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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un sistema di ricombinazione λ-rosso-mediato è stato utilizzato per creare un mutante di delezione di un piccolo microfono di RNA non codificante.

Abstract

Un piccolo RNA non codificante (sRNA) è un nuovo fattore per regolare l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Una sorta di sRNA MicC, noto in Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, potrebbe reprimere l'espressione delle proteine della membrana esterna. Per studiare ulteriormente la funzione di regolazione della micC in Salmonella Enteritidis, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis, e poi abbiamo costruito il mutante 50336Δ micC con il sistema di ricombinazione λ Red based e il mutante 50336Δ micC/p micC completato che trasporta il plasmide ricombinante pBR322 che esprime micC. I risultati della qRT-PCR hanno dimostrato che la trascrizione di ompD nel micC 50336Δ era 1,3 volte superiore a quella del ceppo wild type, mentre la trascrizione di ompA e ompC nel micC 50336Δ era 2,2 volte superiore e 3 volte superiore a quella del ceppo wild type. Questi indicano che micC reprime l'espressione di ompA e ompC. Nel seguente studio, la patogenicità di 50336ΔmicC è stata rilevata sia infettando topi Balb / c di 6 settimane che polli di 1 giorno. Il risultato ha mostrato che la LD50 del ceppo wild type 50336, i mutanti 50336Δ micC e 50336Δ micC/pmicC per topi Balb/c di 6 settimane erano rispettivamente 12,59 CFU, 5,01 CFU e 19,95 CFU. I ceppi LD 50 per polli di 1 giorno erano rispettivamente 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU e2,54 x 10 8 CFU. Ha indicato che la delezione del micC ha aumentato la virulenza di S. Enteritidis nei topi e nei polli regolando l'espressione delle proteine della membrana esterna.

Introduzione

I piccoli RNA non codificanti (sRNA) sono lunghi 40-400 nucleotidi, che generalmente non codificano proteine ma potrebbero essere trascritti indipendentemente nei cromosomi batterici 1,2,3. La maggior parte degli sRNA sono codificati nelle regioni intergeniche (IGR) tra regioni codificanti geni e interagiscono con gli mRNA bersaglio attraverso azioni di accoppiamento di basi e regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello post-trascrizionale 4,5. Svolgono importanti ruoli di regolazione nel metabolismo delle sostanze, nella sintesi proteica della membrana esterna, nel quorum sensing e nell'espressione genica di virulenza5.

MicC è un trascritto di 109 nucleotidi di piccolo RNA presente in Escherichia coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che potrebbe regolare l'espressione di più proteine della membrana esterna come OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. MicC regola l'espressione di OmpC inibendo il legame del ribosoma al leader dell'mRNA ompC in vitro e richiede lo chaperone dell'Hfq RNA per la sua funzione in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium, MicC silenzia l'mRNA ompD attraverso un duplex di RNA ≤12-bp all'interno della sequenza codificante (codoni 23-26) e quindi destabilizza l'mRNA endonucleolitico7. Questo processo di regolazione è assistito dalla proteina chaperone Hfq10. L'OmpC è un'abbondante proteina della membrana esterna che si pensava fosse importante in ambienti in cui le concentrazioni di nutrienti e tossine erano elevate, come nell'intestino6. La porina OmpD è la proteina della membrana esterna più abbondante in Salmonella Typhimurium e rappresenta circa l'1% della proteina cellulare totale11. OmpD è coinvolto nell'aderenza ai macrofagi umani e alle cellule epiteliali intestinali12. MicC reprime anche l'espressione delle porine OmpC e OmpD. Si pensa che MicC possa regolare la virulenza. Per esplorare nuovi geni bersaglio regolati da MicC e studiare la funzione di regolazione della virulenza di micC, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis (SE), quindi abbiamo costruito il mutante 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336ΔmicC/p micC. Nuovi geni bersaglio sono stati sottoposti a screening mediante qRT-PCR. La virulenza di 50336ΔmicC è stata rilevata da infezioni da topi e polli.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Il comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou ha approvato tutti gli esperimenti e le procedure applicate sugli animali (SYXK2016-0020).

1. Ceppi batterici, plasmidi e condizioni di coltura

  1. Utilizzare i batteri e i plasmidi elencati nella Tabella 1.
  2. Batteri di coltura in brodo LB o su piastre di agar LB a 37 °C, in presenza di 50 μg/mL di ampicillina (Amp) quando appropriato.
  3. I ceppi di coltura contenenti plasmidi sensibili alla temperatura sono utilizzati per la costruzione mutante di delezione a 30 °C.

2. Clone micC gene di S. Enteritidis ceppo 50336

  1. Basato sulla sequenza a monte e a valle del gene micC di S. Typhimurium ceppo SL1344, progetta primer vmicC-F e vmicC-R per amplificare un frammento contenente il gene micC mediante PCR utilizzando il DNA genomico SE50336 come modello.
  2. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer vmicC-F e vmicC-R, rispettivamente, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH2O insieme per PCR.
  3. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 53 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
  4. Sequenziare il prodotto PCR per ottenere la sequenza del gene micC .

3. Costruzione del mutante di delezione micC

NOTA: Il mutante micC-negativo del ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis è stato costruito utilizzando la ricombinazione λ-rosso-mediata come descritto in precedenza13,14. I primer utilizzati sono elencati nella tabella 2.

  1. Amplificare la cassetta di cloramfenicolo contenente frammenti di omologia del gene micC .
    1. Progettare primer micC-F e micC-R per amplificare la cassetta del cloramfenicolo (Cm) dal plasmide pKD3, comprese le estensioni di omologia di 50 bp dai 5' e 3' del gene micC .
    2. Estrarre il plasmide pKD3 come modello PCR.
    3. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer micC-F e micC-R, rispettivamente, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH2O insieme come miscela di reazione PCR
    4. Amplificare la cassetta Cm con le seguenti condizioni di reazione PCR: pre-denaturazione a 94 °C per 4 min; 94 °C per 1 min, 52 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 10 cicli; 94 °C per 1 min, 63 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
    5. Rilevare le dimensioni del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Purificare e recuperare il prodotto PCR con il kit di recupero del gel del DNA e determinare la concentrazione di DNA mediante spettrofotometro.
      ATTENZIONE: La PCR deve essere eseguita due volte. Il primo prodotto PCR è stato diluito con un rapporto di 1:200 e utilizzato come modello per la PCR secondaria, per eliminare l'interferenza di un'ulteriore ricombinazione da parte del plasmide pKD3.
  2. Costruire 1° ceppo ricombinante 50336ΔmicC::cat
    1. Mescolare uniformemente 100 μL di cellule competenti SE50336 con 5 μL di plasmide pKD46 e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Shock termico della miscela di cui sopra a 42 °C per 90 s e trasferire rapidamente la miscela sul ghiaccio per 2 minuti per trasformare il plasmide pKD46 in SE50336. Schermare le colonie positive coltivando per una notte a 30 °C su una piastra resistente all'Amp (50 μg/mL).
    2. Aggiungere 30 mM di L-arabinosio alla coltura liquida SE50336/pKD46 e indurre l'espressione della ricombinasi mediante una coltura di agitazione a 30 °C per 1 ora. Quindi preparare le cellule competenti.
    3. Mescolare 100 ng di prodotto PCR purificato (fase 3.1) e 40 μL di cellule competenti SE50336/pKD46 in una coppa a scossa elettrica (ad esempio, Bio-Rad). Effettuare la trasformazione della scossa elettrica con i parametri di tensione 1,8 kV, impulso 25 μF e resistenza 200 Ω.
    4. Dopo elettrotrasformazione, trasferire la miscela a 1 mL di mezzo SOC e una coltura di agitazione a 150 rpm e 30 °C per 1 ora. Quindi spalmare la miscela su una piastra LB resistente a Cm (34 μg/mL) e coltura a 37 °C durante la notte per lo screening della colonia positiva.
    5. Coltura della suddetta colonia positiva a 42 °C per 2 ore. Schermare la colonia sensibile all'Amp (50 μg/mL) ma resistente a Cm (34 μg/mL) a 37 °C durante la notte per ottenere il 1° ceppo ricombinante senza pKD46.
  3. Identificare il 1° ceppo ricombinante 50336ΔmicC::Cat.
    1. Estrarre 50336ΔmicC::DNA genomico del gatto come modello PCR. Utilizzare gli stessi componenti di reazione PCR del punto 2.1. Eseguire la reazione PCR con le stesse condizioni del punto 2.1.
    2. Rilevare le dimensioni del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e sequenziare il prodotto PCR.
  4. Construct deletion mutant 50336ΔmicC.
    1. Elettroporate 100 ng di plasmide pCP20 in 40 μL di 50336ΔmicC::Celle competenti Cat con i parametri di tensione 1,8 kV, impulso 25 μF e resistenza 200 Ω, trasformanti positivi dello schermo su piastre resistenti sia ad Amp (50 μg/mL) che a Cm (34 μg/mL) a 30 °C.
    2. Trasferire sopra i trasformanti positivi in LB non resistenti e coltivarli per una notte a 42 °C, quindi isolare singole colonie su una piastra LB a 37 °C. Selezionare la colonia sensibile sia ad Amp che a Cm. Questo mutante è il mutante di delezione micC SE50336ΔmicC.
    3. Verificare 50336ΔmicC mediante PCR.
      1. Estrarre il DNA genomico 50336ΔmicC come modello PCR. Mescolare 5 μL di tampone di reazione 10x PCR, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer vmicC-F, 1 μL di primer vmicC-R, 5 μL di modello, 1 μL di Taq DNA polimerasi e 35 μL di ddH2O insieme per PCR.
      2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 53 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.

4. Costruzione del ceppo integrato micC

  1. Progettare primer pBR-micC-F e pBR-micC-R con siti di restrizione NheI e SalI.
    1. Amplificare il gene micC a lunghezza intera con sequenze di fianco utilizzando una miscela di reazione PCR che contiene 5 μL di DNA genomico SE50336 come modello, primer 1 μL di pBR-micC-F e 1 μL di pBR-micC-R come primer, 5 μL di tampone di reazione PCR 10x, 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 2 μL di miscela dNTP (2,5 mM) e 35 μL di ddH2O.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR: pre-denaturazione a 94 °C per 4 min; 94 °C per 30 s, 52 °C per 50 s, 72 °C per 1 min per 25 cicli e prolunga a 72 °C per 10 min. Purificare e recuperare il prodotto PCR.
  2. Digerire il prodotto PCR e il plasmide pBR322 rispettivamente utilizzando l'enzima di restrizione NheI e SalI, e ligarli usando T4 ligasi a 16 °C durante la notte per ottenere il plasmide pBR322-micC.
  3. Trasformare pBR322-micC nelle cellule competenti SE50336ΔmicC e eseguire lo screening del trasformante positivo per ottenere il ceppo integrato SE50336ΔmicC/pmicC. Estrarre il plasmide pBR322-micC dal ceppo complementare e verificarlo mediante digestione enzimatica di restrizione e sequenziamento.

5. Isolamento dell'RNA e PCR quantitativa in tempo reale

  1. Coltura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC in mezzo LB durante la notte a 24 °C con coltivazione di shake a 180 rpm a un OD600 di 2.0. Raccogliere la coltura batterica mediante centrifugazione a 13000 giri/min per 2 min.
  2. Estrarre l'RNA totale utilizzando il reagente TRIzol. Incubare 50 μL di RNA isolato con 2 μL di DNaseI e 6 μL di tampone 10x a 37 °C per 30 minuti per rimuovere il DNA. Determinare la quantità di RNA pipettando 1 μL di campione di RNA in un microspettrofotometro.
  3. Sintesi del cDNA
    1. Utilizzare 1 μg di RNA totale per la sintesi di cDNA in 20 μL di sistema di reazione di trascrizione inversa (4 μL di tampone 5x, 1 μL di miscela enzimatica RT, 1 μL di miscela primer RT, 10 μL di RNA totale e 4 μL di ddH2O). Incubare sopra il sistema di reazione a 37 °C per 15 minuti e poi a 85 °C per 5 s.
  4. Progettare primer basati sulla sequenza dei geni bersaglio ompA, ompC e ompD. Eseguire la trascrizione inversa-PCR utilizzando un kit di reagenti RT. I componenti della reazione PCR contengono 2,5 μL di tampone di reazione PCR 10x, 1 μL di miscela dNTP (2,5 mM), 1 μL di primer del gene bersaglio (ompA, ompC o ompD), 2,5 μL di template, 0,5 μL di Taq DNA polimerasi e 17,5 μL di ddH2O.
    1. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 94 °C per 4 minuti; 94 °C per 30 s, 60 °C per 1 min, 72 °C per 1 min per 25 cicli ed estensione a 72 °C per 10 min.
  5. Eseguire la PCR in tempo reale utilizzando il kit RT-PCR verde SYBR in uno strumento RT-PCT in triplice copia.
    1. Utilizzare i seguenti componenti di reazione PCR: 10 μL di 2x tampone SYBR, 0,4 μL di primer diretto e primer inverso rispettivamente, 0,4 μL di RoxDye II, 2 μL di cDNA e 6,8 μL di H2O libero da RNasi.
    2. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione PCR:pre-denaturazione a 95 °C per 1 minuto per un ciclo; 95 °C per 5 s, 60 °C per 34 s per 40 cicli.
    3. Normalizzare tutti i dati al gene di riferimento endogeno gyrA. Utilizzare il metodo 2-Δ ΔCT per la quantificazione dei dati15.

6. Saggi di virulenza

  1. Coltura SE50336, 50336ΔmicC e 50336ΔmicC/pmicC in fase stazionaria da media a precoce LB (OD600 di 2-3) a 24 °C, raccolta mediante centrifugazione e diluizione fino a CFU mL-1 appropriata in PBS sterile.
  2. Per le infezioni da topi, diluire i ceppi coltivati a 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL e 103 CFU/200 μL di gradiente risussivo. Infettare gruppi di cinque topi Balb/c di 6-8 settimane per ceppo mediante iniezione sottocutanea. Iniettare nel gruppo di controllo 200 μL di soluzione fisiologica.
  3. Per le infezioni da pollo, diluire sopra tre ceppi a 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL e 109 CFU/200 μL di risospensione del gradiente. Infettare gruppi di venti polli di 1 giorno per ceppo mediante iniezione sottocutanea.
  4. Monitorare quotidianamente i segni di malattia e la morte di animali da esperimento. Calcolare la DL50 (dose letale mediana) 14 d post-infezione come descritto in precedenza16. Elaborare i dati utilizzando un software di analisi dei dati.
  5. Nei gruppi di infezione, raccogliere il cuore, il fegato, la milza, il polmone e il rene dei pulcini appena morti. Pesare separatamente 0,5 g dei tessuti di cui sopra e macinarli con un'operazione sterile. Diluire gradualmente i campioni di macinazione, distribuirli su piastra LB e coltura per 8-10 ore a 37 °C. Registrare la quantità di ceppi di Salmonella colonizzati nei tessuti dei pulcini.

Risultati

Costruzione del mutante 50336Δ micC e del ceppo complementare 50336Δ micC /pmicC
Il risultato del clone del gene micC ha indicato che questo gene era composto da 109 bp che mostravano un'identità del 100% con quella di S. Typhimurium. Sulla base dei dati di sequenza, il mutante di delezione 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336Δ...

Discussione

S. Enteritidis è un importante patogeno intracellulare facoltativo che può infettare i giovani polli e produce sintomi da enterite a infezione sistemica e morte17,18. Inoltre, S. Enteritidis provoca infezioni latenti nei polli adulti e i portatori cronici contaminano i prodotti avicoli, causando infezioni di origine alimentare nell'uomo19. Il meccanismo patogenetico di S. Enteritidis rimane da sondare ulteriormente....

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Chinese National Science Foundation (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), un progetto finanziato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
dextroseSangon BiotechA610219for broth preparation
DNA purification kitTIANGENDP214for DNA purification
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608for broth preparation
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116for broth preparation
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
Mini Plasmid KitTIANGENDP106plasmid extraction
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308for broth preparation
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol Invitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042for broth preparation
Yeast extractOxoidLP0021for broth preparation
centrifugeEppendorf5418centrifugation
Electrophoresis apparatusBio-Rad164-5050Electrophoresis
 Electroporation SystemBio-Rad165-2100for bacterial transformation
SpectrophotometerBioTekEpochAbsorbance detection
Real-Time PCR systemApplied Biosystems7500 systemqRT-PCR

Riferimenti

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