ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

要約

λ-Red媒介組換え系を用いて、小さなノンコーディングRNA micCの欠失変異体を作製した。

要約

ノンコーディング低分子RNA(sRNA)は、転写後レベルで遺伝子発現を制御する新しい因子です。大腸菌やネズミチフス菌で知られている一種のsRNA MicCは、外膜タンパク質の発現を抑制する可能性があります。サルモネラ・エンテリティディスにおけるmicCの制御機能をさらに調べるために、サルモネラ・エンテリティディス50336株のmicC遺伝子をクローニングし、λRedベースの組換えシステムによって変異体50336Δ micCを構築し、miccを発現する組換えプラスミドpBR322を保有する相補変異体50336ΔmicC/p micCを構築しました。 qRT-PCRの結果、50336Δ micCにおけるompDの転写は野生株のそれより1.3倍高く、50336ΔmicCにおけるompAおよびompCの転写は野生株のそれより2.2倍および3倍高いことが示された。 これらは、micCがompAおよびompCの発現を抑制することを示した。以下の研究では、50336ΔmicCの病原性は、6週齢のBalb / cマウスと1日齢のニワトリの両方に感染することによって検出されました。その結果、6週齢のBalb/cマウスの野生株50336の_LD50、変異株50336ΔmicCおよび50336Δ micC/pmicCは、それぞれ12.59 CFU、5.01 CFU、および19.95 CFUであることが示された。1日齢ニワトリの_LD50株は,それぞれ1.13 x 10⁹ CFU,1.55 x 10 8 CFU,2.54 x 10⁸ CFUであった。micCの欠失がSの病原性を亢進させることを示した。 外膜タンパク質の発現を調節することにより、マウスおよびニワトリにおける腸炎。

概要

ノンコード低分子RNA(sRNA)は40〜400ヌクレオチド長であり、一般にタンパク質をコードしないが、細菌染色体^1,2,3で独立して転写することができる。ほとんどのsRNAは、遺伝子コード領域間の遺伝子間領域(IGR)にコードされており、塩基対形成作用を介して標的mRNAと相互作用し、転写後レベルで標的遺伝子の発現を調節しています^4,5。それらは、物質代謝、外膜タンパク質合成、クォーラムセンシング、および病原性遺伝子発現において重要な調節的役割を果たします⁵。

MicCは、大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムに存在する109ヌクレオチドの低分子RNA転写産物であり、OmpC、OmpD、OmpN、Omp35およびOmp36 6,7,8,9などの複数の外膜タンパク質発現を調節することができる。MicCは、in vitroでompC mRNAリーダーへのリボソーム結合を阻害することによってOmpCの発現を調節し、大腸菌での機能のためにHfq RNAシャペロンを必要とします⁶。ネズミチフス菌では、MicCはコード配列(コドン23〜26)内の≤12 bp RNA二重鎖を介してompD mRNAをサイレンシングし、エンドヌクレアーゼmRNA⁷を不安定にします。この調節プロセスは、シャペロンタンパク質Hfq¹⁰によって支援される。OmpCは豊富な外膜タンパク質であり、腸管など栄養・毒素濃度が高い環境では重要であると考えられていました⁶。OmpDポリンは、ネズミチフス菌の中で最も豊富な外膜タンパク質であり、全細胞タンパク質の約1%を占めています¹¹。OmpDは、ヒトマクロファージおよび腸上皮細胞への接着に関与する¹²。MicCはまた、OmpCおよびOmpDポリンの両方の発現を抑制する。MicCは病原性を調節すると考えられています。MicCによって制御される新しい標的遺伝子を探索し、micCの病原性制御機能を研究するために、サルモネラ・エンテリティディス(SE)株50336のmicC遺伝子をクローニングし、変異体50336ΔmicCと相補変異体50336ΔmicC/pmicCを構築しました。新規標的遺伝子をqRT-PCRによりスクリーニングした。50336ΔmicCの病原性は、マウスおよびニワトリ感染によって検出された。

プロトコル

すべての実験は、国立研究評議会の実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施されました。揚州大学の動物管理および使用委員会は、動物に適用されるすべての実験と手順を承認しました(SYXK2016-0020)。

1. 細菌株、プラスミド、培養条件

1. 表1に記載の細菌およびプラスミドを使用する。
2. LBブロスまたはLB寒天プレート上で、必要に応じて50 μg/mLのアンピシリン(Amp)の存在下で37°Cで細菌を培養します。
3. 温度感受性プラスミドを含む培養株は、30°Cでの欠失変異体構築に使用されます。

2. Sの クローンmicC 遺伝子 。 腸炎株50336

1. Sの micC 遺伝子の上流および下流配列に基づく 。 チフィムリウムSL1344株は、SE50336ゲノムDNAを鋳型として用いたPCRにより micC 遺伝子を含む断片を増幅するプライマーvmicC-FおよびvmicC-Rを設計する。
2. PCR用に、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、それぞれ1 μLのvmicC-FおよびvmicC-Rプライマー、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH₂Oを一緒に混合します。
3. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、53°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
4. PCR産物を配列決定し、 micC 遺伝子配列を取得する。

3. micC 欠失変異体の構築

注:サルモネラ・エンテリティディス50336株のmicC陰性変異体は、前述のようにλ-Red媒介組換えを用いて構築されました^13,14。使用したプライマーを表2に記載する。

1. micC遺伝子の相同性断片を含むクロラムフェニコールカセットを増幅する。
   1. micC遺伝子の5'および3'からの50 bp相同性拡張を含む、プラスミドpKD3からのクロラムフェニコール(Cm)カセットを増幅するためのmicC-FおよびmicC-Rプライマーを設計します。
   2. pKD3プラスミドをPCRテンプレートとして抽出します。
   3. 5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLのmicC-FおよびmicC-Rプライマー、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH₂OをPCR反応混合物として混合します。
   4. 以下のPCR反応条件でCmカセットを増幅します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで1分間、52°Cで1分間、72°Cで1分間、10サイクル。94°Cで1分間、63°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
   5. PCR産物のサイズをアガロースゲル電気泳動で検出します。DNAゲル回収キットでPCR産物を精製および回収し、分光光度計でDNAの濃度を測定します。
      注意:PCRは2回実行する必要があります。最初のPCR産物を1:200の比率で希釈し、二次PCRの鋳型として使用し、pKD3プラスミドによるさらなる組換えの干渉を排除した。
2. 第1^組換え株50336ΔmicC::cat を構築
   1. 100 μLのSE50336コンピテントセルと5 μLのpKD46プラスミドを均一に混合し、氷上で30分間インキュベートします。上記の混合物を42°Cで90秒間ヒートショックし、混合物を氷に2分間急速に移し、pKD46プラスミドをSE50336に形質転換した。Amp(50 μg/mL)耐性プレート上で30°Cで一晩培養することにより、陽性コロニーをスクリーニングします。
   2. SE50336/pKD46液体培養液に30 mM L-アラビノースを添加し、30°Cの振とう培養で1時間リコンビナーゼの発現を誘導します。それからコンピテントセルを準備します。
   3. 100 ng の精製 PCR 産物 (ステップ 3.1) と 40 μL の SE50336/pKD46 コンピテントセルを電気ショックカップ(バイオ・ラッドなど)に混合します。電圧1.8 kV、パルス25 μF、抵抗200 Ωのパラメータで感電変換を実行します。
   4. 電気変換後、混合物を1 mLのSOC培地に移し、150 rpmおよび30°Cで1時間振とう培養します。次に、混合物をCm(34 μg/mL)耐性LBプレートに塗抹し、37°Cで一晩培養して、陽性コロニーをスクリーニングします。
   5. 上記の陽性コロニーを42°Cで2時間培養する。Amp(50 μg/mL)に感受性があるがCm(34 μg/mL)に耐性のあるコロニーを37°Cで一晩スクリーニングし、pKD46を含まない第1組換え株を取得します。
3. 第1組換え株50336ΔmicC::Catを同定する。
   1. 50336ΔmicC::CatゲノムDNAをPCRテンプレートとして抽出します。ステップ 2.1 と同じ PCR 反応成分を使用します。ステップ2.1と同様の条件でPCR反応を行う。
   2. アガロースゲル電気泳動によってPCR産物のサイズを検出し、PCR産物を配列決定します。
4. 欠失変異体50336ΔmicCを構築します。
   1. プラスミドpCP20の100 ngを、電圧1.8 kV、パルス25 μF、抵抗200 Ωのパラメータを持つ40 μLの50336ΔmicC::Catコンピテントセルにエレクトロポレーションし、30°CでAmp(50 μg/mL)およびCm(34 μg/mL)耐性プレート上で陽性形質転換体をスクリーニングします。
   2. 上記の陽性形質転換体を非耐性LBに移し、42°Cで一晩培養した後、37°CのLBプレート上で単一コロニーを単離します。 AmpとCmの両方に敏感なコロニーを選択します。この変異体は、 micC 欠失変異体SE50336ΔmicCである。
   3. PCRにより50336ΔmicCを確認します。
      1. 50336ΔmicC ゲノムDNAをPCRテンプレートとして抽出します。PCR用に、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLのプライマーvmicC-F、1 μLのプライマーvmicC-R、5 μLのテンプレート、1 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および35 μLのddH₂OをPCR用に一緒に混合します。
      2. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、53°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。

4. micC 補完株の構築

1. プライマーpBR-micC-FおよびpBR-micC-RをNheIおよびSalI制限部位で設計します。
   1. 5 μLのSE50336ゲノムDNAを鋳型として含むPCR反応混合物、プライマーとして1 μLのpBR-micC-Fおよび1 μLのpBR-micC-R、5 μLの10x PCR反応バッファー、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、2 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、および35 μLのddH₂Oを含むPCR反応混合物を使用して、フランク配列で完全長micC遺伝子を増幅します。
   2. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、52°Cで50秒、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。PCR産物を精製して回収します。
2. PCR産物およびプラスミドpBR322を制限酵素 NheI および SalIを用いてそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16°Cで一晩ライゲーションし、プラスミドpBR322-micCを得た。
3. pBR322-micCをSE50336ΔmicCコンピテントセルに形質転換し、陽性形質転換体をスクリーニングして相補株SE50336ΔmicC/pmicCを取得します。相補株からプラスミドpBR322-micCを抽出し、制限酵素消化およびシーケンシングによって検証します。

5. RNA単離と定量リアルタイムPCR

1. LB培地中のSE50336、50336ΔmicC、および50336ΔmicC/pmicC をLB培地で一晩24°Cで180 rpm振とう培養し、OD₆₀₀ を2.0にしました。13000rpmで2分間遠心分離して細菌培養物を収集します。
2. TRIzol試薬を用いて全RNAを抽出します。単離した RNA 50 μLを DNaseI 2 μL、および 10x バッファー 6 μL と共に 37 °C で 30 分間インキュベートし、DNA を除去します。1 μLのRNAサンプルをマイクロ分光光度計にピペッティングしてRNA量を測定します。
3. cDNAの合成
   1. 20 μLの逆転写反応系(4 μLの5xバッファー、1 μLのRT酵素ミックス、1 μLのRTプライマーミックス、1 μLのトータルRNA、および4 μLのddH₂O)でcDNA合成に1 μgのトータルRNAを使用します。上記の反応系を37°Cで15分間インキュベートした後、85°Cで5秒間インキュベートします。
4. 標的遺伝子ompA、ompCおよびompDの配列に基づいてプライマーを設計する。RT試薬キットを用いて逆転写PCRを行います。PCR反応成分には、2.5 μLの10x PCR反応バッファー、1 μLのdNTP混合物(2.5 mM)、1 μLの標的遺伝子(ompA、ompCまたはompD)プライマー、2.5 μLのテンプレート、0.5 μLのTaq DNAポリメラーゼ、および17.5 μLのddH₂Oが含まれています。
   1. 以下のPCR反応条件を使用します:94°Cで4分間の予備変性;94°Cで30秒、60°Cで1分間、72°Cで1分間25サイクル、72°Cで10分間伸長します。
5. トリプリケートのRT-PCT装置でSYBRグリーンRT-PCRキットを使用してリアルタイムPCRを実行します。
   1. 次のPCR反応成分を使用してください:10 μLの2x SYBRバッファー、0.4 μLのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、0.4 μLのRoxDye II、2 μLのcDNA、および6.8 μLのRNaseフリーH₂O。
   2. 次のPCR反応条件を使用します:95°Cで1分間、1サイクルで予備変性します。95°Cで5秒間、60°Cで34秒間、40サイクル。
   3. すべてのデータを内因性参照遺伝子gyrAに正規化します。データの定量化には^2-ΔΔCT法を使用する¹⁵.

6. 病原性アッセイ

1. LB培地から初期固定相(OD₆₀₀の2-3)中のSE50336、50336ΔmicCおよび50336ΔmicC/pmicCを24°Cで培養し、遠心分離により回収し、滅菌PBSで適切なCFU ^mL-1に希釈します。
2. マウス感染症の場合は、培養株を10 CFU/200 μL、10² CFU/200 μL、および^{10 3} CFU/200 μLグラジエント再懸濁液に希釈します。皮下注射により、株ごとに5匹の6〜8週齢のBalb / cマウスのグループに感染させます。対照群に200μLの生理食塩水を注射する。
3. ニワトリ感染症の場合は、3株以上に希釈して10⁷ CFU/200 μL、10⁸ CFU/200 μL、10⁹ CFU/200 μLのグラジエント再懸濁液にします。皮下注射によって株あたり20羽の1日齢のニワトリのグループに感染する。
4. 実験動物の病気や死亡の兆候を毎日監視します。前述のように感染後の_LD50 (致死量中央値)14dを計算する¹⁶。データ分析ソフトウェアを使用してデータを処理します。
5. 感染グループでは、死んだばかりのひよこの心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を収集します。上記の組織0.5 gを別々に秤量し、滅菌操作でそれらを粉砕します。粉砕サンプルを徐々に希釈し、LBプレート上に広げ、37°Cで8〜10時間培養します。ひよこ組織にコロニーを形成した サルモネラ 菌株の量を記録します。

結果

変異株50336ΔmicCおよび相補株50336Δ micC /pmicCの構築
micC遺伝子クローンの結果は、この遺伝子がSの遺伝子と100%同一性を示す109 bpで構成されていることを示しました。 チフィムリウム。配列データに基づいて、欠失変異体50336ΔmicCおよび相補変異体50336ΔmicC/p<...

ディスカッション

S. 腸炎は、若いニワトリに感染する可能性があり、腸炎から全身感染および死亡までの症状を引き起こす重要な通性細胞内病原体です^17,18。さらに、S. enteritidisは成鶏に潜伏感染を引き起こし、慢性保菌者は家禽製品を汚染し、ヒトに食品媒介感染症を引き起こします¹⁹。S. Enteritidisの病原性メカニズムは、まだ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
dextrose	Sangon Biotech	A610219	for broth preparation
DNA purification kit	TIANGEN	DP214	for DNA purification
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	for broth preparation
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	for broth preparation
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP106	plasmid extraction
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	for broth preparation
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	Ligation
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	for broth preparation
Yeast extract	Oxoid	LP0021	for broth preparation
centrifuge	Eppendorf	5418	centrifugation
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad	164-5050	Electrophoresis
Electroporation System	Bio-Rad	165-2100	for bacterial transformation
Spectrophotometer	BioTek	Epoch	Absorbance detection
Real-Time PCR system	Applied Biosystems	7500 system	qRT-PCR