Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Zusammenfassung

HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien.   Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.

Einleitung

Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was die^Gesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert^2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.

Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus⁴. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie⁵zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.

HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium^6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert⁸.

HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.

Protokoll

Kultur, Sammlung von Überstandstoffen aus HepG2.2.15-Zellen und HBV-Infektion sollte in Biosicherheits-Level II (P2) oder Biosicherheits-Level III (P3) Labor nach der Biosicherheits-Anleitung im Land durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle sollten geimpft und HBsAb-positiv nachgewiesen werden, bevor HBV-Experimente durchgeführt werden. Beobachten Sie den Zustand der Zellen bei jedem Schritt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Menschliche Serumproben wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung verwendet, die vom Institutional Review Board des Shantou University Medical College erhalten wurde.

1. HepG2.2.15 Zellkultur

HINWEIS: HepG2.2.15 Zellüberstand, HepG2.2.15 Zellüberstandkonzentrat und alle Spitzen, Kolben, Platten und Schläuche, die in Kontakt mit HepG2.2.15 kommen, sollten entsorgt werden, nachdem sie über Nacht in 2% Viruziden eingeweicht wurden.

1. Entfernen Sie die Durchstechflasche mit HepG2.2.15-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie auf, indem Sie die Durchstechflasche in einem 37 °C-Wasserbad sanft wirbeln.
   HINWEIS: Um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren, halten Sie die Kappe aus dem Wasser. Das Auftauen sollte schnell erfolgen (ca. 2 min).
2. Entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad, sobald die Zellen aufgetaut sind, und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Führen Sie von diesem Punkt aus alle Schritte unter strengen aseptischen Bedingungen aus.
3. Übertragen Sie die Zellen in einen 25 cm² Gewebekulturkolben und fügen Sie 4 ml komplettes Kulturmedium hinzu (DMEM mit 10% FBS, Penicillin 100 U/ml, Streptomycin 0,1 mg/ml). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%_CO2.

2. Sammlung von HepG2.2.15 Zellkultur Überstand

1. Kultur HepG2.2.15 Zelle in T25-Flaschen bei 37 °C, 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator_. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.
2. Sammeln Sie den Zellüberstand in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Schließen Sie den Deckel fest und wickeln Sie ihn mit einem Paraffinfilm.
3. Bewahren Sie den HepG2.2.15 Überstand bei -20 °C auf, um das HBV-Virus aktiv zu halten.

3. Konzentrierender HepG2.2.15 Überstand

1. HepG2.2.15 Überstand von -20 °C entfernen und bei 4 °C auftauen.
2. Um die Zellfragmente zu entfernen, filtern Sie den HepG2.2.15 Überstand mit einer 0,45 m Membran auf ein neues 50 ml Zentrifugenrohr. Blockieren Sie zunächst den Filter, indem Sie 10 ml DMEM mit 10 % FBS filtern, bevor Sie den Virus filtern, und filtern Sie dann den Zellkulturüberstand.
3. Fügen Sie 14 ml gefilterten Überstand zu einer Viruskonzentratorsäule hinzu und schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie die Säule bei 3.200 x g für 35 min in einer horizontal enkreizten Zentrifuge. Sammeln Sie das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (ca. 200 l) in ein 1,5 ml Rohr.
4. Waschen Sie die Säule einmal mit DMEM, indem Sie 200 L DMEM hinzufügen und in ein 1,5 ml-Rohr einsammeln.

4. Nachweis der HBV-DNA in Überstandkonzentrat

1. Schalten Sie den Trockenblockheizer ein und stellen Sie die Temperatur auf 100 °C ein.
2. Um sicherzustellen, dass die Konzentration der HBV-DNA im HepG2.2.15-Überstandkonzentrat innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt, verdünnen Sie das Konzentrat 20-fach, indem Sie 10 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat zu 190 l DMEM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzufügen. Fügen Sie 200 L HepG2.2.15 Überstand hinzu, Negativkontrolle (HBV-negatives Serum von gesundem Spender), HBV-Positivkontrolle (HBV-positives Serum vom HBV-Patienten) und vier Verdünnungen der im Kit enthaltenen quantitativen Referenzen (2,0 x 10⁶, 2,0 x 10⁵, 2,0 x 10⁴, 2,0 x 10³ GEq /ml) bzw. 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren zu trennen.
3. Fügen Sie 450 l HBV DNA-Extraktionspuffer aus dem Kit zu allen oben genannten acht 1,5 ml-Röhren, Wirbel für 15 s und Spin-down für 10 s. Inkubieren bei 100 °C für 10 min in trockenen Blockheizung. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 27 L PCR-Master-Mix und 3 l Taq-Polymerase-Enzym hinzu.
   HINWEIS: Der im Kit enthaltene PCR-Master-Mix enthält die Primer gegen den konservierten Bereich der HBV-DNA.
5. Fügen Sie den auf Eis platzierten PCR-Röhren 20 L zentrifugierte übergroße Flüssigkeit hinzu. Decken Sie fest und drehen Sie nach unten für 10 s.
6. Verwenden Sie die folgenden Bedingungen auf einer Echtzeit-PCR-Maschine: 93 °C für 2 min, 10 Zyklen von 93 °C für 45 s gefolgt von 55 °C für 60 s; dann 30 Zyklen von 93 °C für 30 s gefolgt von 55 °C für 45 s, um Echtzeit-PCR durchzuführen.
   HINWEIS: Der Im kommerziellen Kit enthaltene Master-Mix hat Primer gegen die konservierte Region der HBV-DNA.
7. Exportieren Sie die erhaltenen Ct-Werte und erzeugen Sie eine Standardkurve, wie in Tabelle 1 und Abbildung 2dargestellt.
8. Berechnen Sie auf Basis der Standardkurve die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat verdünnt 20x, wie in Tabelle 2dargestellt. Berechnen Sie die HBV-DNA-Konzentration von HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (Tabelle 2).
9. Das HepG2.2.15 Überstandkonzentrat in Aliquots aufteilen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.

5. In-vitro-Infektion von HepG2-NE- und 293T-NE-3NRs-Zellen

1. Bereiten Sie das folgende Infektionsmedium in DMEM/F-12 vor: 10% FBS, 4 mM Glutamin-Ergänzung, 0,1 mM NEAA, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin, 1 g/ml Puromycin, 40 ng/ml Dexamethason, 20 g/ml Hydrocortison und 5 g/ml Insulin. Bei 4 °C lagern.
   HINWEIS: Diese NTCP-positiven Zellen sind puromycinresistent⁹.
2. Fügen Sie 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 48 Well-Platte, 200 l zu jedem Brunnen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h, entsorgen Sie den Überstand. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für weitere 2 h.
3. Seed HepG2-NE mit einer Dichte von 1 x 10⁴ Zellen in je 2 Brunnen. Samen 293T-NE-3NRs-Zellen mit einer Dichte von 1 x 10⁴ Zellen in jeweils 2 Brunnen (Alltrans-Retinsäure bei 1 mol/L und Clofibricsäure bei 1 mmol/L Endkonzentrationen wurden dem Medium zugesetzt, um die RXR- bzw. PPAR-Kernhormonrezeptoren zu aktivieren). Samen 293T-NE in 1 Brunnen mit einer Dichte von 1 x 10⁴ Zellen.
   HINWEIS: Durchfluss der Zellen bei Derkonfluss mit 0,25% Trypsin. Zählen Sie die Zellenzahl, und säen Sie die Zellen dann auf eine entsprechende Dichte.
4. Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h. Beobachten Sie die Zellen nach 24 h und setzen Sie die Infektion fort, wenn die Zellen gesund sind.
5. Bereiten Sie den Infektionskomplex wie in Tabelle 3erwähnt, fügen HBV (HepG2.2.15 Überstand konzentrat), DMSO, PEG8000 und Infektionsmedium bis 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr hinzu. Bereiten Sie den CsA-Bestand vor, indem Sie ihn in DMSO auf eine Konzentration von 5 mM auflösen und den Bestand bei -20 oC halten. Die Arbeitslösung von CsA beträgt 5 m. Samen 1 x 10⁴ Zellen pro Brunnen der 48-Well-Platte. Fügen Sie 100 l HepG2.2.15 Überstandkonzentrat (mit HBV 1.5063 bei 10⁷ GEq/ml) hinzu, um Zellen bei 150 GEq/Zelle zu infizieren.
6. Fügen Sie jedem Brunnen 500 l des Infektionskomplexes hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 %_CO2 im befeuchteten Inkubator für 24 h.
7. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 l PBS, bevor Sie das Medium wechseln. Fügen Sie 1 ml des Mediums in jedem Brunnen hinzu. Wenn der Zellenzustand schlecht ist und einige Zellen schweben, ändern Sie das Medium direkt. Dies ist Tag 1 der Infektion. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage sanft.
8. Waschen Sie die Zellen am 11. Tag zweimal mit 500 l PBS und fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz.

6. HepG2.2.15 Co-Kultur mit HepG2-NE / 293T-NE-3NRs / 293T-NE

1. 1 ml/Gut von 0,1% Gelatine zu 5 Brunnen von 6 Well-Platte hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 2 h und entsorgen Sie den Überstand. Die Platte noch mal für weitere 2 h bei 37 °C bebrüten, um den Brunnen vollständig zu trocknen.
2. Samen 1 x 10⁵ Zellen/Brunnen von HepG-NE in 2 Brunnen, 293T-NE-3NRs in 2 Bohrungen und 293T-NE in 1 Bohrgut der Platte. Samen 1 x 10⁵ Zellen/Gut von HepG2.2.15 auf fünf Membraneinsätze (24 mm, 0,4 m Porendurchmesser, unbeschichtet) in einer separaten 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator für 24 h.
3. Nach 24 h, wenn die Zellen alle anhaftend und in gutem Zustand sind, bereiten Sie sich auf die Co-Kultur vor. Entsorgen Sie das Medium in den 6-Well-Platten- und Zellmembraneinsätzen. Legen Sie die Membraneinsätze mit HepG2.2.15 in die 6 Wellplatte, die mit HepG-NE, 293T-NE-3NRs und 293T-NE durch Pinzette gesät ist. Inkubieren Sie die Zelle bei 37 °C, 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator, ändern Sie das Medium alle 3-4 Tage.
   HINWEIS: Stellen Sie Gruppen wie folgt ein: Nun 1: 293T-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 2: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15; Gut 3: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15; Gut 4: HepG2-NE Co-Kultur mit HepG 2.2.15 (CsA hinzufügen); Gut 5: 293T-NE-3NRs Co-Kultur mit HepG2.2.15 (CsA hinzufügen); Fügen Sie das komplette Medium zu gut Nummer 1, 2 und 3 hinzu, fügen Sie das Medium mit 5 'M CsA zu gut 4 und 5 gut hinzu, ca. 9 ml für jeden Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Medien in Kontakt sind, damit Viruspartikel von Transwells migrieren, um Zellen zu infizieren.
4. Nach 10 Tagen die Membraneinsätze entfernen, PBS auf die 6-Well-Platte geben und zweimal sanft waschen, die Zellen mit eiskaltem Methanol zur Immunfluoreszenz fixieren.

7. Durchführen der Immunfluoreszenz für HBcAg

1. Fixieren Sie die Zellen mit eiskaltem Methanol bei -20 °C für mehr als 3 h. Entsorgen Sie das Methanol. Waschen Sie die Zellen mit PBS für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 Mal.
2. 5% BSA (100 l/48-Well-Platte, 500 l/6-Well-Platte) hinzufügen, auf horizontalem Shaker für 1 h bei 40 Rpm und Raumtemperatur schütteln.
3. Fügen Sie die HBcAg Primärantikörperlösung (Primärantikörper: 5% BSA-Lösung =1:200, 100 l / 48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte) hinzu, über Nacht bei 4 °C schütteln.
4. Waschen Sie Brunnen mit PBST (PBS mit 0,1% Tween 20), für 10 min bei Raumtemperatur auf Shaker, wiederholen Sie für 3 mal.
5. Fügen Sie die zweite Antikörperlösung (594 beschrifteter Antikörper, der in Ziege gegen Kaninchen IgG aufgezogen wird: PBS = 1:1.000, 100 l /48-Well-Platte, 500 l / 6-Well-Platte), bedecken Sie die Platte mit Folie und schütteln Sie für 2 h bei Raumtemperatur.
6. Dreimal mit PBST waschen, jeweils 10 min schütteln.
7. Fügen Sie 1 g/ml DAPI hinzu, schütteln Sie 2 min. Zweimal mit PBST auf einem Shaker für jeweils 5 min waschen. PBST verwerfen. PBS hinzufügen und unter Immunfluoreszenzmikroskop beobachten.

Ergebnisse

Wir konstruierten pSIN-NTCP-EGFP Plasmid, das NTCP und EGFP Fusion und mit Puromycin-Resistenz ausdrückt. Das Plasmid wurde in HepG2- und 293T-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien HepG2-NE und 293T-NE zu konstruieren, die NTCP und EGFP exzättieren. Plasmide (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) mit Puromycinresistenz und Expression wurden in 293T-NE-Zellen transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu konstruieren, die 4 Wirtsgene⁹exektiert. Die Expression von NTCP-EGFP kann durch grüne ...

Diskussion

Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45μm membrane filter	Millex-HV	SLHU033RB	Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG	ZSGB-BIO	ZF-0516	For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate	BIOFIL	TCP010006	For co-culture
Amicon Ultra 15 ml	Millipore	UFC910008	For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA	Beyotime	ST023	For immunofluorescence assay
Cyclosporin A	Sangon biotech	59865-13-3	inhibitor of HBV infection
DAPI	Beyotime	C1006	For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)	DAAN GENE	7265-2013	For HBV DNA detection
DMEM	HyClong	SH30243.01	For culture medium
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879	For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum (FBS)	CLARK Bioscience	FB25015	For culture medium
Fluorescence microscope	ZEISS	Axio observer Z1	For immunofluorescence assay
HepG2-NE	Laboratory construction	——	Cell model for HBV infection
HBcAg antibody	ZSGB-BIO	ZA-0121	For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS	ZSGB-BIO	ZLI-9062	For cell wash
PEG8000	Merck	P8260	For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Thermo Fisher	10378016	For culture medium
Transwell	CORNING	3412	For co-culture
Tween 20	sigma-Aldrich	WXBB7485V	For PBST
Virkon	Douban	6971728840012	Viruside