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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein λ-Red-vermitteltes Rekombinationssystem wurde verwendet, um eine Deletionsmutante einer kleinen nicht-kodierenden RNA micC zu erzeugen.

Zusammenfassung

Eine nicht-kodierende kleine RNA (sRNA) ist ein neuer Faktor zur Regulierung der Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene. Eine Art sRNA MicC, wie sie in Escherichia coli und Salmonella Typhimurium bekannt ist, könnte die Expression von Proteinen der äußeren Membran unterdrücken. Um die Regulationsfunktion von micC in Salmonella Enteritidis weiter zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336Δ micC durch das λ Red-basierte Rekombinationssystem und die komplementäre Mutante 50336Δ micC/p micC, die das rekombinante Plasmid pBR322 trägt, das micC exprimiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten, dass die Transkription von ompD in 50336Δ micC 1,3-fach höher war als die im Wildtyp-Stamm, während die Transkription von ompA und ompC in 50336ΔmicC 2,2-fach und 3-fach höher war als im Wildtyp-Stamm. Diese deuteten darauf hin, dass micC die Expression von ompA und ompC unterdrückt. In der folgenden Studie wurde die Pathogenität von 50336ΔmicC sowohl durch die Infektion von 6 Wochen alten Balb/c-Mäusen als auch durch 1 Tag alte Hühner nachgewiesen. Das Ergebnis zeigte, dass die LD 50 des Wildtyp-Stammes 50336, die Mutanten 50336Δ micC und 50336Δ micC/pmicC für 6 Wochen alte Balb/c-Mäuse 12,59 KBE, 5,01 KBE bzw. 19,95 KBE betrugen. Die LD 50 der Stämme für 1 Tag alte Hühner betrugen 1,13 x 109 KBE, 1,55 x 10 8 KBE bzw.2,54 x 10 8 KBE. Es zeigte sich, dass die Deletion von micC die Virulenz von S erhöht. Enteritidis bei Mäusen und Hühnern durch Regulierung der Expression von Proteinen der äußeren Membran.

Einleitung

Nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) sind 40-400 Nukleotide lang, die im Allgemeinen keine Proteine kodieren, aber unabhängig voneinander in bakteriellen Chromosomen transkribiert werden können 1,2,3. Die meisten sRNAs kodieren in den intergenen Regionen (IGRs) zwischen genkodierenden Regionen und interagieren mit Ziel-mRNAs durch Basenpaarungsaktionen und regulieren die Expression von Zielgenen auf posttranskriptioneller Ebene 4,5. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Stoffstoffwechsels, der Proteinsynthese der äußeren Membran, der Quorum-Sensing und der Virulenz-Genexpression5.

MicC ist ein kleines RNA-Transkript mit 109 Nukleotiden, das in Escherichia coli und Salmonella enterica serovar Typhimurium vorkommt und die Expression mehrerer Proteine der äußeren Membran wie OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 und Omp36 regulieren könnte 6,7,8,9. MicC reguliert die Expression von OmpC, indem es die Bindung des Ribosoms an den ompC-mRNA-Leader in vitro hemmt, und benötigt das Hfq-RNA-Chaperon für seine Funktion in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium schaltet MicC ompD-mRNA über einen ≤12-bp-RNA-Duplex innerhalb der kodierenden Sequenz (Codons 23-26) aus und destabilisiert dann die endonukleolytische mRNA7. Dieser Regulationsprozess wird durch das Chaperonprotein Hfq10 unterstützt. Das OmpC ist ein reichlich vorhandenes äußeres Membranprotein, von dem angenommen wurde, dass es in Umgebungen mit hohen Nährstoff- und Toxinkonzentrationen, wie z. B. im Darm, wichtig ist6. Das OmpD-Porin ist das am häufigsten vorkommende äußere Membranprotein in Salmonella Typhimurium und macht etwa 1% des gesamten Zellproteins11 aus. OmpD ist an der Adhärenz an menschlichen Makrophagen und Darmepithelzellen beteiligt12. MicC unterdrückt auch die Expression von OmpC- und OmpD-Porinen. Es wird vermutet, dass MicC die Virulenz regulieren kann. Um neue Zielgene zu erforschen, die durch MicC reguliert werden, und um die Virulenzregulationsfunktion von micC zu untersuchen, klonierten wir das micC-Gen im Salmonella Enteritidis (SE)-Stamm 50336 und konstruierten dann die Mutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/p micC. Neuartige Zielgene wurden mittels qRT-PCR gescreent. Die Virulenz von 50336ΔmicC wurde durch Mäuse- und Hühnerinfektionen nachgewiesen.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats durchgeführt. Das Komitee für Tierpflege und -nutzung der Universität Yangzhou genehmigte alle Experimente und Verfahren, die an den Tieren angewendet wurden (SYXK2016-0020).

1. Bakterienstämme, Plasmide und Kulturbedingungen

  1. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Bakterien und Plasmide.
  2. Kultivieren Sie Bakterien in LB-Bouillon oder auf LB-Agarplatten bei 37 °C, gegebenenfalls in Gegenwart von 50 μg/ml Ampicillin (Ampicillin).
  3. Kulturstämme, die temperaturempfindliche Plasmide enthalten, werden für die Konstruktion von Deletionsmutanten bei 30 °C verwendet.

2. Klonen Sie das micC-Gen von S. an . Enteritidis Stamm 50336

  1. Basierend auf der Upstream- und Downstream-Sequenz des micC-Gens von S. Der Typhimurium-Stamm SL1344 entwirft die Primer vmicC-F und vmicC-R, um ein Fragment, das das micC-Gen enthält, mittels PCR unter Verwendung der genomischen DNA SE50336 als Vorlage zu amplifizieren.
  2. Für die PCR werden 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM), 1 μl vmicC-F- bzw. vmicC-R-Primer, 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Omiteinander vermischt.
  3. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 53 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Ausfahren bei 72 °C für 10 min.
  4. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt, um die micC-Gensequenz zu erhalten.

3. Konstruktion der micC-Deletionsmutante

HINWEIS: Die micC-negative Mutante des Salmonella Enteritidis-Stammes 50336 wurde mittels λ-Red-vermittelter Rekombination konstruiert, wie zuvor beschrieben13,14. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.

  1. Amplifizieren Sie die Chloramphenicol-Kassette, die Homologiefragmente des micC-Gens enthält.
    1. Entwicklung von micC-F- und micC-R-Primern zur Amplifikation der Chloramphenicol (Cm)-Kassette aus dem Plasmid pKD3, einschließlich 50 bp Homologieverlängerungen aus dem 5' und 3' des micC-Gens .
    2. Extrahieren Sie das pKD3-Plasmid als PCR-Template.
    3. Mischen Sie 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Mischung (2,5 mM), 1 μl micC-F- und micC-R-Primer, jeweils 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Oals PCR-Reaktionsgemisch zusammen
    4. Amplifizieren Sie die Cm-Kassette mit den folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 1 min, 52 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 10 Zyklen; 94 °C für 1 min, 63 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
    5. Bestimmen Sie die Größe des PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese. Reinigen und gewinnen Sie das PCR-Produkt mit dem DNA-Gel-Rückgewinnungskit zurück und bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
      ACHTUNG: Die PCR muss zweimal durchgeführt werden. Das erste PCR-Produkt wurde im Verhältnis 1:200 verdünnt und als Template für die sekundäre PCR verwendet, um die Interferenz einer weiteren Rekombination durch pKD3-Plasmid zu eliminieren.
  2. Konstruieren Sie 1. rekombinante Dehnung 50336ΔmicC::cat
    1. Mischen Sie 100 μl SE50336-kompetente Zellen mit 5 μl pKD46-Plasmid gleichmäßig und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Das obige Gemisch wird 90 s lang bei 42 °C durch einen Hitzeschock versetzt und 2 Minuten lang schnell in Eis überführt, um das pKD46-Plasmid in SE50336 umzuwandeln. Screenen Sie positive Kolonien durch Kultivierung über Nacht bei 30 °C auf einer Amp (50 μg/mL) resistenten Platte.
    2. 30 mM L-Arabinose in die SE50336/pKD46-Flüssigkultur geben und die Rekombinaseexpression durch eine 30 °C-Schüttelkultur für 1 h induzieren. Bereiten Sie dann kompetente Zellen vor.
    3. Mischen Sie 100 ng gereinigtes PCR-Produkt (Schritt 3.1) und 40 μl SE50336/pKD46-kompetente Zellen in einen Elektroschockbecher (z. B. Bio-Rad). Führen Sie eine elektrische Schlagumwandlung mit den Parametern Spannung 1,8 kV, Impuls 25 μF und Widerstand 200 Ω durch.
    4. Nach der Elektrotransformation wird das Gemisch in 1 ml SOC-Medium und eine Schüttelkultur bei 150 U/min und 30 °C für 1 h überführt. Anschließend wird die Mischung auf eine Cm-resistente LB-Platte (34 μg/ml) gestrichen und über Nacht bei 37 °C kultiviert, um eine positive Kolonie zu screenen.
    5. Kultivieren Sie die obige positive Kolonie bei 42 °C für 2 h. Screenen Sie die Kolonie, die empfindlich auf Amp (50 μg/ml), aber resistent auf Cm (34 μg/ml) ist, bei 37 °C über Nacht, um den 1. rekombinanten Stamm ohne pKD46 zu erhalten.
  3. Identifizieren Sie den 1. rekombinanten Stamm 50336ΔmicC::Cat.
    1. Extrakt 50336ΔmicC::Katzengenomische DNA als PCR-Template. Verwenden Sie die gleichen PCR-Reaktionskomponenten wie in Schritt 2.1. Führen Sie die PCR-Reaktion unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 2.1 durch.
    2. Bestimmen Sie die Größe des PCR-Produkts durch Agarose-Gelelektrophorese und sequenzieren Sie das PCR-Produkt.
  4. Konstruktieren Sie die Deletionsmutante 50336ΔmicC.
    1. Elektroporat 100 ng Plasmid pCP20 in 40 μL 50336ΔmicC::Cat-kompetente Zellen mit den Parametern Spannung 1,8 kV, Puls 25 μF und Widerstand 200 Ω, schirmen positive Transformatoren sowohl auf Amp (50 μg/mL) als auch auf Cm (34 μg/mL) resistente Platte bei 30 °C ab.
    2. Übertragen Sie die oben genannten positiven Transformanten in nicht-resistente LB und kultivieren Sie sie über Nacht bei 42 °C, und isolieren Sie dann einzelne Kolonien auf einer LB-Platte bei 37 °C. Wählen Sie die Kolonie aus, die sowohl für Amp als auch für Cm empfindlich ist. Bei dieser Mutante handelt es sich um die micC-Deletionsmutante SE50336ΔmicC.
    3. 50336ΔmicC mittels PCR verifizieren.
      1. Extraktion der genomischen DNA 50336ΔmicC als PCR-Template. Mischen Sie 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Mischung (2,5 mM), 1 μl Primer vmicC-F, 1 μl Primer vmicC-R, 5 μl Template, 1 μl Taq-DNA-Polymerase und 35 μlddH2Ofür die PCR zusammen.
      2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 53 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.

4. Aufbau des micC-komplementären Stammes

  1. Designprimer pBR-micC-F und pBR-micC-R mit NheI- und SalI-Restriktionsstellen.
    1. Amplifizieren Sie das micC-Gen in voller Länge mit Flankensequenzen unter Verwendung einer PCR-Reaktionsmischung, die 5 μl genomische DNA SE50336 als Matrize, Primer 1 μl pBR-micC-F und 1 μl pBR-micC-R als Primer, 5 μl 10x PCR-Reaktionspuffer, 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM), 2 μl dNTP-Gemisch (2,5 mM) und 35 μlddH2Oenthält.
    2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 52 °C für 50 s, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Ausfahren bei 72 °C für 10 min. Reinigen und gewinnen Sie das PCR-Produkt zurück.
  2. Das PCR-Produkt bzw. das Plasmid pBR322 werden unter Verwendung des Restriktionsenzyms NheI und SalI aufgeschlossen und unter Verwendung der T4-Ligase bei 16 °C über Nacht ligiert, um das Plasmid pBR322-micC zu erhalten.
  3. Transformieren Sie pBR322-micC in die SE50336ΔmicC-kompetenten Zellen und screenen Sie die positive Transformante, um den komplementären Stamm SE50336ΔmicC/pmicC zu erhalten. Extraktion des Plasmids pBR322-micC aus komplementärem Stamm und Verifizierung durch Restriktionsenzymaufschluss und Sequenzierung.

5. RNA-Isolierung und quantitative real-time PCR

  1. Kultur SE50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC in LB-Medium über Nacht bei 24 °C mit 180 U/min Schüttelkultivierung auf einen OD600 von 2,0. Sammeln Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 13000 U/min für 2 min.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit dem TRIzol-Reagenz. Inkubieren Sie 50 μl isolierte RNA mit 2 μl DNaseI und 6 μl 10x Puffer bei 37 °C für 30 min, um die DNA zu entfernen. Bestimmen Sie die RNA-Menge, indem Sie 1 μl RNA-Probe in ein Mikrospektralphotometer pipettieren.
  3. Synthese von cDNA
    1. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese in 20 μl des reversen Transkriptionsreaktionssystems (4 μl 5x-Puffer, 1 μl RT-Enzymmischung, 1 μl RT-Primermischung, 10 μl Gesamt-RNA und 4 μlddH2O). Über dem Reaktionssystem bei 37 °C für 15 min und dann bei 85 °C für 5 s inkubieren.
  4. Design-Primer basierend auf der Sequenz der Zielgene ompA, ompC und ompD. Führen Sie eine reverse Transkriptions-PCR mit einem RT-Reagenz-Kit durch. Die PCR-Reaktionskomponenten enthalten 2,5 μL 10x PCR-Reaktionspuffer, 1 μL dNTP-Gemisch (2,5 mM), 1 μL Zielgen-Primer (ompA, ompC oder ompD), 2,5 μL Template, 0,5 μL Taq-DNA-Polymerase und 17,5 μL ddH2O.
    1. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 4 min; 94 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 72 °C für 1 min für 25 Zyklen und Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
  5. Führen Sie eine real-time PCR mit dem SYBR green RT-PCR Kit in einem RT-PCT-Gerät in dreifacher Ausführung durch.
    1. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionskomponenten: 10 μL 2x SYBR-Puffer, 0,4 μL Forward-Primer bzw. Reverse-Primer, 0,4 μL RoxDye II, 2 μL cDNA und 6,8 μL RNase-freiesH2O.
    2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Reaktionsbedingungen:Vordenaturierung bei 95 °C für 1 min für einen Zyklus; 95 °C für 5 s, 60 °C für 34 s für 40 Zyklen.
    3. Normalisieren Sie alle Daten auf das endogene Referenzgen gyrA. Verwenden Sie die 2-Δ Δ CT-Methode zur Datenquantifizierung15.

6. Virulenz-Assays

  1. Kultur SE50336, 50336ΔmicC und 50336ΔmicC/pmicC in LB mittlerer bis früher stationärer Phase (OD600 von 2-3) bei 24 °C, Ernte durch Zentrifugation und Verdünnung auf geeignete KBE mL-1 in sterilem PBS.
  2. Bei Mäuseinfektionen werden die kultivierten Stämme auf 10 KBE/200 μl, 102 KBE/200 μl und 103 KBE/200 μl Gradientenresuspensionen verdünnt. Infizieren Sie Gruppen von fünf 6-8 Wochen alten Balb/c-Mäusen pro Stamm durch subkutane Injektion. Injizieren Sie der Kontrollgruppe 200 μl physiologische Kochsalzlösung.
  3. Bei Hühnerinfektionen werden mehr als drei Stämme auf 107 KBE/200 μl, 108 KBE/200 μl und 109 KBE/200 μl Gradientenresuspensionen verdünnt. Infizieren Sie Gruppen von zwanzig 1 Tag alten Hühnern pro Stamm durch subkutane Injektion.
  4. Überwachen Sie täglich Anzeichen von Krankheiten und Todesfällen von Versuchstieren. Berechnen Sie die LD50 (mediane letale Dosis) 14 Tage nach der Infektion, wie zuvor beschrieben16. Verarbeiten Sie die Daten mit einer Datenanalysesoftware.
  5. Sammeln Sie in Infektionsgruppen das Herz, die Leber, die Milz, die Lunge und die Niere von frisch verstorbenen Küken. Wiegen Sie 0,5 g der oben genannten Tücher separat ab und mahlen Sie sie steril. Mahlproben nach und nach verdünnen, auf LB-Platte verteilen und 8-10 h bei 37 °C kultivieren. Notieren Sie die Menge der Salmonella-Stämme , die im Kükengewebe besiedelt sind.

Ergebnisse

Konstruktion der Mutante 50336Δ micC und des komplementären Stammes 50336Δ micC /p micC
Das Ergebnis des micC-Genklons zeigte, dass dieses Gen aus 109 bp besteht und zu 100% mit dem von S identisch ist . Typhimurium. Basierend auf den Sequenzdaten konnten die Deletionsmutante 50336ΔmicC und die komplementäre Mutante 50336ΔmicC/pm...

Diskussion

S. Enteritidis ist ein wichtiger fakultativer intrazellulärer Erreger, der junge Hühner infizieren kann und Symptome von Enteritis bis hin zu systemischer Infektion und Tod hervorruft17,18. Darüber hinaus verursacht S. Enteritidis latente Infektionen bei erwachsenen Hühnern, und chronische Träger kontaminieren Geflügelprodukte, was beim Menschen zu lebensmittelbedingten Infektionen führt19. Der pathogene Mechanismu...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der Chinese National Science Foundation (Nr. 31972651 und 31101826), der Jiangsu High Education Science Foundation (Nr. 14KJB230002), des State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (Nr. SKLVBF201509) und des Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (Nr. YZ2014019) unterstützt, einem Projekt, das durch die Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) finanziert wird.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
dextroseSangon BiotechA610219for broth preparation
DNA purification kitTIANGENDP214for DNA purification
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent10017608for broth preparation
K2HPO4Sinopharm Chemical Reagent20032116for broth preparation
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red recombination
Mini Plasmid KitTIANGENDP106plasmid extraction
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308for broth preparation
(NH4)2SO4Sinopharm Chemical Reagent10002917for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Ligation
TRIzol Invitrogen15596018RNA isolation
TryptoneOxoidLP0042for broth preparation
Yeast extractOxoidLP0021for broth preparation
centrifugeEppendorf5418centrifugation
Electrophoresis apparatusBio-Rad164-5050Electrophoresis
 Electroporation SystemBio-Rad165-2100for bacterial transformation
SpectrophotometerBioTekEpochAbsorbance detection
Real-Time PCR systemApplied Biosystems7500 systemqRT-PCR

Referenzen

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