アキソロトル四肢再生中のフルスキンフラップ手術による創傷表皮形成の阻害

要約

本稿では、切断面上に全厚皮膚を直ちに縫合することにより、軸索四肢再生時の創傷表皮形成を抑制する外科的方法を実行する方法を説明する。この方法により、研究者は四肢再生の初期段階における創傷表皮の機能的役割を調査することができます。

要約

前世紀にわたるサンショウウオ再生生物学における古典的な実験は、創傷表皮が切断後に急速に形成され、四肢再生に必要とされる重要なシグナル伝達構造であることを長い間確立してきた。しかし、過去数十年にわたり、その正確な機能を分子レベルで研究する方法は、サンショウウオモデルシステムで利用可能な正確な機能技術とゲノム情報の不足のために制限されてきた。近年のシーケンシング技術の多さと、さまざまなサンショウウオゲノムの公開、CRISPRを含む機能的遺伝子検査法の出現により、これらの基礎実験を前例のない分子分解能で再考することが可能になりました。ここでは、切断直後の創傷表皮形成を阻害するために、古典的に開発されたフルスキンフラップ(FSF)手術を成人の軸索軟体において行う方法について説明する。創傷表皮は、通常、切断面に近い皮膚における上皮細胞の遠位移動を介して形成され、創傷を外部環境から遮断する。手術では、切断面上に全厚の皮膚(表皮層と真皮層の両方を含む)を直ちに縫合して、上皮細胞の遊走および根底にある損傷した間葉系組織との接触を妨げる。手術が成功すると、芽球腫形成および四肢再生の阻害が生じる。この手術方法を現代の下流の分子および機能分析と組み合わせることにより、研究者は四肢再生中の創傷表皮機能および生物学の分子基盤を明らかにし始めることができる。

概要

Lazzaro Spallanzaniが17681年に報告して以来、サンショウウオの四肢再生は、何世紀にもわたって生物学者を魅了してきた最もよく研究された自然再生現象の1つです。四肢の再生の成功は、芽球腫として知られる未分化の細胞構造の形成、伸長、およびその後のパターン化にかかっています。研究者らは、芽球腫の細胞組成と、その形成にどの支持組織および細胞型が必要であるかを理解する上で大きな進歩を遂げました2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .しかし、芽球腫形成の開始につながる異なる組織および細胞型間の協調シグナル伝達機構は、ほとんど理解されていないままである。

芽球腫の形成と再生を成功させるための重要な要件は、切断後12時間以内に切断面を覆う一過性の特殊な上皮である創傷表皮です¹⁰。切断に続いて、損傷に近位にある無傷の皮膚から上皮細胞は、切断面上を急速に移動し、薄い創傷上皮¹⁴を形成する。次の数週間で芽球腫が形成されると、初期の創傷表皮は、頂端上皮キャップ(AEC)と呼ばれるより厚い上皮シグナル伝達構造に発達する¹⁵。通常の全厚皮膚は基底薄層によって分離された上皮層と真皮層の両方を含むが、創傷表皮/ AECは上皮層のみからなり、基底薄層を欠いている^16,17。基底薄層および真皮の不在は、創傷上皮細胞と下層組織との間の直接接触を可能にし、これは、芽球腫形成および維持の両方にとって重要である2つの区画間の双方向シグナル伝達を促進する^17,18。

古典的な実験的研究は、創傷表皮/AECの機能およびその形成を阻害することによって必要性を探るために、様々な革新的な外科的方法を考案した。これらの方法には、縫合¹⁹または切断面上の全厚皮膚^20,21の移植、切断された四肢の体腔内への即時縫合²²、および早期創傷表皮および^AEC23,24の毎日の連続的な除去または照射が含まれていた。全体として、これらの実験は創傷表皮/AECの重要性を確立しただけでなく、再生中は前駆細胞増殖と芽球外生を維持するだけでなく、初期の組織組織溶解におけるその役割をさらに決定しました¹³。

しかし、これらの以前の研究は、組織学的染色および細胞増殖を追跡するためのトリチウム化チミジンパルスに大きく制限されていた。実際、サンショウウオにおける現代のシーケンシング技術と機能的技術を用いてこれらの古典的な実験を再考することはごく最近になって行われ、再生の初期段階における炎症およびECM分解/沈着を調節する上で創傷表皮に対するさらなる役割の発見につながった²⁵。様々なサンショウウオゲノムおよびトランスクリプトーム配列26,27,28,29,30,31,32,33,34の放出、ならびにサンショウウオ種で利用可能な機能的方法の急増^{により11,35,36,37,38}研究者らは現在、創傷表皮の形成、機能、およびAEC発生を駆動する分子メカニズムを解明し始めるのに有利な立場にある。

残念なことに、創傷表皮形成を阻害するために使用されるこれらの古典的な方法のいくつかは技術的に困難であり、同じ実験における生物学的複製間の再現性に困難を提示する。例えば、移植片が最終的に宿主の四肢から脱落する可能性があり、創傷表皮/ AECの毎日の除去は、基礎となる組織を損傷することなく困難であるため、皮膚移植片を維持することは困難な場合がある。さらに、切断された四肢を体腔内に縫合することは困難であり、挿入部位で追加の傷害も必要とする。一方、切断面のすぐ上に全厚の皮膚を縫合することは比較的簡単で、技術的に再現性があり、組織損傷を最小限に抑えます。このフルスキンフラップ(FSF)外科的方法は、1976年にアンソニー・メッシャーによって成体のイモリ(Notophthalmus viridiscens)で以前に開発されました。彼は、FSF手術が切断面上での上皮細胞移動と上皮細胞と下層組織との間の直接接触の両方を禁止することによって、創傷表皮の形成および機能を阻害することを実証した。

ここでは、この外科的処置を、軸索四肢を用いて段階的に示している。現代の分子およびシーケンシング技術と組み合わせることで、この技術は、研究者が創傷表皮/ AECの形成および四肢再生中の機能についての理解を深めるために非常に有用であることが証明されるかもしれない。

プロトコル

すべての動物実験は、ハーバード大学のIACUC(プロトコル#:11-32)およびAAALACガイドラインに従って実施した。

1. 麻酔と回復のための解決策とセットアップの準備

1. 麻酔のための新鮮な0.1%トリカイン溶液および回収のための0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製する。関連する研究機関で承認されたIACUCプロトコルに従って、水を使用してアキソロトル飼育に適した溶液³⁷ を作ります(例えば、ホルトフレターのソリューションを修正しました)。溶液がよく混合され、アクソロトル全体を沈めるのに十分な量が準備されていることを確認してください。
   1. 0.1%トリカイン溶液を調製するには、1gのトリカインおよび1gの炭酸水素ナトリウムを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。
   2. 0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製するには、スルファメラジンナトリウム塩5gを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。スルファメラジン溶液は、外科的回復中の細菌感染を防止する抗生物質である。
2. Clidox-Sまたは70%エタノールで噴霧して手術領域を消毒する。手術器具(鉗子、解剖はさみ、スプリングはさみ)をオートクレーブで滅菌します。複数回の手術を行う場合は、動物同士の熱いビーズ滅菌器で手術器具を滅菌してください。
3. 回収エリアを設定するには、15cmのペトリ皿またはアクソロトルに収まる容器を、湿った氷で満たされたバケツの上に置きます。ペトリ皿に低レベルの0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を充填し、アキソロトルが完全に水没しないようにする。手術後の氷上での回復は、麻酔から目覚めている間、動物の動きを遅らせ、縫合された領域を比較的邪魔されずに治癒することを可能にする。
   注:この設定は、研究者が利用可能な材料に応じてカスタマイズできます。

2.フルスキンフラップ手術を行う

1. アキソロトルを0.1%トリカイン溶液の容器に浸すことによって麻酔する。これには約15〜20分かかります。尾のピンチを行うことによって、軸索が実際に完全に麻酔されていることを確認してください。軸索からの応答がない場合は、手術を続行します.
   注:この手術には、古くて大きなアキソロトル(少なくとも15cmのサイズ)を使用してください。プラスチックピペットを使用してアキソロトル系水で定期的に皮膚を濡らすことにより、手術中、アキソロトルが十分に水分補給されたままであることを確認してください。手術前に滅菌PBSでその領域を灌漑することによって、手術部位を無菌的に準備するようにしてください。動物はまた、処置のために滅菌外科用ドレープの上に置かれるべきである。
2. 解剖はさみを用いて、ゼウゴポディアル骨格要素の遠位端で四肢切断を行う(図1.1)。
3. スプリングハサミを使用して、皮膚の腹部に小さな切開(約2mm)を行います(図1.2)。
4. 鉗子を使用して、皮膚をゼウゴポディアル骨格要素のほぼ正中線まで慎重に剥がし、基礎となる四肢組織(筋肉、骨など)を露出させる。(図 1.3)。皮膚を傷つけないようにしてください。ステップ 2.8 の後の注を参照してください。
5. 外科用はさみを使用して、ゼウゴポッドの正中線で露出した下肢組織を切断する(図1.4)。
6. 外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。
   注:これは、治癒の改善を確実にし、突き出た骨が縫合されたフラップに対してギザギザになり、後で無傷の皮膚フラップの完全性を混乱させる可能性があるため、手術の成功を高めるためにも必要です。
7. 鉗子を使用して、余分な全厚皮膚を切断面上に慎重に引っ張り、露出した下層組織を覆い、腹側全厚皮膚と接続して縫合糸を所定の位置に収めます(図1.5)。
8. 皮膚フラップの残りの左右を無傷の皮膚の腹側部分に縫合する。これは、フラップの側面を「十字」の方法で縫合するか(推奨)(図1.6-1.9)、または単に腹側皮膚にまっすぐに縫合することによって行うことができます。縫合には鉗子と湾曲したスプリングハサミを使用してください。露出した下層の組織が見えず、縫合糸がしっかりと結ばれていることを確認してください(少なくとも3回結び目があります)。
   注:手順2.4、2.7-2.8で無傷の皮膚が損傷していないことが重要です。我々は、全厚皮膚への損傷が、損傷領域がまだ小さな創傷表皮を形成する可能性があるため、失敗した手術と相関していることを見出した。可能であれば、全厚の皮膚フラップを手渡すときは、鈍い一対の鉗子を使用してみてください。
9. 外科用はさみで中顎動物レベルで切断することにより、対側肢の切断(オプションの内部動物制御)を行う。外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。
   注:同じ動物におけるステップ4中の手術の成功をよりよく評価するために、内部対側肢制御を行うことができます。しかしながら、別の動物における同じ四肢の切断もまた、対照として役立つために使用され得る。

3. 術後の回復とケア

1. 手術が完了したら、キムワイプまたは滅菌ペーパータオルを容器またはペトリ皿の底に置き、濡らします。動物をぬるま湯の上の容器に入れ、キムワイプまたはペーパータオルの露出した端を動物の上の周りに静かに包み込み、スルファメラジン溶液で十分に水分補給してください。麻酔からの回復中に最小限の動きを確実にするために、30分から1時間湿った氷の上に放置する。
2. 動物を0.5%スルファメラジン溶液で静的な収容容器に入れる。Axolotlsは、感染を防ぐために最初の24時間この溶液に留まらなければなりません。
3. アキソロトルを通常のシステム水に入れ、毎日健康状態を監視します。縫合糸が毎日落ちないように注意してください、これは結果を混乱させる小さな創傷表皮の形成をもたらす可能性があるので。
   注:ハウジング容器に、アクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認し、アクソロトルの縫合肢が容器の側面に接触する可能性を最小限に抑えてください。これは、縫合糸が所定の位置にとどまることを確実にするのに役立ちます, 特に手術後の最初の週に.

4. 実体顕微鏡による手術の成功評価

注:少なくとも週に1回は実体顕微鏡で動物をチェックし、皮膚全体のフラップの完全性と手術の成功を評価することをお勧めします。

1. ステップ2.1のように0.1%トリカインでアキソロトルを麻酔する。容器にアクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認してください。
2. 術後最初の2週間に検査する場合は、実体顕微鏡を使用して縫合された四肢を検査し、縫合糸が飛び出していないこと、および透明な薄い創傷表皮がどこにも見えないことを確認します。術後3週目以降に検査する場合は、芽球腫が形成されていないことを確認し、正常な対照切断された四肢(同じ動物または別の動物のいずれかから)が再生中にどのように進行したか(すなわち、芽球腫が形成されたかどうか)と比較する。
3. 完了したら、アキソロトルを通常のシステムの水と飼育条件に戻します。

結果

この外科的プロトコールは、創傷表皮形成の完全な阻害(図1)を可能にし、最終的には四肢再生を可能にする。手術が成功すると、動物の大きさに応じて約2〜3週間で芽球腫の形成は生じませんが、コントロール再生肢は正常に芽球腫を形成するはずです。

研究者は、縫合された四肢を肉眼で2〜3日ごとに検査して、縫合糸が飛び出していないこと、および芽球腫が形成されていないことを確認する必要があります。縫合糸の1つ以上が飛び出しても、創傷表皮が依然として形成され、その結果、小または大きな芽球腫が発生し、手術が失敗する可能性があります(図2)。さらに、研究者は、切断表面のどこにも薄い創傷表皮が明らかでないことを確認するために、実体顕微鏡下で少なくとも毎週1回縫合された四肢を検査すべきである。比較のために、研究者らはまた、切断面上に創傷表皮を有し、2〜3週間にわたって芽球腫を形成するはずの再生四肢の対照を調べるべきである。創傷表皮は薄くて透明に見えるが、正常な皮膚は、白血病性、アルビノ性、または野生型のアクソロトルにおいて、それぞれより不透明で淡いピンク色(ほぼ白色)、淡黄色、または濃い緑色に見える。

研究者が2〜3週間で芽球腫形成段階の前に組織を採取したい場合は、サンプル採取前に縫合された四肢を検査して、縫合糸が所定の位置に留まり、小さな創傷表皮が形成されていないことを確認する必要があります。さらに、縫合された四肢組織を矢状に切片化し、任意の時点で組織学的解析を行うことで、切断面全体を囲む皮膚全部フラップからの真皮の存在および創傷表皮の不在を確認することもできる(図3)。

図1:フルスキンフラップ手術のステップの概略図。
プロトコルの手順には番号が付けられ、図解されています。点線は、プロトコルのステップ1および3における切断の平面を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:フルスキンフラップ手術の成功例と失敗例
切断後25日目(dpa)における手術成功(左)、手術不成功(右)、および対照再生肢(手術なし)を受けた四肢の代表的な明視野画像。成功した手術は、完全な皮膚フラップが縫合された平らな切断面を有するが、失敗した手術は、小さな芽腫を発症する。矢印は切断面を示し、白い点線は成功した手術における芽球腫の不在と失敗した手術における芽球腫の存在の視覚化を助け、再生肢を制御する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:正常再生およびFSF縫合四肢の組織学的染色。
(A-B')再生(A−A ́)および縫合された軸索四肢(B−B ́)からのピクロマロリー染色切片の代表的な明視野画像。AおよびBのインセットは、それぞれA'およびB'で示されている。コラーゲンを多く含む真皮層は、縫合された四肢で切断面全体を覆います。切断面はA−Bにおいて矢印で表記される。スケールバーは500μmを表す。この図は蔡ら²⁵から翻案されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、創傷表皮形成を阻害するために軸索四肢において皮膚全皮フラップ手術を行うためのプロトコルについて説明する。この手術は、創傷表皮形成を阻害する他の方法と比較して比較的簡単で技術的に再現可能であるが、手術の成功に影響を与える可能性のあるいくつかの重要なステップがある。まず、露出した下層組織の上に無傷のフルスキンフラップを引っ張るとき、フルスキンがいかなる方法でも損傷を受けないことが最も重要である。皮膚フラップの損傷は依然として小さな創傷表皮の形成をもたらし、これは小さな芽球腫様の伸長をもたらし得る。第二に、術後ケア中に縫合糸が抜けないようにし、小さな創傷表皮の形成にもつながり得る。この点まで、縫合された四肢と任意の表面との間の潜在的な接触を最小限に抑えることは、特に手術後の最初の週に重要である。これを防ぐいくつかの方法は、アキソロトルが手術後に動き回るのに十分なスペースがあるように、十分に大きな容器にアキソロトルを収容し、麻酔をかけることを伴う。

この手術にはいくつかの制限もあります。おそらく最も注目すべきは、手術の成功は2つの方法でしか評価できないということです:手術の最初の2週間に解剖範囲を使用して創傷表皮の不在を検索すること、および/または3週間以内に芽球腫が形成されるかどうかをチェックする。これらの方法は効果的ですが、スループットは比較的低くなります。創傷表皮特異的マーカーのための将来のトランスジェニックレポーターaxolotlsの開発は、成功した手術と失敗した手術のより迅速なスクリーニングに役立つ可能性がある。さらに、この手術は、無傷の皮膚がより壊れやすいため、若い動物に行うことがより困難です。したがって、亜成体または成人の軸索を使用することが推奨される。

この手術はもともとN. viridiscens19で開発されましたが、axolotls25,39に容易に適応されており、他のサンショウウオ種にも適用できる可能性があります。要約すると、この技術を将来の四肢再生研究に適用することで、研究者は創傷表皮生物学に対処するためのより多くのツールを開発し、芽球腫形成を開始する際にその機能を駆動する根底にあるメカニズムを特定することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curved spring scissors	Fine Scientific Tools	15009-08
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	886-86-2
Forceps	Fine Scientific Tools	11252-40	Need two pairs
Nylon monofilament sutures (9-0)	Roboz	SUT-1000-21
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Stereo microscope	Leica	MZ6
Sulfamerazine sodium salt	Sigma-Aldrich	127-58-2
Surgical scissors	Fine Scientific Tools	14002-14