Modellazione dell'infezione da virus dell'epatite B nelle cellule non epatiche 293T-NE-3NRs

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'infezione da virus dell'epatite B (HBV) in nuove cellule 293T ingegnerizzate (293T-NE-3NRs, che esprime NTCP umana, HNF4, RXR e PPAR) e cellule epatiche tradizionali (HepG2-NE, che esprimono NTCP umani).

Abstract

L'HBV infetta principalmente gli epatociti umani, ma è stato anche trovato per infettare tessuti extraepatici come reni e testicoli. Ciò nonostante, i modelli HBV basati su cellule sono limitati alle linee cellulari dell'epatoma (come HepG2 e Huh7) sovraesprimendo un recettore HBV funzionale, il taurocholate di sodio co-trasportando polipeptide (NTCP). In questo caso, abbiamo utilizzato 293T-NE-3NRs (293T sovraesprimenti umani NTCP, HNF4, RXR e PPAR) e HepG2-NE (HepG2 sovraesprimendo NTCP) come linee cellulari del modello.   L'infezione da HBV in queste linee cellulari è stata eseguita utilizzando particelle di virus HBV concentrate da HepG2.2.15 o co-culcolando HepG2.2.15 con le linee cellulari di destinazione. L'immunofluorescenza HBcAg per HBcAg è stata eseguita per confermare l'infezione da HBV. I due metodi qui presentati ci aiuteranno a studiare l'infezione da HBV nelle linee cellulari non epatiche.

Introduzione

L'epatite B influisce sulla vita di oltre 2 miliardi di persone ed è una delle principali minacce per la salute pubblica. Circa 257 milioni di persone sono cronicamente infettate dal virus dell'epatite B (HBV) in tutto il mondo, causando un grande fardello per la società¹. Gli epatociti non sono le uniche cellule infettate da HBV e altre cellule nel tessuto non epatico, come rene e testicoli, sono anche infettate da questo virus^2,3. Attualmente, i modelli cellulari di infezione da HBV sono limitati agli epatociti umani con solo pochi modelli di linee cellulari non epatiche. Ciò ostacola lo studio dell'infezione da HBV e della patologia correlata all'HBV dei tessuti non epatici. Qui presentiamo protocolli per studiare l'infezione da HBV nelle cellule 293T non epatiche e nelle cellule a base di epatoma.

Il polipeptide co-trasporto del taurocholato di sodio (NTCP) è un recettore funzionale per l'epatite B umana e il virus dell'epatite D⁴. Il fattore nucleare di epatocita 4 (HNF4), il recettore X dei resinoidi ( ) e il recettore attivato dal proliferatore perossisoso (PPAR) sono fattori di trascrizione arricchiti di fegato che limitano il tropismo virale dell'HBV. Sono stati verificati per promuovere la sintesi dell'RNA pregenomico HBV e supportano la replicazione dell'HBV in una linea cellulare non epatoma⁵. Abbiamo costruito tre diverse linee cellulari, le linee cellulari HepG2 che esprimono NTCP (HepG2-NE), la linea cellulare 293T che esprime NTCP (293T-NE) e la linea cellulare 293T che esprime quattro geni ospiti; NTCP, HNF4, RXR e PPAR (293T-NE-3NRs). Sono stati sviluppati due metodi per l'infezione da HBV sulla base di 293T-NE-3NRs (Figura 1). Il primo metodo utilizza l'inoculazione in 293T-NE-3NR con elevata equivalenza genomica virale (alto GEq (150), DMSO e PEG8000) per 24 h. Il secondo metodo impiega la co-coltura 293T-NE-3NRs con HepG2.2.15, che può produrre particelle HBV (basso GEq (circa 1,83) senza DMSO e PEG8000), emulando così da vicino le condizioni naturali.

Le cellule HepG2.2.15 sono derivate dalla linea EpG2 e secernono cronicamente particelle infettive HBV, così come particelle subvirali nel mezzo di coltura^6,7. La ciclosporina A (CsA) è un immunosoppressore clinicamente utilizzato per la soppressione del rifiuto dello xenotrapianto. Gli studi hanno dimostrato che la CA inibisce l'ingresso dell'HBV negli epotociti coltivati inibendo l'attività di trasporto di NTCP e bloccando il legame di NTCP a grandi proteine di inviluppo⁸.

Le cellule EpG2-NE sono state usate come controllo positivo, mentre le cellule trattate dalla CsA sono state usate come controllo negativo. Confrontandoci con i gruppi di controllo positivi e negativi, possiamo scoprire quali geni ospiti svolgono un ruolo fondamentale nell'infezione da HBV. Inoltre, attraverso questa modalità di infezione da HBV, possiamo anche trovare altri nuovi meccanismi o geni ospiti coinvolti nell'infezione da HBV.

Protocollo

Coltura, raccolta di supernatanti da cellule HepG2.2.15 e infezione da HBV devono essere eseguite nel laboratorio di livello di biosicurezza II (P2) o di livello di biosicurezza III (P3) secondo le linee guida sulla biosicurezza nel paese. Le pratiche di sicurezza di laboratorio devono essere seguite per garantire la sicurezza del personale di laboratorio e tutte devono essere vaccinate e rilevate HBsAb positive prima di eseguire esperimenti HBV. Osservare lo stato delle cellule ad ogni passo prima di procedere al passaggio successivo. Campioni di siero umano sono stati utilizzati in conformità con l'approvazione ottenuta dal Institutional Review Board di Shantou University Medical College.

1. EpG2.2.15 coltura cellulare

NOTA: HepG2.2.15 cell supernatant, HepG2.2.15 cell supernatant concentrate e tutte le punte, fiasche, piastre e tubi che vengono in contatto con HepG2.2.15 devono essere disposti dopo essere stati immersi nel 2% di virucide durante la notte.

1. Togliere la fiala contenente le cellule HepG2.2.15 dall'azoto liquido e scongelare delicatamente la fiala in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi.
   NOTA: Per ridurre la possibilità di contaminazione, tenere il tappo fuori dall'acqua. Lo scongelamento deve essere rapido (circa 2 min).
2. Togliere la fiala dal bagno d'acqua non appena le cellule vengono scongelate e disinfettarla con il 70% di etanolo.
   NOTA: da questo punto eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche rigorose.
3. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale di 25 cm^e aggiungere 4 mL di mezzo di coltura completo (DMEM contenente 10% FBS, penicillina 100 U/mL, streptomicina 0,1 mg/mL). Incubare le cellule a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata con 5% di CO₂.

2. Collezione di EpG2.2.15 coltura cellulare supernatante

1. Cultura HepG2.2.15 cellule in flaconi T25 a 37 gradi centigradi, 5% CO₂ in un'incubatrice umidificata_. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
2. Raccogliere il supernatante cellulare in un tubo di centrifuga di 50 mL. Chiudere saldamente il coperchio e avvolgerlo con una pellicola di paraffina.
3. Conservare il supernatale EpG2.2.15 a -20 gradi centigradi per mantenere attivo il virus HBV.

3. Concentrare HepG2.2.15 supernatante

1. Rimuovere l'EpG2.2.15 supernata da -20 gradi centigradi e scongelare a 4 gradi centigradi.
2. Per rimuovere i frammenti cellulari, filtrare il supernatore HepG2.2.15 con una membrana di 0,45 m su un nuovo tubo di centrifugatura da 50 mL. In primo luogo, bloccare il filtro filtrando 10 mL di DMEM con 10% FBS prima di filtrare il virus, quindi filtrare il supernatante di coltura cellulare.
3. Aggiungere 14 mL di supernatali filtrati a una colonna concentratore di virus e chiudere il coperchio. Centrifugare la colonna a 3.200 x g per 35 min in una centrifuga rotante orizzontale. Raccogliere il concentrato supernatante EpG2.2.15 (circa 200 -L) in un tubo da 1,5 mL.
4. Lavare la colonna con DMEM una volta aggiungendo 200 L di DMEM e raccoglierla in un tubo da 1,5 mL.

4. Rilevamento del DNA HBV nel concentrato supernatante

1. Accendere il riscaldatore a blocchi asciutti e impostare la temperatura a 100 gradi centigradi.
2. Per garantire che la concentrazione del DNA HBV nel concentrato supernatante HepG2.2.15 rientri nell'intervallo di curve standard, diluire il concentrato di 20 volte aggiungendo 10 litri di concentrato supernata HepG2.2.15 a 190 .L di DMEM in un tubo di microcentrizzazione da 1,5 ml. Aggiungere 200 -L di EpG2.2.15 supernatante, controllo negativo (siero negativo HBV da donatore sano), controllo positivo HBV (HBV-positivo controllo dal paziente HBV) e quattro diluizioni dei riferimenti quantitativi forniti nel kit (2,0 x 10⁶, 2,0 x 10⁵, 2,0 x 10⁴, 2,0 x 10³ GEq /mL), rispettivamente per separare 1,5 mL microcentrifuga tubi.
3. Aggiungete dal kit 450 l di buffer di estrazione del DNA HBV a tutti gli otto tubi da 1,5 mL di cui sopra, vortice per 15 s e girare verso il basso per 10 s. Incubare a 100 gradi centigradi per 10 min nel riscaldatore a blocchi asciutti. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Aggiungete 27 -L di miscela master PCR e 3 l di enzima di polimerasi Taq ai tubi PCR posti sul ghiaccio.
   NOTA: il mix master PCR fornito nel kit contiene i primer contro la regione conservata del DNA HBV.
5. Aggiungere 20 l di liquido supernato centrifugato ai tubi PCR posti sul ghiaccio. Coprire saldamente e girare verso il basso per 10 s.
6. Utilizzare le seguenti condizioni su una macchina PCR in tempo reale: 93 s per 2 min, 10 cicli di 93 s per 45 s seguiti da 55 s per 60 s; poi 30 cicli di 93 gradi centigradi per 30 s sono stati di 55 gradi centigradi per 45 s per effettuare la PCR in tempo reale.
   NOTA: Il master mix fornito nel kit commerciale ha primer contro la regione conservata del DNA HBV.
7. Esportare i valori Ct ottenuti e generare una curva standard, come illustrato nella tabella 1 e nella figura 2.
8. Sulla base della curva standard, calcolare la concentrazione di DNA HBV di HepG2.2.15 concentrazione supernatante diluita 20x come mostrato nella tabella 2. Calcolare la concentrazione di DNA HBV di EpG2.2.15 concentrazione supernatante (Tabella 2).
9. Dividere il Supernatante EpG2.2.15 concentrarsi in aliquote e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.

5. Infezione in vitro delle cellule HepG2-NE e 293T-NE-3NRs

1. Preparare il seguente mezzo di infezione in DMEM/F-12: 10% FBS, 4 mM di integratore di glutammina, 0,1 mM NEAA, 1 mM di pyruvate di sodio, 100 penicillina U/mL, 100 streptomicina, 1g/m puroLmycin, 40 ng/mL dexamethasone, 20 g/mL di idrocortisione e 5 g/mL di insulina. Conservare a 4 gradi centigradi.
   NOTA: queste cellule positive NTCP sono resistenti alla puromycina⁹.
2. Aggiungere lo 0,1% di gelatina a 5 pozze di 48 pozzetto, 200 gradi a ogni pozzo. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2 ore, scartare il supernatante. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per altri 2 h.
3. Seme HepG2-NE ad una densità di 1 x 10⁴ cellule in 2 pozze ciascuna. Seme 293T-NE-3NRs cellule ad una densità di 1 x 10⁴ cellule in 2 pozzetti ciascuno (all-trans acido retinoico a 1 acido mol /l e clofibrico a 1 mmol /L concentrazioni finali sono stati aggiunti al mezzo per attivare i recettori dell'ormone nucleare RXR e PPAR, rispettivamente). Seme 293T-NE in 1 bene ad una densità di 1 x 10⁴ cellule.
   NOTA: Passaggio delle celle alla sottoconfluenza utilizzando 0,25% trypsin. Contare il numero di cella e quindi eseguire il seedo delle celle in una densità appropriata.
4. Incubare la cellula a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ in un'incubatrice umidificata per 24 h. Osservare le cellule dopo 24 h e procedere con l'infezione se le cellule sono sane.
5. Preparare il complesso di infezione come indicato nella tabella 3, aggiungere HBV (HepG2.2.15 supernatant concentrate), DMSO, PEG8000 e infezione medio a 1,5 mL tubo di microcentrifuga. Preparare lo stock di CsA sciogliendolo in DMSO a una concentrazione di 5 mM e mantenere lo stock a -20 oC. La soluzione di lavoro di CsA è 5 M. Seme 1x10⁴ celle per pozzo della piastra 48-bene. Aggiungere 100 L di Concentrato supernata 2.2.15 (contenente HBV 1.5063 x 10⁷ GEq/mL) per infettare le cellule a 150 GEq/cella.
6. Aggiungete 500 l del complesso di infezione in ogni pozzo e incubate le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ in incubatrice obibbificata per 24 h.
7. Lavare le cellule due volte con 500 gradi di PBS prima di cambiare il mezzo. Aggiungere 1 mL del mezzo in ogni pozzo. Se lo stato della cella è scarso e alcune celle sono mobili, modificare direttamente il mezzo. Questo è il giorno 1 dell'infezione. Cambiare il mezzo delicatamente ogni 2 giorni.
8. Il giorno 11, lavare le cellule due volte con 500 gradi l di PBS e fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza.

6. Co-cultura HepG2.2.15 con HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE

1. Aggiungere 1 mL/pozzetto di 0,1% di gelatina a 5 pozze di 6 pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2 ore e scartare il supernatante. Incubare nuovamente la piastra per altri 2 h a 37 gradi centigradi per asciugare completamente il pozzo.
2. Seme 1 x 10⁵ cellule / podio di EpG-NE in 2 pozzi, 293T-NE-3NRs in 2 pozzi, e 293T-NE in 1 pozzetto della piastra. Seme 1 x 10⁵ celle/po di HepG2.2.15 su cinque inserti a membrana (24 mm, diametro dei pori, senza strato) in una piastra 6 po separata. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ in un'incubatrice umidificata per 24 h.
3. Dopo 24 h, se le cellule sono tutte aderenti e in buono stato, prepararsi per la co-coltura. Eliminare il mezzo negli inserti a 6 piastra e membrana cellulare. Posizionare gli inserti a membrana con HepG2.2.15 nella piastra 6 pozzo seminato con HepG-NE, 293T-NE-3NRs e 293T-NE da pinzette. Incubare la cellula a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ in un'incubatrice umidificata, cambiare il mezzo ogni 3-4 giorni.
   NOTA: Impostare i gruppi come segue: Ben 1: 293T-NE co-cultura con HepG 2.2.15; 2: Co-cultura HepG2-NE con HepG 2.2.15; Bene 3: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15; Pozzo 4: Co-cultura HepG2-NE con HepG 2.2.15 (aggiungi CsA); Bene 5: 293T-NE-3NRs co-cultura con HepG2.2.15 (aggiungi CsA); Aggiungere il mezzo completo al numero 1, 2 e 3, aggiungere il mezzo con 5 SM CsA al pozzo numero 4 e 5, circa 9 mL per ogni pozzo, assicurarsi che i supporti siano in contatto affinché le particelle di virus migrano dai transwell per infettare le cellule.
4. Dopo 10 giorni, rimuovere gli inserti a membrana, aggiungere PBS alla piastra 6 e lavare delicatamente due volte, fissare le cellule con il metanolo freddo ghiaccio per l'immunofluorescenza.

7. Eseguire l'immunofluorescenza per HBcAg

1. Fissare le cellule con metanolo freddo ghiaccio a -20 gradi centigradi per più di 3 h. Scartare il metanolo. Lavare le celle con PBS per 10 min a temperatura ambiente su shaker, ripetere per 3 volte.
2. Aggiungete il 5% di BSA (100 a 48 piani, 500 l/6-pozzetti), agitare sullo shaker orizzontale per 1 h a 40 giri e temperatura ambiente.
3. Aggiungere la soluzione anticorpale primaria HBcAg (anticorpo primario: soluzione BSA del 5%: 1:200, 100 L / 48-well-plate, 500 l / 6-well-plate), agitare durante la notte a 4 gradi centigradi.
4. Lavare i pozzi con PBST (PBS con 0,1% tween 20), per 10 min a temperatura ambiente su shaker, ripetere per 3 volte.
5. Aggiungere la seconda soluzione anticorpale (594 anticorpi etichettati sollevati nella capra contro il coniglio IgG: PBS - 1:1.000, 100 L /48-well-plate, 500 - L / 6-well-plate), coprire la piastra con un foglio e agitare per 2 h a temperatura ambiente.
6. Lavare di nuovo con PBST per tre volte, agitare per 10 min ciascuno.
7. Aggiungere 1 g/mL DAPI, agitare per 2 min. Lavare due volte con PBST su uno shaker per 5 min ciascuno. Eliminare PBST. Aggiungere PBS e osservare al microscopio immunofluorescenza.

Risultati

Abbiamo costruito pSIN-NTCP-EGFP plasmid esprimendo la fusione NTCP ed EGFP e con resistenza puromycina. Il plasmide è stato trasincato nelle cellule HepG2 e 293T per costruire linee cellulari stabili HepG2-NE e 293T-NE esprimendo NTCP ed EGFP. Plasmids (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) con resistenza ed espressione sono stati transinfettati in cellule 293T-NE per costruire una linea cellulare stabile che esprime 4 geni host⁹. L'espressione di NTCP-EGFP può essere osservata dalla fluores...

Discussione

Qui, introduciamo protocolli per l'infezione da HBV in 293T-NE-3NR non epatici e cellule HepG2-NE basate sull'epatoma. 293T-NE-3NRs erano adatti per l'infezione da HBV sia ad alto che a basso GEq. I seguenti passaggi critici devono essere presi in considerazione durante l'utilizzo del nostro protocollo. Lo stato della cellula è un fattore importante per un'infezione di successo. Il mezzo di infezione deve essere cambiato tempestivamente dopo il periodo iniziale dell'infezione da HBV. Le cellule 293T-NE-3NRs sono tipicam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside