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Resumo

Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.

Resumo

Um pequeno RNA não codificante (sRNA) é um novo fator para regular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Uma espécie de sRNA MicC, conhecido em Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, poderia reprimir a expressão de proteínas da membrana externa. Para investigar melhor a função de regulação do micC em Salmonella Enteritidis, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis e, em seguida, construímos o mutante 50336Δ micC pelo sistema de recombinação baseado em λ Red e o mutante complementado 50336Δ micC/p micC carregando plasmídeo recombinante pBR322 expressando micC. Os resultados da qRT-PCR demonstraram que a transcrição de ompD em 50336Δ micC foi 1,3 vezes maior do que na cepa selvagem, enquanto a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC foi 2,2 vezes maior e 3 vezes maior do que na cepa selvagem. Estes indicaram que micC reprime a expressão de ompA e ompC. No estudo seguinte, a patogenicidade de 50336ΔmicC foi detectada por camundongos Balb/c de 6 semanas de idade e galinhas de 1 dia de idade. O resultado mostrou que a DL 50 da linhagem selvagem 50336, os mutantes 50336Δ micC e 50336Δ micC/p micC para camundongos Balb/c com 6 semanas de idade foram 12,59 UFC, 5,01 UFC e 19,95 UFC, respectivamente. As DL 50 das cepas para frangos de 1 dia de idade foram 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC e2,54 x 10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas regulando a expressão de proteínas da membrana externa.

Introdução

Os pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) têm 40-400 nucleotídeos de comprimento, que geralmente não codificam proteínas, mas podem ser transcritos independentemente em cromossomos bacterianos 1,2,3. A maioria dos sRNAs é codificada nas regiões intergênicas (IGRs) entre regiões codificadoras de genes e interage com mRNAs alvo por meio de ações de pareamento de bases e regula a expressão de genes-alvo em nível pós-transcricional 4,5. Desempenham importantes papéis de regulação no metabolismo de substâncias, síntese de proteínas de membrana externa, quorum sensing e expressão gênica de virulência5.

MicC é um transcrito de RNA pequeno de 109 nucleotídeos presente em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium, que poderia regular a expressão de múltiplas proteínas de membrana externa, como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. O MicC regula a expressão de OmpC inibindo a ligação do ribossomo ao líder de mRNA ompC in vitro e requer a chaperona de RNA Hfq para sua função em Escherichia coli6. Em Salmonella Typhimurium, MicC silencia o mRNA ompD através de um duplex de RNA de ≤12 pb dentro da sequência codificadora (códons 23-26) e, em seguida, desestabiliza o mRNA endonucleolítico7. Este processo de regulação é assistido pela proteína chaperona Hfq10. A OmpC é uma proteína abundante da membrana externa que foi considerada importante em ambientes onde as concentrações de nutrientes e toxinas eram elevadas, como no intestino6. A porina OmpD é a proteína de membrana externa mais abundante em Salmonella Typhimurium e representa cerca de 1% da proteína celular total11. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. MicC também reprime a expressão de porinas OmpC e OmpD. Acredita-se que MicC pode regular a virulência. Para explorar novos genes-alvo regulados por MicC e estudar a função de regulação de virulência do micC, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE) e, em seguida, construímos o mutante 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC. Novos genes-alvo foram rastreados por qRT-PCR. A virulência de 50336ΔmicC foi detectada por infecções em camundongos e galinhas.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Conselho Nacional de Pesquisa. O comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de Yangzhou aprovou todos os experimentos e procedimentos aplicados nos animais (SYXK2016-0020).

1. Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de cultura

  1. Utilizar as bactérias e plasmídeos listados na Tabela 1.
  2. Cultivar bactérias em caldo LB ou em placas de ágar LB a 37 °C, na presença de 50 μg/mL de ampicilina (Amp), quando apropriado.
  3. Cepas de cultura contendo plasmídeos sensíveis à temperatura são usadas para a construção de mutantes de deleção a 30 °C.

2. Clone gene micC de S. Enteritidis cepa 50336

  1. Baseado na sequência a montante e a jusante do gene micC de S. Typhimurium cepa SL1344, projetam primers vmicC-F e vmicC-R para amplificar um fragmento contendo o gene micC por PCR usando SE50336 genomic DNA como modelo.
  2. Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers vmicC-F e vmicC-R, respectivamente, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
  3. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
  4. Sequenciar o produto da PCR para obter a sequência do gene micC .

3. Construção do mutante de deleção micC

NOTA: O mutante micC negativo da cepa 50336 de Salmonella Enteritidis foi construído usando recombinação mediada por λ-vermelho, conforme descrito anteriormente13,14. Os primers utilizados estão listados na Tabela 2.

  1. Amplificar de cloranfenicol contendo fragmentos de homologia do gene micC .
    1. Projetar primers micC-F e micC-R para amplificar o de cloranfenicol (Cm) do plasmídeo pKD3, incluindo extensões de homologia de 50 pb do gene 5' e 3' do gene micC .
    2. Extraia o plasmídeo pKD3 como o modelo de PCR.
    3. Mistura de 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers micC-F e micC-R, respectivamente, 5 μL de molde, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos como mistura de reação de PCR
    4. Amplificar o de Cm com as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 1 min, 52 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 10 ciclos; 94 °C por 1 min, 63 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min.
    5. Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose. Purificar e recuperar o produto da PCR com kit de recuperação de gel de DNA, e determinar a concentração de DNA por espectrofotômetro.
      CUIDADO: A PCR deve ser realizada duas vezes. O primeiro produto da PCR foi diluído na proporção de 1:200 e usado como molde para a PCR secundária, para eliminar a interferência de recombinação adicional pelo plasmídeo pKD3.
  2. Construa1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::cat
    1. Misturar 100 μL de células competentes SE50336 com 5 μL de plasmídeo pKD46 uniformemente e incubar no gelo por 30 min. Choque térmico da mistura acima a 42 °C por 90 s e transfira rapidamente a mistura para gelo por 2 min para transformar o plasmídeo pKD46 em SE50336. Selecionar colônias positivas cultivando durante a noite a 30 °C em uma placa resistente a Amp (50 μg/mL).
    2. Adicionar 30 mM de L-arabinose à cultura líquida SE50336/pKD46 e induzir a expressão da recombinase através de uma cultura de agitação a 30 °C durante 1 h. Em seguida, prepare células competentes.
    3. Misturar 100 ng de produto de PCR purificado (passo 3.1) e 40 μL de células competentes SE50336/pKD46 num copo de choque eléctrico (por exemplo, Bio-Rad). Realizar transformação de choque elétrico com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω.
    4. Após a eletrotransformação, transferir a mistura para 1 mL de meio SOC e uma cultura de agitação a 150 rpm e 30 °C por 1 h. Em seguida, esfregar a mistura em uma placa LB resistente a Cm (34 μg/mL) e cultivar a 37 °C durante a noite para rastrear colônia positiva.
    5. Cultivar a colônia positiva acima a 42 °C por 2 h. Selecionar a colônia sensível a Amp (50 μg/mL), mas resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante a noite para obter a 1ª cepa recombinante sem pKD46.
  3. Identificar a 1ª cepa recombinante 50336ΔmicC::Cat.
    1. Extrato 50336ΔmicC::DNA genômico do gato como o modelo de PCR. Use os mesmos componentes de reação de PCR da etapa 2.1. Realizar a reação de PCR com as mesmas condições da etapa 2.1.
    2. Detectar o tamanho do produto da PCR por eletroforese em gel de agarose e sequenciar o produto da PCR.
  4. Construa o mutante de deleção 50336ΔmicC.
    1. Eletroporato 100 ng de pCP20 plasmidial em 40 μL de 50336ΔmicC::Células competentes do gato com os parâmetros de tensão 1,8 kV, pulso 25 μF e resistência 200 Ω, transformadores positivos de tela em placa resistente a Amp (50 μg/mL) e Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
    2. Transferir acima dos transformadores positivos para LB não resistentes e cultivá-los durante a noite a 42 °C e, em seguida, isolar colônias únicas em uma placa LB a 37 °C. Selecione a colônia que é sensível a Amp e Cm. Este mutante é o mutante de deleção micC SE50336ΔmicC.
    3. Verificar 50336ΔmicC por PCR.
      1. Extrato 50336ΔmicC genomic DNA como modelo de PCR. Misturar 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primer vmicC-F, 1 μL de primer vmicC-R, 5 μL de template, 1 μL de Taq DNA polimerase e 35 μL de ddH2O juntos para PCR.
      2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.

4. Construção da cepa micC complementada

  1. Projetam primers pBR-micC-F e pBR-micC-R com sítios de restrição NheI e SalI.
    1. Amplificar o gene micC completo com sequências de flanco usando mistura de reação de PCR que contém 5 μL de DNA genômico SE50336 como modelo, primers 1 μL de pBR-micC-F e 1 μL de pBR-micC-R como primers, 5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 2 μL de mistura de dNTP (2,5 mM) e 35 μL de ddH2O.
    2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 52 °C por 50 s, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10 min. Purificar e recuperar produto PCR.
  2. Digerir o produto da PCR e o plasmídeo pBR322, respectivamente, usando a enzima de restrição NheI e SalI, e ligá-los usando T4 ligase a 16 °C durante a noite para obter o plasmídeo pBR322-micC.
  3. Transformar pBR322-micC em células competentes SE50336ΔmicC e selecionar transformador positivo para obter a cepa complementada SE50336ΔmicC/pmicC. Extrair o plasmídeo pBR322-micC da cepa complementada e verificá-lo por digestão e sequenciamento da enzima de restrição.

5. Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real

  1. Cultura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em meio LB durante a noite a 24 °C com cultivo de 180 rpm a um OD600 de 2,0. Coletar cultura bacteriana por centrifugação a 13000 rpm por 2 min.
  2. Extrair RNA total usando o reagente TRIzol. Incubar 50 μL de RNA isolado com 2 μL de DNaseI e 6 μL de tampão 10x a 37 °C por 30 min para remover o DNA. Determinar a quantidade de RNA pipetando 1 μL de amostra de RNA para um microespectrofotômetro.
  3. Síntese de cDNA
    1. Use 1 μg de RNA total para síntese de cDNA em 20 μL do sistema de reação de transcrição reversa (4 μL de tampão 5x, 1 μL de mistura de enzimas RT, 1 μL de mistura de primers RT, 10 μL de RNA total e 4 μL de ddH2O). Incubar acima do sistema de reacção a 37 °C durante 15 min e depois a 85 °C durante 5 s.
  4. Projetar primers baseados na sequência dos genes-alvo ompA, ompC e ompD. Realizar transcrição reversa-PCR usando um kit de reagentes RT. Os componentes da reação de PCR contêm 2,5 μL de tampão de reação de PCR 10x, 1 μL de mistura de dNTP (2,5 mM), 1 μL de primers do gene alvo (ompA, ompC ou ompD), 2,5 μL de template, 0,5 μL de Taq DNA polimerase e 17,5 μL de ddH2O.
    1. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 94 °C por 4 min; 94 °C por 30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 1 min por 25 ciclos e extensão a 72 °C por 10min.
  5. Realizar PCR em tempo real utilizando kit RT-PCR verde SYBR em instrumento RT-PCT em triplicatas.
    1. Utilizar os seguintes componentes da reação de PCR: 10 μL de tampão SYBR 2x, 0,4 μL de primer forward e primer reverso respectivamente, 0,4 μL de RoxDye II, 2 μL de cDNA e 6,8 μL de RNase free H2O.
    2. Use as seguintes condições de reação de PCR: pré-desnaturação a 95 °C por 1 min por um ciclo; 95 °C por 5 s, 60 °C por 34 s por 40 ciclos.
    3. Normalizar todos os dados para o giro gênico de referência endógeno. Utilizar o método 2-Δ ΔCT para quantificação dos dados15.

6. Ensaios de virulência

  1. Culturas SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC em LB de meio a início de fase estacionária (OD600 de 2-3) a 24 °C, colher por centrifugação e diluir para CFU mL-1 apropriado em PBS estéril.
  2. Para infecções em camundongos, diluir as cepas cultivadas para 10 UFC/200 μL, 102 UFC/200 μL e 103 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de cinco camundongos Balb/c de 6-8 semanas de idade por cepa por injeção subcutânea. Injetar no grupo controle 200 μL de solução salina fisiológica.
  3. Para infecções em frangos, diluir acima de três cepas para 107 UFC/200 μL, 108 UFC/200 μL e 109 UFC/200 μL gradientes ressuspensions. Infectar grupos de vinte galinhas de 1 dia de idade por cepa por injeção subcutânea.
  4. Monitorar sinais de doenças e mortes de animais experimentais diariamente. Calcular a DL50 (dose letal mediana) 14 d pós-infecção, conforme descrito anteriormente16. Processar os dados usando um software de análise de dados.
  5. Em grupos de infecção, colete o coração, fígado, baço, pulmão e rim de pintinhos recém-mortos. Pesar 0,5 g dos tecidos acima separadamente e triturá-los com operação estéril. Diluir as amostras de moagem gradualmente, espalhar-as em placa LB e cultivar por 8-10 h a 37 °C. Registrar a quantidade de cepas de Salmonella colonizadas em tecidos de pintinhos.

Resultados

Construção do mutante 50336Δ micC e linhagem complementada 50336Δ micC /p micC
O resultado do clone do gene micC indicou que este gene era composto por 109 pb mostrando 100% de identidade com o de S. Typhimurium. Com base nos dados de sequência, o mutante de deleção 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/pmicC for...

Discussão

S. A enteritidis é um importante patógeno intracelular facultativo que pode infectar galinhas jovens e produzir sintomas desde enterite até infecção sistêmica e morte17,18. Além disso, S. Enteritidis causa infecções latentes em frangos adultos e portadores crônicos contaminam produtos avícolas, resultando em infecções transmitidas por alimentos em humanos19. O mecanismo patogênico de S. Enteritidis ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da China (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Um Projeto Financiado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
dextroseSangon BiotechA610219for broth preparation
DNA purification kitTIANGENDP214for DNA purification
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608for broth preparation
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116for broth preparation
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
Mini Plasmid KitTIANGENDP106plasmid extraction
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308for broth preparation
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol Invitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042for broth preparation
Yeast extractOxoidLP0021for broth preparation
centrifugeEppendorf5418centrifugation
Electrophoresis apparatusBio-Rad164-5050Electrophoresis
 Electroporation SystemBio-Rad165-2100for bacterial transformation
SpectrophotometerBioTekEpochAbsorbance detection
Real-Time PCR systemApplied Biosystems7500 systemqRT-PCR

Referências

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