まあ3:HepG2.2.15と293T-NE-3ノールの共文化。まあ4:HepG 2.2.15とHepG2-NEの共文化(CsAを追加します)。まあ5:HepG2.2.15と293T-NE-3ノールの共文化(CsAを追加)完全な培地をウェル番号1、2、3に加え、5 μM CsAの培地をウェル4と5ウェルに加え、各ウェルに約9mL、ウイルス粒子がトランスウェルから感染細胞に移行するためにメディアが接触していることを確認します。
4. 10日後、膜インサートを取り除き、PBSを6ウェルプレートに加え、2回やさしく洗浄し、免疫蛍光のために氷冷メタノールで細胞を固定する。

7. HBcAgの蛍光免疫を行う

1. 3時間以上氷冷メタノールを-20°Cで固定します。シェーカーで室温で10分間PBSで細胞を洗い、3回繰り返します。
2. 5%BSA(100 μL/48ウェルプレート、500 μL/6ウェルプレート)を加え、水平シェーカーで40rpmと室温で1時間振ります。
3. HBcAg一次抗体溶液(一次抗体:5%BSA溶液=1:200、100 μL/48ウェルプレート、500 μL/6ウェルプレート)を加え、4°Cで一晩振る。
4. PBST(0.1%トゥイーン20のPBS)で井戸を洗い、シェーカーで室温で10分間、3回繰り返します。
5. 2番目の抗体溶液(ウサギIgGに対してヤギで上げられた594標識抗体:PBS = 1:1,000、100 μL /48ウェルプレート、500 μL / 6-ウェルプレート)を加え、プレートをホイルで覆い、室温で2時間振ります。
6. PBSTで再び3回洗い、それぞれ10分間振ります。
7. 1 μg/mL DAPIを加え、2分間振り、PBSTをシェーカーで2回5分間洗浄します。PBST を破棄します。PBSを加え、免疫蛍光顕微鏡で観察します。

結果

我々は、PSIN-NTCP-EGFPプラスミドを構築し、NTCPとEGFP融合を発現し、ピューロマイシン耐性を有する。プラスミドをHepG2および293T細胞にトランスフェクトし、NTCPおよびEGFPを発現する安定した細胞株HepG2-NEおよび293T-NEを構築した。プラスミド(pSIN-HNF4α、pSIN-RXRα、pLV-PPARα-プロフラグ)をピューロマイシン耐性および発現を有する293T-NE細胞にトランスフェクトし、4個の宿主遺伝子⁹...

ディスカッション

ここでは、非肝293T-NE-3Nおよび肝腫ベースHepG2-NE細胞におけるHBV感染プロトコルについて紹介する。293T-NE-3NRsは、高および低GEqの両方でHBV感染に適していた。プロトコルを使用する際には、次の重要な手順を考慮する必要があります。細胞の状態は、感染を成功させるための重要な要因です。感染媒体は、HBV感染の最初の期間の後にタイムリーに変更する必要があります。293T-NE-3-3NRs細胞は、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside