Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

Özet

Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Özet

HBV esas olarak insan heatositlerini enfekte eder, ancak böbrek ve testis gibi ekstrahepatik dokulara da bulaşabilmekte bulunmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı HBV modelleri hepatoma hücre hatları ile sınırlıdır (HepG2 ve Huh7 gibi) fonksiyonel BIR HBV reseptörü aşırı ifade, sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP). Burada 293T-NE-3NR (293T aşırı insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα) ve HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) model hücre hatları olarak kullandık.   Bu hücre hatlarındaki HBV enfeksiyonu ya HepG2.2.15'teki konsantre HBV virüs parçacıkları kullanılarak ya da hepg2.2.15'i hedef hücre hatları ile birlikte örme ile gerçekleştirildi. HBV enfeksiyonunu doğrulamak için HBcAg immünoresans iması yapıldı. Burada sunulan iki yöntem, hepatik olmayan hücre hatlarında HBV enfeksiyonu çalışmamıza yardımcı olacaktır.

Giriş

Hepatit B 2 milyardan fazla insanın hayatını etkiler ve halk sağlığıiçin en büyük tehditlerden biridir. Yaklaşık 257 milyon kişi kronik hepatit B virüsü ile enfekte (HBV) dünya çapında, toplum için büyük bir yük neden^1. Hepatositler hbv ve diğer hücreler tarafından enfekte olmayan karaciğer dokusu, böbrek ve testis gibi enfekte sadece hücreler değildir, ayrıca bu virüs tarafından enfekte^2,3. Şu anda, HBV enfeksiyon hücre modelleri sadece birkaç non-hepatik hücre hattı modelleri ile insan hepatositleri ile sınırlıdır. Bu, hepatik olmayan dokuların HBV enfeksiyonu ve HBV ile ilişkili patolojisinin çalışmasını engellemektedir. Burada hepatik olmayan 293T hücrelerinde ve hepatom bazlı hücrelerde HBV enfeksiyonu incelemek için protokoller salıyoruz.

Sodyum taurokolate co-transporting polipeptid (NTCP) insan hepatit B ve hepatit D virüsü için fonksiyonel bir reseptördür⁴. Hepatosit nükleer faktör 4α (HNF4α), retinoid X reseptörα (RXRα) ve peroksizom proliferator aktive reseptör α (PPARα) HBV viral tropizmkısıtlar karaciğer zenginleştirilmiş transkripsiyon faktörleridir. HbV pregenomik RNA sentezini teşvik etmek ve nonhepatom anormal hücre hattı⁵HBV replikasyonunu desteklemek için doğrulanmıştır. NTCP (HepG2-NE), NTCP (293T-NE) ve dört konak geni ifade eden 293T hücre hattını ifade eden HepG2 hücre hattı olmak üzere üç farklı hücre hattı inşa ettik; NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα (293T-NE-3NR). HBV enfeksiyonu için 293T-NE-3NR(Şekil 1)temel alınabilmektedir. İlk yöntem 293T-NE-3NR'de yüksek viral genom eşdeğerliği (yüksek GEq (150), DMSO ve PEG8000) 24 saat boyunca aşılama yöntemidir. İkinci yöntem, HBV partiküllerini (düşük GEq (yaklaşık 1,83) DMSO ve PEG8000 olmadan üretebilen ve böylece doğal koşulları yakından taklit eden HepG2.2.15'li 293T-NE-3NR'leri ortak olarak kullanır.

HepG2.2.15 hücreleri HepG2 hattından elde edilir ve kronik olarak enfeksiyöz HBV salgılar, ayrıca kültür ortamına subviral partiküller^6,7. Siklosporin A (CsA) klinik olarak ksenogreft rekontisyonunun bastırılmasında kullanılan bir immünsupresandır. Çalışmalar, CsA'nın NTCP'nin taşıyıcı aktivitesini inhibe ederek ve NTCP'nin büyük zarf proteinlerine bağlanmasını engelleyerek HBV'nin kültürlü hepatositlere girişini engellediğini göstermiştir⁸.

HepG2-NE hücreleri pozitif kontrol olarak, CsA tedavi edilen hücreler ise negatif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif ve negatif kontrol grupları ile karşılaştırarak, hangi konak genlerin HBV enfeksiyonunda kritik bir rol oynadığını bulabiliriz. Ayrıca, HBV enfeksiyonu bu modu ile, biz de diğer yeni mekanizmalar veya EV sahibi genler HBV enfeksiyonu dahil bulabilirsiniz.

Protokol

Kültür, HepG2.2.15 hücrelerinden süpernatants toplama ve HBV enfeksiyonu ülkedeki biyogüvenlik rehberliğine göre biyogüvenlik düzeyi II (P2) veya biyogüvenlik seviyesi III (P3) laboratuvarında yapılmalıdır. Laboratuvar personelinin güvenliğini sağlamak için laboratuvar güvenlik uygulamaları takip edilmeli ve HBV deneyleri yapmadan önce tüm aşılar ve HBsAb pozitif saptanmalıdır. Bir sonraki adıma geçmeden önce her adımda hücrelerin durumunu gözlemleyin. Shantou Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı doğrultusunda insan serumu örnekleri kullanılmıştır.

1. HepG2.2.15 hücre kültürü

NOT: HepG2.2.15 hücre supernatant, HepG2.2.15 hücre supernatant konsantresi ve HepG2.2.15 ile temas eden tüm ipuçları, şişeler, plakalar ve tüpler bir gecede %2 virucide batırıldıktan sonra bertaraf edilmelidir.

1. HepG2.2.15 hücrelerini içeren şişeyi sıvı nitrojenden çıkarın ve şişeyi 37 °C'lik bir su banyosunda hafifçe döndürerek çözülün.
   NOT: Kontaminasyon olasılığını azaltmak için kapağı sudan uzak tutun. Erime hızlı olmalıdır (yaklaşık 2 dk).
2. Hücreler çözülür çözülmez şişeyi su banyosundan çıkarın ve %70 etanol ile dezenfekte edin.
   NOT: Bu noktadan itibaren sıkı aseptik koşullar altında tüm adımları gerçekleştirin.
3. Hücreleri 25 cm² doku kültürü şişesine aktarın ve 4 mL tam kültür ortamı ekleyin (DMEM %10 FBS, penisilin 100 U/mL, streptomisin 0.1 mg/mL içerir). Hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde %5 CO₂ile kuluçkaya yatırın.

2. HepG2.2.15 hücre kültürünün toplanması supernatant

1. Kültür HepG2.2.15 hücre T25 şişeleri 37 °C, 5% CO₂ nemli bir kuluçka_{makinesinde .} Ortamı her 3 günde bir değiştirin.
2. Hücre supernatant bir 50 mL santrifüj tüp toplayın. Kapağı sıkıca kapatın ve bir parafin filmi ile sarın.
3. HBV virüslerini aktif tutmak için HepG2.2.15 supernatant'ı -20 °C'de saklayın.

3. Konsantre HepG2.2.15 supernatant

1. HepG2.2.15 supernatant'ı -20 °C'den çıkarın ve 4 °C'de çözülün.
2. Hücre parçalarını çıkarmak için, HepG2.2.15 supernatant'ı 0,45 m membranile yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyin. Önce, virüsü filtrelemeden önce 10 mL DMEM DMEM filtreleyerek filtreyi engelleyin, ardından hücre kültürünü supernatant filtreleyin.
3. Virüs konsantratörü sütununa 14 mL filtrelenmiş supernatant ekleyin ve kapağı kapatın. Sütunu 3.200 x g'de, 35 dk'lık yatay bir dönme santrifüjünde santrifüj edin. HepG2.2.15 supernatant konsantresini (yaklaşık 200 μL) 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın.
4. 200 μL DMEM ekleyerek kolonu DMEM ile bir kez yıkayın ve 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın.

4. Süpernatant konsantrede HBV DNA'sının saptanması

1. Kuru blok ısıtıcıyı açın ve sıcaklığı 100 °C'ye ayarlayın.
2. HepG2.2.15 supernatant konsantresindeki HBV DNA konsantrasyonunun standart eğri aralığında olmasını sağlamak için, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte 190 μL DMEM'e 10 μL HepG2.2.15 süpernatant konsantresi ekleyerek konsantreyi 20 kat seyreltin. 200 μL HepG2.2.15 supernatant ekleyin, negatif kontrol (sağlıklı donörden HBV-negatif serum), HBV pozitif kontrol (HBV-pozitif serum HBV hastasından) ve kitte verilen kantitatif referansların dört seyreltilmesi (2.0 x 10⁶, 2.0 x 10⁵, 2.0 x 10⁴, 2.0 x 10³ GEq /mL), sırasıyla 1.5 mL mikrosanfurige tüpü ayırmak için.
3. Kitten 450 μL HBV DNA ekstraksiyon tamponu ekleyin yukarıdaki sekiz 1,5 mL tüpün tümüne, girdap 15 s'ye ve 10 s. 100 °C'de kuru blok ısıtıcıda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Oda sıcaklığında 5 dk için 12, 000 x g centrifuge.
4. Buz üzerine yerleştirilen PCR tüplerine 27 μL PCR ana karışımı ve 3 μL Taq polimeraz enzimi ekleyin.
   NOT: Kitte sağlanan PCR ana karışımı, HBV DNA'sının korunmuş bölgesine karşı astariçerir.
5. Buz üzerine yerleştirilen PCR tüplere 20 μL santrifüjlü süpernatant sıvı ekleyin. Sıkıca kaplayın ve 10 s için aşağı spin.
6. Gerçek zamanlı bir PCR makinesinde aşağıdaki koşulları kullanın: 2 dk için 93 °C, 45 s için 93 °C'nin 10 döngüsü ve ardından 60 s için 55 °C; daha sonra 30 s için 93 °C 30 döngüleri ve gerçek zamanlı PCR yürütmek için 45 s için 55 °C izledi.
   NOT: Ticari kitte yer alan ana karışım, HBV DNA'sının korunmuş bölgesine karşı astara sahiptir.
7. Elde edilen Ct değerlerini dışa aktarın ve Tablo 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi standart bir eğri oluşturun.
8. Standart eğriye göre, HepG2.2.15 supernatant konsantresinin HBV DNA konsantrasyonu Tablo 2'degösterildiği gibi seyreltilmiş 20x hesaplayAbilirsiniz. HepG2.2.15 süpernatant konsantresinin HBV DNA konsantrasyonunun hesaplanması(Tablo 2).
9. HepG2.2.15 supernatant konsantresini aliquotlarda bölün ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

5. HepG2-NE ve 293T-NE-3NR hücrelerinin in vitro enfeksiyonu

1. DMEM/F-12'de aşağıdaki enfeksiyon ortamını hazırlayın: %10 FBS, 4 mM glutamin takviyesi, 0.1 mM NEAA, 1 mM Sodyum pirüvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 1 μg/mL puromisin, 40 ng/mL deksametazon, 20 g/mL hidrokortizon ve 5 g/mL insülin. 4 °C'de saklayın.
   NOT: Bu NTCP pozitif hücreler puromisin dirençli⁹.
2. 48 iyi plakalı 5 kuyuya %0,1 jelatin, her kuyuya 200°L ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın, süpernatant'ı atın. Plakayı 37 °C'de 2 saat daha kuluçkaya yatırın.
3. Tohum HepG2-NE 2 kuyuda 1 x 10⁴ hücre yoğunluğunda. 2 kuyuda 1 x 10⁴ hücre yoğunluğunda tohum 293T-NE-3NR hücreleri (sırasıyla RXRα ve PPARα nükleer hormon reseptörlerini etkinleştirmek için ortama 1 μmol/L'de tüm trans retinoik asit ve 1 mmol/L son konsantrasyonlarda klofibrik asit eklendi). Tohum 293T-NE 1 iyi 1 x 10⁴ hücre yoğunluğunda.
   NOT: Hücreleri %0,25 tripsin kullanarak alt kesişme noktasından geçirilmesi. Hücre numarasını sayın ve hücreleri uygun bir yoğunluğa tohumlayın.
4. Hücreyi 37 °C,%5 CO₂ nemli bir kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
5. Tablo 3'tebelirtildiği gibi enfeksiyon kompleksini hazırlayın, HBV (HepG2.2.15 supernatant konsantresi), DMSO, PEG8000 ve enfeksiyon orta ila 1.5 mL mikrosantrifüj tüp ekleyin. CsA stoğunu DMSO'da 5 mM'lik bir konsantrasyona kadar eriterek hazırlayın ve stoku -20 ºC'de tutun. CsA'nın çalışma çözümü 5 μM'dir. Tohum 1 × 10⁴ hücreleri 48-iyi plaka iyi başına. 150 GEq/hücredeki hücrelere bulaşmasını sağlamak için 100 μL HepG2.2.15 supernatant konsantre (HBV 1.5063 ×10⁷ GEq/mL içeren) ekleyin.
6. Her kuyuya enfeksiyon kompleksinin 500 μL'sini ekleyin ve hücreleri 37 °C,%5 CO₂ nemli inkübatörde 24 saat kuluçkaya yatırın.
7. Ortamı değiştirmeden önce hücreleri 500 μL PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 1 mL orta ekleyin. Hücre durumu zayıfsa ve bazı hücreler kayansa, ortamı doğrudan değiştirin. Bu enfeksiyonun ilk günü. Orta yı 2 günde bir hafifçe değiştirin.
8. 11. günde hücreleri 500 μL PBS ile iki kez yıkayın ve immünoresans için hücreleri buz gibi metanol ile düzeltin.

6. HepG2.2.15 hepg2-NE / 293T-NE-3NR / 293T-NE ile ortak kültür

1. 6 kuyuluk 5 kuyuya %0,1 jelatin 1 mL/kuyu ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve süpernatantı atın. 37 °C'de 2 saat daha tekrar inkübe edin ve kuyuyu tamamen kurutun.
2. Tohum 1 x 10⁵ hücreleri /iyi HepG-NE içine 2 kuyu, 2 93T-NE-3NR içine 2 kuyu içine, ve 293T-NE plaka içine 1 kuyu içine. Tohum 1 x 10⁵ hücreleri/kuyusu HepG2.2.15 beş membran kesici uçüzerine (24 mm, 0.4 m gözenek çapı, kaplamasız) ayrı bir 6 kuyu plakası. Hücreleri 37 °C,%5 CO₂ nemli bir kuluçka makinesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
3. 24 saat sonra, hücrelerin tüm yapışık ve iyi durumda ise, co-kültür için hazırlayın. 6-iyi plaka ve hücre zarı ekler orta atın. HepG2.2.15 ile membran kesici uçları, cımbızla HepG-NE, 293T-NE-3NR ve 293T-NE ile tohumlanmış 6 kuyu plakasına yerleştirin. Hücreyi 37 °C'de, %5 CO_2'yi nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın, her 3-4 günde bir ortayı değiştirin.
   NOT: Grupları aşağıdaki gibi ayarlayın: Peki 1: 293T-NE hepg 2.2.15 ile ortak kültür; Peki 2: HepG 2.2.15 ile HepG2-NE ortak kültür; Peki 3: HepG2.2.15 ile 293T-NE-3NR ortak kültür; Peki 4: HepG 2.2.15 ile HepG2-NE co-kültür (CsA ekleyin); Peki 5: 293T-NE-3NRs ortak kültür HepG2.2.15 (CsA ekleyin); 1, 2 ve 3 numaralı tüm ortamı ekleyin, 5 μM CsA'yı 4 ve 5'e iyi, her kuyu için yaklaşık 9 mL'ye ekleyin, virüs partiküllerinin transwelllerden hücrelere bulaşması için ortamın temas halinde olduğundan emin olun.
4. 10 gün sonra, membran kesici uçlarını çıkarın, 6-iyi plakaya PBS ekleyin ve iki kez hafifçe yıkayın, immünofloresans için buz gibi metanol ile hücreleri düzeltin.

7. HBcAg için immünoresans gerçekleştirin

1. Hücreleri buz gibi metanol ile -20 °C'de 3 saatten fazla tonu atın. Hücreleri 10 dakika boyunca Oda sıcaklığında çalkalayıcı da PBS ile yıkayın, 3 kez tekrarlayın.
2. %5 BSA (100 μL/48-iyi plaka, 500 μL/6-iyi plaka), 40 rpm ve oda sıcaklığında 1 saat yatay shaker sallayın ekleyin.
3. HBcAg primer antikor çözeltisi ekleyin (primer antikor: %5 BSA çözeltisi =1:200, 100 μL / 48-iyi plaka, 500 μL / 6-iyi plaka), 4 °C'de bir gecede sallayın.
4. PBST (PBS% 0.1 ara 20 ile) ile kuyuları yıkayın, shaker oda sıcaklığında 10 dakika için, 3 kez tekrarlayın.
5. İkinci antikor solüsyonu ekleyin (tavşan IgG karşı keçi yükseltilmiş 594 etiketli antikor: PBS = 1:1,000, 100 μL /48-iyi plaka, 500 μL / 6-well-plaka), folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 2 saat sallayın.
6. Üç kez PBST ile tekrar yıkayın, her biri 10 dakika sallayın.
7. 1 μg/mL DAPI ekleyin, 2 dk. Her biri 5 dk çalkalayıcı üzerinde PBST ile iki kez yıkayın. PBST'yi atın. PBS ekleyin ve immünofloresan mikroskobu altında gözlemleyin.

Sonuçlar

PSIN-NTCP-EGFP plazmidini ifade eden NTCP ve EGFP füzyonu ve püromisin direnci ni inşa ettik. Plazmid, HepG2-NE ve 293T-NE hücre hatları ntcp ve EGFP ifade kararlı hücre hatları oluşturmak için HepG2 ve 293T hücrelerine transfeced oldu. Pomisin direnci ve ekspresyonu olan plazmidler (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) 293T-NE hücrelerine dönüştürülerek 4 konak geni ifade eden kararlı bir hücre hattı oluşturmak için⁹. NTCP-EGFP ifadesi yeşil floresan tarafından g...

Tartışmalar

Burada hepatik olmayan 293T-NE-3NR ve hepatom bazlı HepG2-NE hücrelerinde HBV enfeksiyonu için protokoller sokulduk. 293T-NE-3NR hem yüksek hem de düşük GEq'da HBV enfeksiyonu için uygundu. Protokolümüzü kullanırken aşağıdaki kritik adımların göz önünde bulundurulması gerekmektedir. Hücre durumu başarılı bir enfeksiyon için önemli bir faktördür. HBV enfeksiyonunun başlangıç döneminden sonra enfeksiyon ortamı zamanında değiştirilmelidir. 293T-NE-3NR hücreleri genellikle yüksek viral ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside