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요약

λ-적색 매개 재조합 시스템을 사용하여 작은 비암호화 RNA micC의 결실 돌연변이를 생성했습니다.

초록

비코딩 소형 RNA(sRNA)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 새로운 인자입니다. 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 알려진 일종의 sRNA MicC는 외막 단백질의 발현을 억제할 수 있습니다. 살모넬라 엔테리티디스에서 micC의 조절 기능을 추가로 조사하기 위해, 우리는 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336에서 micC 유전자를 클로닝한 다음, λ 적색 기반 재조합 시스템에 의해 돌연변이 50336Δ micC를 구성하고 micC를 발현하는 재조합 플라스미드 pBR322를 운반하는 보완된 돌연변이 50336Δ micC/p micC를 구성했습니다. qRT-PCR 결과는 50336Δ micC에서 ompD의 전사가 야생형 균주보다 1.3배 더 높은 반면, 50336ΔmicC에서 ompA 및 ompC의 전사 는 야생형 균주보다 2.2배 및 3배 더 높았다. 이들은 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 다음 연구에서, 50336ΔmicC의 병원성은 6주령의 Balb/c 마우스와 1일령의 닭 모두를 감염시켜 검출되었다. 그 결과, 6주령 Balb/c 마우스에 대한 야생형 균주 50336의LD50, 돌연변이체 50336ΔmicC 및 50336Δ micC/pmicC가 각각 12.59 CFU, 5.01 CFU 및 19.95 CFU인 것으로 나타났다. 1 일 된 닭에 대한 균주의LD50은 각각 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU 및 2.54 x 108 CFU였다. micC의 결실이 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. Enteritidis는 외막 단백질의 발현을 조절하여 생쥐와 닭에서 발생합니다.

서문

비암호화 소형 RNA(sRNA)는 길이가 40-400 뉴클레오티드로, 일반적으로 단백질을 암호화하지 않지만 박테리아 염색체 1,2,3에서 독립적으로 전사될 수 있습니다. 대부분의 sRNA는 유전자 코딩 영역 사이의 유전자 간 영역(IGR)에 암호화되어 염기쌍 작용을 통해 표적 mRNA와 상호 작용하고 전사 후 수준에서 표적 유전자 발현을 조절합니다 4,5. 물질 대사, 외막 단백질 합성, 정족수 감지 및 독성 유전자 발현에서 중요한 조절 역할을 한다5.

MicC는 대장균 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움에 존재하는 109-뉴클레오티드 소RNA 전사체로, OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 및 Omp36 6,7,8,9와 같은 다중 외막 단백질 발현을 조절할 수 있습니다. MicC는 시험관 내에서 ompC mRNA 리더에 대한 리보솜 결합을 억제하여 OmpC의 발현을 조절하며 대장균6에서 기능을 위해 Hfq RNA 샤페론이 필요합니다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 MicC는 코딩 서열(코돈 23-26) 내의 ≤12-bp RNA 이중체를 통해 ompD mRNA를 침묵시킨 다음 내핵분해 mRNA7을 불안정화시킵니다. 이 조절 과정은 샤페론 단백질 Hfq10에 의해 지원됩니다. OmpC는 장과 같이 영양소와 독소 농도가 높은 환경에서 중요하다고 생각되는 풍부한 외막 단백질입니다6. OmpD 포린은 살모넬라 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 단백질이며 전체 세포 단백질11의 약 1%를 차지합니다. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC는 또한 OmpC 및 OmpD 포린 모두의 발현을 억제합니다. MicC는 독성을 조절할 수 있다고 생각됩니다. MicC에 의해 조절되는 새로운 표적 유전자를 탐색하고 micC의 독성 조절 기능을 연구하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(SE) 균주 50336에서 micC 유전자를 복제한 다음 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p micC를 구성했습니다. 새로운 표적 유전자를 qRT-PCR로 스크리닝하였다. 50336ΔmicC의 독성은 생쥐 및 닭 감염에 의해 검출되었다.

프로토콜

모든 실험은 국립연구위원회(National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었다. Yangzhou University의 동물 관리 및 사용위원회는 동물에 적용된 모든 실험 및 절차를 승인했습니다 (SYXK2016-0020).

1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건

  1. 표 1에 열거된 박테리아 및 플라스미드를 사용한다.
  2. 적절한 경우 50μg/mL 암피실린(Amp)이 있는 상태에서 37°C의 LB 배지 또는 LB 한천 플레이트에서 박테리아를 배양합니다.
  3. 온도에 민감한 플라스미드를 함유하는 배양 균주는 30°C에서 결실 돌연변이체 구축을 위해 사용된다.

2. S 의 micC 유전자 복제 Enteritidis 균주 50336

  1. S의 micC 유전자의 상류 및 하류 서열에 기초한다 . 티피무리움 균주 SL1344, 디자인 프라이머 vmicC-F 및 vmicC-R se50336 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR로 micC 유전자를 포함하는 단편을 증폭하였다.
  2. PCR을 위해 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 vmicC-F 및 vmicC-R 프라이머, 5 μL의 주형, 1 μL의 Taq DNA 중합효소 및 35 μL의ddH2O를 함께 혼합한다.
  3. 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 53°C에서 1분, 72°C에서 1분간 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장.
  4. PCR 산물을 염기서열 분석하여 micC 유전자 염기서열을 얻었다.

3. micC 결실 돌연변이체의 구성

참고: 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336의 micC-음성 돌연변이는 이전에 설명한 바와 같이 λ-적색 매개 재조합을 사용하여 구성되었습니다13,14. 사용된 프라이머는 표 2에 열거되어 있다.

  1. micC 유전자의 상동성 단편을 포함하는 클로람페니콜 카세트를 증폭합니다.
    1. micC 유전자의 5' 및 3'로부터의 50 bp 상동성 확장을 포함하여, 플라스미드 pKD3으로부터 클로람페니콜 (Cm) 카세트를 증폭하기 위해 micC-F 및 micC-R 프라이머를 설계한다.
    2. PCR 주형으로 pKD3 플라스미드를 추출합니다.
    3. PCR 반응 혼합물로서 10x PCR 반응 완충액 5 μL, dNTP 혼합물 (2.5 mM) 2 μL, micC-F 및 micC-R 프라이머 각각 1 μL, 템플릿 5 μL, Taq DNA 중합효소 1 μL 및 ddH2O35 μL를 함께 혼합한다
    4. 다음 PCR 반응 조건으로 Cm 카세트를 증폭한다: 94°C에서 4분 동안 예비변성; 1 분 동안 94 °C, 1 분 동안 52 °C, 10 사이클 동안 1 분 동안 72 °C; 94°C에서 1분, 63°C에서 1분, 72°C에서 1분, 25사이클, 72°C에서 10분 연장.
    5. PCR 산물의 크기를 아가로스 겔 전기영동으로 검출합니다. DNA 젤 회수 키트로 PCR 산물을 정제 및 회수하고 분광 광도계로 DNA 농도를 결정합니다.
      주의: PCR은 두 번 수행해야 합니다. 첫 번째 PCR 산물을 1:200의 비율로 희석하여 pKD3 플라스미드에 의한 추가 재조합의 간섭을 제거하기 위해 2차 PCR의 주형으로 사용했습니다.
  2. 1차 재조합 균주 50336ΔmicC::cat 구축
    1. 100μL의 SE50336 컴피턴트 세포와 5μL의 pKD46 플라스미드를 균일하게 혼합하고 30분 동안 얼음에서 배양합니다. 상기 혼합물을 42°C에서 90초 동안 열 충격하고, 혼합물을 2분 동안 얼음으로 빠르게 옮겨 pKD46 플라스미드를 SE50336으로 변형시켰다. Amp(50μg/mL) 내성 플레이트에서 30°C에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
    2. SE50336/pKD46 액체 배양액에 30mM L-아라비노스를 첨가하고, 30°C에서 1시간 동안 진탕 배양하여 재조합효소 발현을 유도한다. 그런 다음 유능한 세포를 준비하십시오.
    3. 정제된 PCR 산물 100ng(단계 3.1)과 SE50336/pKD46 컴피턴트 세포 40μL를 전기 충격 컵(예: Bio-Rad)에 혼합합니다. 전압 1.8 kV, 펄스 25 μF 및 저항 200 Ω의 매개 변수로 감전 변환을 수행하십시오.
    4. 전기변환 후, 혼합물을 1 mL의 SOC 배지로 옮기고, 150 rpm 및 30°C에서 1시간 동안 진탕 배양한다. 그런 다음 혼합물을 Cm(34μg/mL) 내성 LB 플레이트에 바르고 37°C에서 밤새 배양하여 양성 콜로니를 스크리닝합니다.
    5. 위의 양성 콜로니를 42°C에서 2시간 동안 배양합니다. Amp(50μg/mL)에 민감하지만 Cm(34μg/mL)에 내성이 있는 콜로니를 37°C에서 하룻밤 동안 스크리닝하여 pKD46이 없는 1차 재조합 균주를 얻었습니다.
  3. 1차 재조합 균주 50336ΔmicC::Cat을 식별합니다.
    1. PCR 템플릿으로 50336ΔmicC::Cat 게놈 DNA를 추출합니다. 단계 2.1에서와 동일한 PCR 반응 성분을 사용한다. 단계 2.1과 동일한 조건으로 PCR 반응을 수행한다.
    2. 아가로스 겔 전기영동에 의해 PCR 산물의 크기를 검출하고 PCR 산물을 시퀀싱합니다.
  4. 결실 돌연변이체 50336ΔmicC를 구축한다.
    1. 플라스미드 pCP20 100ng을 전압 1.8kV, 펄스 25μF 및 저항 200 Ω의 매개변수로 50336ΔmicC::Cat competent 세포 40μL에 전기증착하여 Amp(50μg/mL) 및 Cm(34μg/mL) 30°C에서 내성 플레이트 모두에서 양성 형질전환체를 스크리닝합니다.
    2. 위의 양성 형질전환체를 비내성 LB로 옮기고 42°C에서 밤새 배양한 다음, 37°C에서 LB 플레이트 상에서 단일 콜로니를 분리합니다. Amp와 Cm 모두에 민감한 콜로니를 선택합니다. 이 변이체는 micC 결실 변이체 SE50336ΔmicC이다.
    3. PCR로 50336ΔmicC 를 확인합니다.
      1. PCR 주형으로 50336ΔmicC 게놈 DNA를 추출합니다. 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 프라이머 vmicC-F, 1 μL의 프라이머 vmicC-R, 5 μL의 주형, 1 μL의 Taq DNA 중합효소 및 35 μL의ddH2O를 함께 혼합합니다.
      2. 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 53°C에서 1분, 72°C에서 1분, 25사이클, 72°C에서 10분 연장.

4. micC 보완 변형의 구성

  1. NheI 및 SalI 제한 부위가 있는 pBR-micC-F 및 pBR-micC-R 프라이머를 설계합니다.
    1. 5 μL의 SE50336 게놈 DNA를 주형으로, 프라이머 1 μL의 pBR-micC-F 및 1 μL의 pBR-micC-R을 프라이머로 포함하는 PCR 반응 혼합물, 5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 2 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM) 및 35 μL의ddH2O를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 사용하여 플랭크 서열로 전장 micC 유전자를 증폭합니다.
    2. 다음의 PCR 반응 조건을 사용하십시오: 94°C에서 4분 동안 예비변성; 94°C에서 30초, 52°C에서 50초, 72°C에서 1분 동안 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장. PCR 산물을 정제하고 회수합니다.
  2. PCR 산물 및 플라스미드 pBR322를 각각 제한효소 NheI 및 SalI를 사용하여 분해하고, 이를 T4 리가제를 사용하여 하룻밤 동안 16°C에서 라이게이팅하여 플라스미드 pBR322-micC를 얻었다.
  3. pBR322-micC를 SE50336ΔmicC 컴피턴트 세포로 형질전환하고, 양성 형질전환체를 스크리닝하여 보완된 균주 SE50336ΔmicC/pmicC를 얻었다. 보완된 균주에서 플라스미드 pBR322-micC를 추출하고 제한 효소 분해 및 시퀀싱으로 확인합니다.

5. RNA 분리 및 정량적 Real-Time PCR

  1. SE50336, 50336ΔmicC, 및 50336ΔmicC/pmicC 를 LB 배지에서 24°C에서 하룻밤 동안 180rpm으로 진탕 배양하여OD600 2.0으로 배양하였다. 13000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세균 배양액을 수집합니다.
  2. TRIzol 시약을 사용하여 전체 RNA를 추출합니다. 분리된 RNA 50μL와 DNaseI 2μL 및 10x 완충액 6μL를 37°C에서 30분 동안 배양하여 DNA를 제거합니다. 1 μL의 RNA 시료를 마이크로 분광 광도계에 피펫팅하여 RNA 양을 측정합니다.
  3. cDNA의 합성
    1. 20μL의 역전사 반응 시스템(4μL의 5x 완충액, 1μL의 RT 효소 혼합물, 1μL의 RT 프라이머 혼합물, 1μL의 총 RNA 및 4μL의ddH2O)에서 cDNA 합성을 위해 총 RNA 1μg을 사용합니다. 37°C에서 15분 동안 상기 반응계를 배양한 다음 85°C에서 5초 동안 배양합니다.
  4. 표적 유전자 ompA, ompC 및 ompD의 서열을 기반으로 프라이머를 설계합니다. RT 시약 키트를 사용하여 역전사-PCR을 수행합니다. PCR 반응 성분은 2.5 μL의 10x PCR 반응 완충액, 1 μL의 dNTP 혼합물 (2.5 mM), 1 μL의 표적 유전자 (ompA, ompC 또는 ompD) 프라이머, 2.5 μL의 주형, 0.5 μL의 Taq DNA 중합효소 및 17.5 μL의 ddH2O를 함유한다.
    1. 다음 PCR 반응 조건을 사용하십시오 : 94 °C에서 4 분 동안 사전 변성; 94°C에서 30초, 60°C에서 1분, 72°C에서 1분 동안 25사이클, 72°C에서 10분 동안 연장.
  5. RT-PCT 기기에서 SYBR green RT-PCR 키트를 사용하여 Real-Time PCR을 3회 수행합니다.
    1. 다음의 PCR 반응 성분을 사용하십시오: 10 μL의 2x SYBR 완충액, 0.4 μL의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 0.4 μL의 RoxDye II, 2 μL의 cDNA 및 6.8 μL의 RNase 유리H2O.
    2. 다음의 PCR 반응 조건을 사용하십시오: 1 사이클 동안 95°C에서 1분 동안 예비변성; 95 °C에서 5 초, 60 °C에서 34 초 동안 40 사이클.
    3. 모든 데이터를 내인성 참조 유전자 gyrA로 정규화합니다. 데이터 정량화를 위해 2-Δ ΔCT 방법을 사용합니다15.

6. 독성 분석

  1. SE50336, 50336ΔmicC 및 50336ΔmicC/pmicC 를 24°C에서 LB 배지 내지 초기 정지기(OD600 중 2-3)에서 배양하고, 원심분리에 의해 수확하고, 멸균 PBS에서 적절한 CFU mL-1 로 희석한다.
  2. 마우스 감염의 경우 배양된 균주를 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL 및 103 CFU/200 μL 그래디언트 재현탁으로 희석합니다. 균주당 5마리의 6-8주령 Balb/c 마우스 그룹을 피하 주사로 감염시킵니다. 대조군에 생리식염수 200μL를 주입합니다.
  3. 닭 감염의 경우, 위의 세 가지 균주를 107 CFU/200 μL, 10 8 CFU/200 μL 및 109 CFU/200 μL 그래디언트 재현탁액으로 희석합니다. 균주 당 20 마리의 1 일 된 닭 그룹을 피하 주사로 감염시킵니다.
  4. 매일 실험 동물의 질병 및 사망 징후를 모니터링하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 감염 후LD50 (치사량 중앙값) 14 d를 계산한다16. 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리합니다.
  5. 감염 그룹에서 갓 죽은 병아리의 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 수집합니다. 위의 조직 0.5g을 따로 따로 달아 멸균 작업으로 분쇄하십시오. 분쇄 샘플을 서서히 희석하고 LB 플레이트에 펴고 37°C에서 8-10시간 동안 배양합니다. 병아리 조직에 서식하는 살모넬라 균주의 양을 기록하십시오.

결과

돌연변이 50336Δ micC 및 보완 균주 50336Δ micC /pmicC의 구성
micC 유전자 클론 결과는 이 유전자가 109 bp로 구성되어 S의 유전자와 100% 동일함을 나타내는 것으로 나타났다. 티피무리움. 서열 데이터를 기반으로 결실 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p...

토론

에스. Enteritidis는 어린 닭을 감염시킬 수 있는 중요한 통성 세포 내 병원체이며 장염에서 전신 감염 및 사망에 이르기까지 증상을 유발합니다17,18. 또한, S. Enteritidis는 성충에게 잠복 감염을 일으키고 만성 보균자는 가금류 제품을 오염시켜 인간에게 식중독 감염을 일으킨다19. S. Enteritidis의 병원성 메커니즘은 더 자세히 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립 과학 재단 (Nos. 31972651 및 31101826), 장쑤 고등 교육 과학 재단 (No.14KJB230002), 수의학 생명 공학 국가 핵심 연구소 (No.SKLVBF201509), 양저우 자연 과학 재단 보조금 (No.YZ2014019), 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)이 자금을 지원하는 프로젝트.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
dextroseSangon BiotechA610219for broth preparation
DNA purification kitTIANGENDP214for DNA purification
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608for broth preparation
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116for broth preparation
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
Mini Plasmid KitTIANGENDP106plasmid extraction
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308for broth preparation
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol Invitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042for broth preparation
Yeast extractOxoidLP0021for broth preparation
centrifugeEppendorf5418centrifugation
Electrophoresis apparatusBio-Rad164-5050Electrophoresis
 Electroporation SystemBio-Rad165-2100for bacterial transformation
SpectrophotometerBioTekEpochAbsorbance detection
Real-Time PCR systemApplied Biosystems7500 systemqRT-PCR

참고문헌

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