Modelado de la infección por el virus de la hepatitis B en células no hepáticas 293T-NE-3R

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en células 293T de ingeniería novedosa (293T-NE-3NR, expresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y células hepáticas tradicionales (HepG2-NE, expresando NTCP humano).

Resumen

El VHB infecta principalmente a los hepatocitos humanos, pero también se ha encontrado para infectar tejidos extrahepáticos como el riñón y los testículos. No obstante, los modelos de VHB basados en células se limitan a líneas celulares de hepatoma (como HepG2 y Huh7) que sobreexpresan un receptor funcional del VHB, polipéptido de cocarvamiento de taurocholato sódico (NTCP). Aquí, usamos 293T-NE-3NRs (293T sobreexpresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y HepG2-NE (HepG2 sobreexpresando NTCP) como líneas celulares modelo.   La infección por VHB en estas líneas celulares se realizó utilizando partículas concentradas del virus del VHB de HepG2.2.15 o co-cultivo de HepG2.2.15 con las líneas celulares diana. Se realizó inmunofluorescencia HBcAg para HBcAg para confirmar la infección por VHB. Los dos métodos presentados aquí nos ayudarán a estudiar la infección por VHB en líneas celulares no hepáticas.

Introducción

La hepatitis B afecta la vida de más de 2.000 millones de personas y es una de las principales amenazas para la salud pública. Aproximadamente 257 millones de personas están infectadas crónicamente con el virus de la hepatitis B (VHB) en todo el mundo, causando una gran carga a la sociedad¹. Los hepatocitos no son las únicas células infectadas por el VHB y otras células en el tejido no hepático, como el riñón y los testículos, también están infectadas por este virus^2,,3. Actualmente, los modelos de células de infección por VHB se limitan a hepatocitos humanos con solo unos pocos modelos de líneas celulares no hepáticas. Esto dificulta el estudio de la infección por vhB y la patología relacionada con el VHB de tejidos no hepáticos. Aquí presentamos protocolos para estudiar la infección por VHB en células 293T no hepáticas, así como en células basadas en hepatoma.

El polipéptido de cocarholato de tauriconato de sodio (NTCP) es un receptor funcional para el virus de la hepatitis B y la hepatitis D humana⁴. El factor nuclear de hepatocitos 4o (HNF4), el receptor X de retinoide (RXR) y el receptor activado por proliferador peroxisoma (PPAR) son factores de transcripción enriquecidos por el hígado que restringen el tropismo viral del VHB. Se han verificado para promover la síntesis de ARN pregenómico del VHB y apoyar la replicación del VHB en una línea celular no hepatoma⁵. Construimos tres líneas celulares diferentes, líneas celulares HepG2 que expresan NTCP (HepG2-NE), línea celular 293T que expresa NTCP (293T-NE) y línea celular 293T que expresa cuatro genes huésped; NTCP, HNF4, RXR y PPAR (293T-NE-3NRs). Se desarrollaron dos métodos para la infección por vhPH basados en 293T-NE-3NRs(Figura 1). El primer método utiliza la inoculación en 293T-NE-3NR con alta equivalencia del genoma viral (GEq (150), DMSO y PEG8000) durante 24 h. El segundo método emplea el co-cultivo 293T-NE-3NR con HepG2.2.15, que puede producir partículas de VHB (GEq bajo (alrededor de 1.83) sin DMSO y PEG8000), emulando así estrechamente las condiciones naturales.

Las células HepG2.2.15 se derivan de la línea HepG2 y secretan crónicamente el VHB infeccioso, así como partículas subvirales en el medio de cultivo^6,,7. La ciclosporina A (CsA) es un inmunosupresor utilizado clínicamente para la supresión del rechazo del xenoinjerto. Los estudios han demostrado que CsA inhibe la entrada del VHB en los hepatocitos cultivados al inhibir la actividad del transportador de NTCP y bloquear la unión de NTCP a proteínas de envoltura grande⁸.

Las células HepG2-NE se utilizaron como control positivo, mientras que las células tratadas con CsA se utilizaron como control negativo. En comparación con los grupos de control positivos y negativos, podemos averiguar qué genes del huésped desempeñan un papel crítico en la infección por el VHB. Además, a través de este modo de infección por el VHB, también podemos encontrar otros mecanismos novedosos o genes de huésped implicados en la infección por el VHB.

Protocolo

El cultivo, la recolección de sobrenadantes de células HepG2.2.15 e infección por VHB deben realizarse en el laboratorio de nivel II (P2) o de bioseguridad III (P3) de acuerdo con la guía de bioseguridad en el país. Se deben seguir las prácticas de seguridad de laboratorio para garantizar la seguridad del personal de laboratorio, y todas deben vacunarse y detectarse HBsAb positivas antes de realizar experimentos con VHB. Observe el estado de las celdas en cada paso antes de continuar con el paso siguiente. Las muestras de suero humano se utilizaron de acuerdo con la aprobación obtenida por la Junta de Revisión Institucional de Shantou University Medical College.

1. Cultivo celular HepG2.2.15

NOTA: El sobrenadante de células HepG2.2.15, el concentrado de sobrenadante celular HepG2.2.15 y todas las puntas, matraces, placas y tubos que entran en contacto con HepG2.2.15 deben eliminarse después de estar empapados en un 2% de virucide durante la noche.

1. Retire el vial que contiene las células HepG2.2.15 del nitrógeno líquido y descongele agitando suavemente el vial en un baño de agua de 37oC.
   NOTA: Para reducir la posibilidad de contaminación, mantenga la tapa fuera del agua. El deshielo debe ser rápido (aproximadamente 2 min).
2. Retire el vial del baño de agua tan pronto como las células se descongelen y desinfectarlo con un 70% de etanol.
   NOTA: A partir de este punto, realice todos los pasos en estrictas condiciones asépticas.
3. Transfiera las células a un matraz de cultivo tisular^{de 25} cm 2 y añada 4 ml de medio de cultivo completo (DMEM que contiene 10% de FBS, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml). Incubar las células a 37oC en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.

2. Colección de sobrenadante de cultivo celular HepG2.2.15

1. Cultivo HepG2.2.15 célula en matraces T25 a 37oC, 5%_CO2 en incubadora humidificada._. Cambie el medio cada 3 días.
2. Recoger el sobrenadante celular en un tubo centrífugo de 50 ml. Cierre la tapa firmemente y envuélvala con una película de parafina.
3. Almacene el sobrenadante HepG2.2.15 a -20 oC para mantener activo el virus del VHB.

3. Concentrar El sobrenadante HepG2.2.15

1. Retire el sobrenadante HepG2.2.15 de -20 oC y descongele a 4 oC.
2. Para eliminar los fragmentos de células, filtre el sobrenadante HepG2.2.15 con una membrana de 0,45 m a un nuevo tubo centrífugo de 50 ml. En primer lugar, bloquee el filtro filtrando 10 ml de DMEM con 10% de FBS antes de filtrar el virus y, a continuación, filtre el sobrenadante de cultivo celular.
3. Agregue 14 ml de sobrenadante filtrado a una columna del concentrador de virus y cierre la tapa. Centrifugar la columna a 3.200 x g durante 35 min en una centrífuga giratoria horizontal. Recoger el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 (alrededor de 200 l) en un tubo de 1,5 ml.
4. Lave la columna con DMEM una vez añadiendo 200 ml de DMEM y recógela en un tubo de 1,5 ml.

4. Detección de ADN del VHB en concentrado sobrenadante

1. Encienda el calentador de bloque seco y ajuste la temperatura a 100 oC.
2. Para asegurarse de que la concentración de ADN del VHB en el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 se encuentra dentro del rango de curva estándar, diluya el concentrado 20 veces añadiendo 10 l de concentrado de sobrenadante de HepG2.2.15 a 190 l de DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 200 l de HepG2.2.15 sobrenadante, control negativo (suero negativo por VHB de donante sano), control positivo del VHB (suero positivo del VHB del paciente con VHB) y cuatro diluciones de las referencias cuantitativas proporcionadas en el kit (2,20 x 10⁶, 2,0 x 10⁵, 2,0 x 10⁴, 2,0 x 10³ GEq /mL), respectivamente, para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Añadir 450 l de tampón de extracción de ADN HBV del kit a todos los ocho tubos de 1,5 ml anteriores, vórtice durante 15 s y girar hacia abajo durante 10 s. Incubar a 100 oC durante 10 min en calentador de bloque seco. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Añadir 27 l de mezcla maestra de PCR y 3 ml de enzima taq polimerasa a los tubos pcR colocados sobre hielo.
   NOTA: La mezcla maestra de PCR proporcionada en el kit contiene las imprimaciones contra la región conservada del ADN del VHB.
5. Añadir 20 l de líquido sobrenadante centrifugado a los tubos de PCR colocados sobre hielo. Cubra bien y gire hacia abajo durante 10 s.
6. Utilice las siguientes condiciones en una máquina de PCR en tiempo real: 93 oC durante 2 min, 10 ciclos de 93 oC para 45 s seguidos de 55 oC para 60 s; a continuación, 30 ciclos de 93 oC para 30 s seguidos de 55 oC durante 45 s para llevar a cabo pcR en tiempo real.
   NOTA: La mezcla maestra proporcionada en el kit comercial tiene imprimaciones contra la región conservada del ADN del VHB.
7. Exporte los valores Ct obtenidos y genere una curva estándar como se muestra en el Cuadro 1 y la Figura 2.
8. Sobre la base de la curva estándar, calcule la concentración de ADN del VHB de HepG2.2.15 concentrado de sobrenadante diluido 20x como se muestra en la Tabla 2. Calcular la concentración de ADN del VHB de HepG2.2.15 concentrado de sobrenadante(Tabla 2).
9. Divida el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 en alícuotas y guárdelo a -80 oC hasta su uso.

5. Infección in vitro de células HepG2-NE y 293T-NE-3NRs

1. Preparar el siguiente medio de infección en DMEM/F-12: 10% FBS, suplemento de glutamina de 4 mM, 0,1 mM de NEAA, 1 mM de piruvato sódico, 100 U/mL de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 1 g/ml de puromicina, 40 ng/ml de dexametasona, hidrocortisona de 20 g/ml y 5 g/ml de insulina. Conservar a 4oC.
   NOTA: Estas células positivas NTCP son resistentes a la puromicina⁹.
2. Añadir 0.1% de gelatina a 5 pocillos de 48 pozos, 200 l a cada pocól. Incubar la placa a 37oC durante 2 h, desechar el sobrenadante. Incubar la placa a 37oC durante otras 2 h.
3. Semilla HepG2-NE a una densidad de 1 x 10⁴ células en 2 pozos cada uno. Seeron 293T-NE-3NRs células a una densidad de 1 x 10⁴ células en 2 pozos cada una (ácido retinoico totalmente trans a 1 émol/L y ácido clofibrico a 1 mmol/L concentraciones finales se añadieron al medio para activar los receptores de hormona nuclear RXR y PPAR, respectivamente). Semilla 293T-NE en 1 pozo a una densidad de 1 x 10⁴ células.
   NOTA: Pasaje de las celdas a la subconfluencia usando 0.25% de trippsina. Cuente el número de celda y luego sembrar las celdas a una densidad adecuada.
4. Incubar la célula a 37oC, 5% CO₂ en una incubadora humidificada durante 24 h. Observar las células después de 24 h y proceder con la infección si las células están sanas.
5. Preparar el complejo de infección como se menciona en la Tabla 3,añadir HBV (HepG2.2.15 concentrado de sobrenadante), DMSO, PEG8000 y medio de infección a 1,5 ml de tubo de microcentrífuga. Preparar el stock CsA disolviéndolo en DMSO a una concentración de 5 mM y mantener la acción a -20 oC. La solución de trabajo de CsA es de 5 m. Semilla 1-10⁴ células por pozo de la placa de 48 pozos. Añadir 100 l de concentrado de HepG2.2.15 (que contiene HBV 1.5063 a 10⁷ GEq/mL) para infectar las células a 150 GEq/célula.
6. Añadir 500 l del complejo de infección a cada pocóculo e incubar las células a 37oC, 5% co₂ en incubadora humidificada durante 24 h.
7. Lavar las células dos veces con 500 ml de PBS antes de cambiar el medio. Añadir 1 ml del medio en cada pozo. Si el estado de la celda es deficiente y algunas celdas están flotando, cambie el medio directamente. Este es el día 1 de la infección. Cambie el medio suavemente cada 2 días.
8. En el día 11, lave las células dos veces con 500 oL de PBS y fije las células con metanol frío con hielo para la inmunofluorescencia.

6. HepG2.2.15 co-cultura con HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE

1. Añadir 1 ml/pozo de gelatina al 0,1% de gelatina a 5 pozos de 6 pozos. Incubar la placa a 37oC durante 2 h y desechar el sobrenadante. Incubar la placa de nuevo durante otras 2 h a 37oC para secar completamente el pozo.
2. Semilla 1 x 10⁵ celdas/pozo de HepG-NE en 2 pozos, 293T-NE-3NRs en 2 pozos, y 293T-NE en 1 pozo de la placa. Semilla 1 x 10⁵ células/pozo de HepG2.2.15 en cinco inserciones de membrana (24 mm, 0,4 m de diámetro de poro, sin recubrimiento) en una placa separada de 6 pozos. Incubar las células a 37oC, 5% CO₂ en una incubadora humidificada durante 24 h.
3. Después de 24 h, si todas las células son adherentes y están en buen estado, prepárate para el co-cultivo. Deseche el medio en los insertos de 6 placas y membranas celulares. Coloque los insertos de membrana con HepG2.2.15 en la placa de 6 pozos sembradas con HepG-NE, 293T-NE-3NRs y 293T-NE por pinzas. Incubar la célula a 37oC, 5% CO₂ en una incubadora humidificada, cambiar el medio cada 3-4 días.
   NOTA: Establecer grupos de la siguiente manera: Bueno 1: 293T-NE co-cultura con HepG 2.2.15; Bueno 2: Cocultura HepG2-NE con HepG 2.2.15; Bueno 3: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15; Bueno 4: Co-cultura HepG2-NE con HepG 2.2.15 (añadir CsA); Bueno 5: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15 (añadir CsA); Agregue el medio completo al número de pozo 1, 2 y 3, agregue el medio con 5 m CsA al pozo número 4 y 5 bien, alrededor de 9 ml para cada pozo, asegúrese de que los medios estén en contacto para que las partículas de virus migren desde transpocillos para infectar las células.
4. Después de 10 días, retire los insertos de membrana, agregue PBS a la placa de 6 pozos y lave suavemente dos veces, fije las células con metanol frío en frío para la inmunofluorescencia.

7. Realizar inmunofluorescencia para HBcAg

1. Fijar las células con metanol helado a -20 oC durante más de 3 h. Deseche el metanol. Lavar las células con PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente en la coctelera, repetir durante 3 veces.
2. Añadir 5% de BSA (placa de 100 l/48-pozo, placa de 500 l/6 bien), agitar en el agitador horizontal durante 1 h a 40 rpm y temperatura ambiente.
3. Añadir la solución de anticuerpos primarios HBcAg (anticuerpo primario: 5% de solución de BSA 1:200, 100 l / 48-well-plate, 500 l / 6-well-plate), agitar durante la noche a 4 oC.
4. Lavar los pozos con PBST (PBS con 0.1% de interpolación 20), durante 10 minutos a temperatura ambiente en la coctelera, repetir durante 3 veces.
5. Añadir la segunda solución de anticuerpos (594 anticuerpos etiquetados criados en cabra contra conejo IgG: PBS a 1:1.000, 100 l /48-bien-placa, 500 l / 6 bien-placa), cubrir la placa con papel de aluminio y agitar durante 2 h a temperatura ambiente.
6. Lavar de nuevo con PBST tres veces, agitar durante 10 minutos cada una.
7. Añadir 1 g/ml de DAPI, agitar durante 2 min. Lavar dos veces con PBST en una coctelera durante 5 minutos cada una. Deseche PBST. Añadir PBS y observar bajo microscopio de inmunofluorescencia.

Resultados

Construimos plásmido pSIN-NTCP-EGFP que expresa la fusión NTCP y EGFP y con resistencia a la puromicina. El plásmido fue trans infectado en células HepG2 y 293T para construir líneas celulares estables HepG2-NE y 293T-NE expresando NTCP y EGFP. Los Plásmidos (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) con resistencia y expresión de la puromicina fueron trans infectados en células 293T-NE para construir una línea celular estable que expresa 4 genes huésped^9. La expresión de NTCP-EGFP puede...

Discusión

Aquí, introducimos protocolos para la infección por VHB en células No hepáticas 293T-NE-3NR y HepG2-NE basadas en hepatoma. 293T-NE-3NR eran adecuados para la infección por VHB tanto en GEq alto como bajo. Los siguientes pasos críticos deben tenerse en cuenta al utilizar nuestro protocolo. El estado celular es un factor importante para una infección exitosa. El medio de infección debe cambiarse oportunamente después del período inicial de infección por VHB. Las células 293T-NE-3NRs son típicamente frágiles ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside