Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

Riepilogo

Un sistema di ricombinazione λ-rosso-mediato è stato utilizzato per creare un mutante di delezione di un piccolo microfono di RNA non codificante.

Abstract

Un piccolo RNA non codificante (sRNA) è un nuovo fattore per regolare l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Una sorta di sRNA MicC, noto in Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, potrebbe reprimere l'espressione delle proteine della membrana esterna. Per studiare ulteriormente la funzione di regolazione della micC in Salmonella Enteritidis, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis, e poi abbiamo costruito il mutante 50336Δ micC con il sistema di ricombinazione λ Red based e il mutante 50336Δ micC/p micC completato che trasporta il plasmide ricombinante pBR322 che esprime micC. I risultati della qRT-PCR hanno dimostrato che la trascrizione di ompD nel micC 50336Δ era 1,3 volte superiore a quella del ceppo wild type, mentre la trascrizione di ompA e ompC nel micC 50336Δ era 2,2 volte superiore e 3 volte superiore a quella del ceppo wild type. Questi indicano che micC reprime l'espressione di ompA e ompC. Nel seguente studio, la patogenicità di 50336ΔmicC è stata rilevata sia infettando topi Balb / c di 6 settimane che polli di 1 giorno. Il risultato ha mostrato che la LD₅₀ del ceppo wild type 50336, i mutanti 50336Δ micC e 50336Δ micC/pmicC per topi Balb/c di 6 settimane erano rispettivamente 12,59 CFU, 5,01 CFU e 19,95 CFU. I ceppi LD 50 per polli di 1 giorno erano rispettivamente 1,13 x 10⁹ CFU, 1,55 x 10 8 CFU e_{2,54 x 10} ⁸ CFU. Ha indicato che la delezione del micC ha aumentato la virulenza di S. Enteritidis nei topi e nei polli regolando l'espressione delle proteine della membrana esterna.

Introduzione

I piccoli RNA non codificanti (sRNA) sono lunghi 40-400 nucleotidi, che generalmente non codificano proteine ma potrebbero essere trascritti indipendentemente nei cromosomi batterici ^1,2,3. La maggior parte degli sRNA sono codificati nelle regioni intergeniche (IGR) tra regioni codificanti geni e interagiscono con gli mRNA bersaglio attraverso azioni di accoppiamento di basi e regolano l'espressione dei geni bersaglio a livello post-trascrizionale ^4,5. Svolgono importanti ruoli di regolazione nel metabolismo delle sos....

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Il comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou ha approvato tutti gli esperimenti e le procedure applicate sugli animali (SYXK2016-0020).

1. Ceppi batterici, plasmidi e condizioni di coltura

1. Utilizzare i batteri e i plasmidi elencati nella Tabella 1.
2. Batteri di coltura in brodo LB o su piastre di agar LB a 37 °C, in presenza di 50 μg/mL di ampicillina (Amp) quando appropriato.
3. I ceppi di coltura contenenti plasmi....

Risultati

Costruzione del mutante 50336Δ micC e del ceppo complementare 50336Δ micC /pmicC
Il risultato del clone del gene micC ha indicato che questo gene era composto da 109 bp che mostravano un'identità del 100% con quella di S. Typhimurium. Sulla base dei dati di sequenza, il mutante di delezione 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336Δ.......

Discussione

S. Enteritidis è un importante patogeno intracellulare facoltativo che può infettare i giovani polli e produce sintomi da enterite a infezione sistemica e morte^17,18. Inoltre, S. Enteritidis provoca infezioni latenti nei polli adulti e i portatori cronici contaminano i prodotti avicoli, causando infezioni di origine alimentare nell'uomo¹⁹. Il meccanismo patogenetico di S. Enteritidis rimane da sondare ulteriormente........

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
dextrose	Sangon Biotech	A610219	for broth preparation
DNA purification kit	TIANGEN	DP214	for DNA purification
Ex Taq	TaKaRa	RR01A	PCR
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608	for broth preparation
K2HPO4	Sinopharm Chemical Reagent	20032116	for broth preparation
L-Arabinose	Sangon Biotech	A610071	λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit	TIANGEN	DP106	plasmid extraction
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308	for broth preparation
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10002917	for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser	TaKaRa	RR047	qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II	TaKaRa	RR820	qRT-PCR
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	Ligation
TRIzol	Invitrogen	15596018	RNA isolation
Tryptone	Oxoid	LP0042	for broth preparation
Yeast extract	Oxoid	LP0021	for broth preparation
centrifuge	Eppendorf	5418	centrifugation
Electrophoresis apparatus	Bio-Rad	164-5050	Electrophoresis
Electroporation System	Bio-Rad	165-2100	for bacterial transformation
Spectrophotometer	BioTek	Epoch	Absorbance detection
Real-Time PCR system	Applied Biosystems	7500 system	qRT-PCR