機能的および解剖学的に異なる領域へのマウス脳の微小解剖

要約

我々は、新鮮な脳組織からの離散領域のマウス脳除去および解剖のための実践的な、段階的、迅速なプロトコルを提示する。分子解析のために脳領域を取得することは、多くの神経科学研究室で日常的になっています。これらの脳領域は直ちに凍結され、システムレベルの解析のための高品質のトランスクリプトームデータが得られます。

要約

脳は哺乳類の神経系の司令センターであり、構造的に非常に複雑な器官です。頭蓋骨内で保護された脳は、大脳皮質として知られる半球上の灰白質の外側の覆いで構成されています。この層の下には、存在にとって重要な複数の現象に不可欠な他の多くの特殊な構造があります。特定の総脳領域のサンプルを取得するには、迅速かつ正確な解剖手順が必要です。微視的なレベルでは、多くのサブ領域が存在し、この解剖の目的のために課す任意の地域の境界を越える可能性が高いことが理解される。

マウスモデルは、ヒトの脳機能および疾患を研究するために日常的に使用されている。遺伝子発現パターンの変化は、罹患状態に応じて特定の表現型を標的とする特定の脳領域に限定され得る。したがって、その明確に定義された構造組織に関して転写の調節を研究することは非常に重要です。脳を完全に理解するには、異なる脳領域を研究し、接続を定義し、これらの各脳領域の活動における主要な違いを特定する必要があります。これらの異なる領域のそれぞれをより包括的に理解することは、神経科学の分野における新しく改善された治療への道を開くかもしれない。ここでは、マウスの脳を16の異なる領域に解剖するための段階的な方法論について説明します。この手順では、オスマウスC57Bl/6J(6-8週齢)の脳摘出と、神経解剖学的ランドマークを用いた複数の領域への解剖に焦点を当て、機能的に関連する脳領域と行動的に関連する個別の脳領域を同定し、サンプリングしました。この研究は、神経科学の分野で強力な基盤を築くのに役立ち、脳機能のより深い理解におけるより焦点を絞ったアプローチにつながります。

概要

脳は、脊髄および網膜とともに、全身にわたって特殊化され、正確に位置決めされ、相互作用する細胞型によって制御される複雑な行動を実行する中枢神経系を構成する¹。脳は、何十億もの相互接続されたニューロンとグリアを持つ複雑な器官であり、多数の機能を果たす正確な回路を備えています。これは、2つの異なる葉と多様な細胞成分²を有する両側構造である。脊髄は脳を外界に接続し、骨、髄膜、脳脊髄液によって保護され、脳との間でメッセージをルーティングします^2,3,4。脳の表面である大脳皮質は不均一で、ジャイリと呼ばれる明確なひだと、脳を機能中枢に分離するスルシと呼ばれる溝を持っています⁵。皮質は小さな脳を持つ哺乳類では滑らかです ^6,7.異なる脳領域に関連する障害とその機能回路を理解するために、人間の脳の構造を特徴付け、研究することが重要です。近年、神経科学の研究が拡大し、脳の構造や機能を研究するために様々な実験方法が用いられています。分子・システム生物学の分野における発展は、脳構造と分子の機能との複雑な関係を探る新時代の到来を告げました。さらに、分子生物学、遺伝学、エピジェネティクスは急速に拡大しており、システムの機能に関わる根底にあるメカニズムに関する知識を深めることができます。これらの分析は、より効果的な治療法の調査と開発をターゲットとするのに役立つ、はるかに局所的な基準で実施することができます。

哺乳類の脳は、構造的に明確に識別可能な離散領域に定義されています。しかし、これらの離散構造の機能的および分子的複雑さはまだ明確に理解されていない。脳組織の多次元的で多層的な性質は、この風景を機能レベルで研究することを困難にしています。加えて、複数の機能が同じ構造によって実行されるという事実、およびその逆もまた同様であるという事実は、脳⁸の理解をさらに複雑にする。脳領域の構造的および機能的特徴付けのために実行される実験的アプローチは、神経解剖学的アーキテクチャと機能を相関させるためのサンプリングの一貫性を達成するために、正確な研究方法論を使用することが極めて重要である。脳の複雑さは、最近、75の異なる細胞型11から構成されるヒト脳の側頭回のような単一細胞シーケンシング^9,10を用いて説明されている。このデータをマウス脳の類似領域からのデータと比較することにより、この研究はそれらの構造と細胞型の類似性を明らかにするだけでなく、違いも提示する。したがって、複雑なメカニズムを解明するためには、脳の多様な領域を完全な精度で研究することが重要です。ヒトとマウスの脳間の保存された構造と機能は、人間の脳機能と行動結果を解明するための予備的な代理としてマウスを使用することを可能にします。

システム生物学のアプローチの進歩に伴い、げっ歯類の離散的な脳領域から情報を得ることは、神経科学研究における重要な手順となっている。レーザー捕捉微小解剖¹² などのいくつかのプロトコルは高価であり得るが、機械的プロトコルは安価であり、一般的に入手可能なツール^13、14を用いて実行される。我々は、トランスクリプトームアッセイ¹⁵ に複数の脳領域を使用し、関心のあるマウス脳領域を短時間で段階的に解剖する実践的かつ迅速な手順を開発しました。解剖されると、これらのサンプルを直ちに低温条件下で保存して、これらの組織の核酸およびタンパク質を保存することができます。当社のアプローチはより迅速に実行でき、高効率を実現し、組織劣化の可能性を低く抑えることができます。これは最終的に、脳組織を使用して高品質で再現可能な実験を生成する可能性を高めます。

プロトコル

動物の取り扱いおよび実験手順は、動物ケアに関するヨーロッパ、国家および機関のガイドラインに従って実施された。すべての動物実験は、米国陸軍環境衛生研究センター(現在のウォルターリード陸軍研究所(WRAIR)の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)の認定を受けた施設で実施されました。
注:この手順は、子宮頸部脱臼によって安楽死させたC57BL/6j株の6〜8週齢の雄マウス^{に対して行われる16}。私たちの研究室では灌流は行われていませんが、血管系から血液をきれいにするための灌流を行うことができるように、このプロトコルを変更することができます。解剖に必要なすべての消耗品は、 材料表に記載されています。解剖は、脳の除去、下垂体の除去および脳の解剖を含む3つの構成要素に細分される。脳組織収集の目的は、RNA抽出後のトランスクリプトームアッセイのためにそれらを処理することです。脳領域が解剖されるとすぐに、各脳領域をすでにラベル付けされた冷凍バイアルに移し、バイアルを液体窒素または-80°Cに保管します。
注:神経解剖学の徹底的な知識は、この手順を実行するために不可欠です。水平および縦方向のセクション、ならびに通常の横方向のセクションは、研究され、学習されるべきである。脳組織は非常に急速に劣化するので、この手順を実行しながらアトラスに相談する時間はありません。

1. マウスの脳の除去

1. 断頭した頭部の上顎を止血器でクランプし(図2i)、ガーゼパッドを使用して頭皮を吻側に反射させ、さらに頭蓋骨の背側に乾燥したフィールドを作成します(図2ii)。
2. 細かい湾曲したはさみを有孔虫マグナムに挿入して、付着している髄膜を分離します。ここで、頭蓋骨の基部の開口部にハサミを挿入するのは有孔虫であり、脊髄はブレードを垂直に(12時の位置)に向けながら通過するが、基底板骨(すなわち、後頭扁平上皮)の内面に平行におよび押し付け、ブレードを左側に45°回転させ、次に右側に回転させる。
3. 手首を回転させ続け、残りの骨の中央を切り取る基底板骨をこじ開けて、後頭骨と頭頂内骨に続き、骨が取り除かれるまで骨を左右に覗き見します。同様に、後頭部骨と頭頂内骨を取り除き、小脳を露出させます。
   注:この時点で、中耳と内耳の一部を囲む頭蓋骨の腹側後部にある鼓膜水疱と呼ばれる中空の骨構造は、下垂体の後葉と前葉を解剖しない限り、除去することができます(図2iii)。
4. 湾曲した鋭いはさみの刃を使用して、側頭隆起部への筋肉の付着物を除去する。湾曲した鋭いはさみの片肢を、横方向および矢状副鼻腔の接合部に貫通するラムドイド縫合糸の下に置く(図2iv)。
5. はさみを矢状中縫合糸に沿ってブレグマまで吻側に進め、脳皮質の裂傷を避けるために慎重に上に持ち上げながら非常に穏やかに切断します。これは、手順の重要なステップです(図2v)。
6. このステップでは、頭頂骨が持ち上げられ、回転し、骨の内面を削り取って、残りの髄膜付着物を識別して切断する。脳から離れて、外側に覗いている側頭骨をつかみます。湾曲したはさみまたはロンガーを使用して両側から前頭骨を軌道に取り外し、眼窩尾根に対して直角に冠状に切断するが、正中線よりは進まない(図2vii)。
7. 矢状面で2つのカットを平行に約4mm離します(図2viii)。
   メモ:1回のストロークで両側をカットしないでください。
8. 前頭骨の断片を除去し、脳表面を裂傷させないようにします(図2ix)。この時点で、細かいはさみを使用して、嗅球の間でアクセスできるはずの硬膜を切断します。
9. 頭蓋骨を静かに反転させて重力が脳の除去を補助できるようにしながら、残りの髄膜付着物と脳神経を特定して切断し続けます。脳は、脳に取り付けられた最大の三叉神経を切断することによって解放され、カルバリウムの基部から伸びてはっきりと見えます(図2x)。
   注:さらなる解剖のために、脳を冷たい生理食塩水(氷冷RNaseフリークエン酸ナトリウム(0.9%)または生理学的生理食塩水(0.9%))に移します。

2. 下垂体前部および後部の解剖

注:下垂体は、左右の三叉神経の間を横方向に走る隆起を有する、非常に丈夫なテント状の膜で覆われている。これらの構造は非常に柔らかく繊細であるため、下垂体の後葉と前葉は、頭蓋骨から直接段階的に、 その場で別々に解剖することをお勧めします。解剖直後に、各下垂体を予め標識されたバイアルに移し、それ以外は好ましくは-80°Cの液体窒素中にバイアルを保管する。 下垂体は、後頭部骨と基底フェノイド骨の接合部に正確に置かれています。それらが屈曲すると、下垂体アーキテクチャは破壊される。

1. 下垂体解剖学が無傷で容易に識別可能であることを確認するために、聴覚水疱を無傷に保ちます(図2ix)。
2. 頭蓋骨の残りの部分から、下垂体の後葉に続いて下垂体の前葉を解剖する。
3. 膜状テントの隆起部の両側に非常に小さな傍矢状切開を行い、下垂体前葉を超微細鉗子で持ち上げ、下垂体前部組織を混乱させないように注意する(図2x)。
4. 下垂体前葉の側縁と最も近い三叉神経の間に矢状切開を行い、その後下垂体の前葉を持ち上げる(図2x)。

3. マウス脳解剖

注:脳および下垂体の摘出直後に、予め冷却されたステンレス鋼ブロックに対してさらなる解剖が行われる(図3)。解剖後、脳領域を予め標識されたバイアルに移し、バイアルを好ましくはそうでなければ-80°Cの液体窒素に移す。 トップダウン法(年代順)によって生成される構造には、小脳(CB)、脳幹/後脳(ポンおよび延髄)(HB)、付属嗅球としての嗅球(OB)、内側前頭前皮質(MPFC)、側頭前野(FCX)、前後脳線条体(ST)、側坐核(NAC)および嗅結節(OT)からなる腹側線条体(VS)、 中隔(SE)、視前領域、梁型皮質(PFM)、視床下部(HY)、扁桃体(AY)、海馬(HC)、後帯状皮質(CNG)、嗅内皮質(ERC)、視床および残りの大脳皮質(ROC)を有する中脳(MB)(表1)。特定の領域は、単一の半球で作業しながら、孤立の順に議論されます。

1. 亀裂がある場合にランドマークが破壊される可能性があるため、カルバリウムから脳を取り除くことに細心の注意を払ってください。このステップでは、顔の保護、具体的には7倍の宝石バイザーを使用してすべての解剖を行い、照明は各解剖の肩の上に配置された手術用ランプによって提供されます。解剖の多くは、鈍いモードの小さな湾曲した鉗子(すなわち、グレーフ鉗子)を使用して達成される。
2. ステンレス製のブロックの上に脳を置きます(図4iと図4ii)。ブロックを氷と氷冷食塩水で囲んで冷たく保ちます。構造を保存するために氷冷生理食塩水で組織を定期的に湿らせます。
3. 脳皮質が上を向くように脳を配置します。小さな湾曲した鉗子を用いて、上小脳、中小脳および下小脳椎弓を露出させることによってCBを穏やかに反射させ、CBを除去する(図4iiiおよび図4iv)。
4. 背甲から OB と大脳半球の間を矢状中程度に切り込み(図4v)、前部交感神経よりも遠くまで伸びないようにしてください。この時点で、害獣は側方部分から容易に分離することができ、 HB はポンの前縁で冠状に切断することによって得られるであろう。
5. 髄質をポンスの後縁にある冠状動脈カットで分離する。
   注:この時点で、視床上、視床、視床下部、腹側視床を含む前脳の後部、および第3心室である間脳は腹側を上に向け、視神経吻合から矢状中部を吻側に切り込みます。大脳半球の解剖に続いて半球の1つからOBを除去することは、このステップである(図4vおよび図4vi)。
6. 大脳半球を分離し(図4v)、間脳をさらに解剖する(図4v)。背側アプローチは、批判的に顕著な正中線ランドマークを保存するために、慎重な鈍い解剖によって採用される。すべての半球間接続を視覚化してから切断すると、正中線から逸脱する可能性が最小限に抑えられます。
   注:この段階では、大脳半球(半脳)の1つを保存することができ、2番目の半球をさらに解剖するために使用することができます
7. 脳梁の下に小さく湾曲した鉗子の閉じた刃を滑り込ませ、新皮質を両側に引っ込めるために静かに広げます。脳梁は、2つの半球をつなぐ神経線維の広いバンドであり、その下に横たわる正中線構造を乱すことなく、鉗子でつまむことによって鈍く解剖されます。
   注:半球の中間面には、脳梁の真髄、フォーニス、前部交感神経などの有髄構造など、複数のランドマークが表示されます。また、正中線に対して数ミリメートルの横方向にあるが、マンミロ視床管および筋膜後屈曲も見えることがある。
8. 正中線を横切る複数の構造を二等分します。これには、脳梁、前梁交感神経、腹側扁平骨交感神経、後梁梁交感神経、背側扁平骨交感神経、上側椎間板交感、腹側梁梁滑生、および心室周囲視床線維が含まれる。
9. このステップでは、背側アプローチ法によって部分的に損なわれる可能性のある正中線内またはその近くで特に注意してください。すべてのフォローアップ構造は、慎重に実行しないと危険にさらされます。
10. OB(くさび形と明るい色)と付属の嗅球根を取り除き、続いてMPFC(帯状皮質領域1、前大脳辺縁系、下辺縁系、内側眼窩、および二次運動皮質[M2])とFCXを、脳梁の属に対して1mm前方に作られた冠状動脈カットによって収集します(図4vii)。得られた断面を内側から側方表面までの距離の1/3の傍矢状カットで分割し、MPFCを内側に、残りの部分をFCXを横方向に得る。帯状皮質はMPFCのマウス類似体である。
    注:この組織スライスには少量のM2(二次運動野) ¹⁷ も含まれており、やむを得ません。
11. 結果として生じる冠状断面の吻側面上の断面における前部交絡膜の前肢のパースの視認性につながる前部交感神経のレベルで冠状動脈切開を行う一方、横方向部分は断面の尾面で明らかにされるが、これは NAC¹⁸の確認的ランドマークである。 VS は NAC と OT で構成されています。
    注:前部交感神経には横方向のセグメントに加えて前肢があり、それは前眼部、前部と呼ばれます。
12. 部分的に側脳室の前角の下の正中線から前心房の横方向部分を通って水平に切断し、背側および VS 腹側の中隔核を解放する。 NAC と OT が除去される側方表面から少量の皮質を除去します。
13. 皮質サンプルに線条体組織が含まれないように注意しながら、外部カプセルのすぐ外側に切断された湾曲したメスを介して 、ST の吻側部分を上側の皮質から分離する。この時点で、中隔 核/SE が見え、このスライスから簡単に取り出すことができます(図4viii)。
    注: PFM の前部および後部限界は、それぞれ前部コミスシュアおよびマンミラリー体に沿った架空の冠状面によって定義される。内側限界は、外部カプセル¹⁸によって定義される。
14. 間脳の残りの半部の側面に、尾側に延びる鼻溝に沿って部分的な水平切断を行うが、マンミラリー体との想像上の冠状面レベルまでしか切断しない。HYのマンミラリー体の平面において外側皮質表面から内側に1mm延びる部分的な冠状動脈切断を行う。ここで、閉所の平面における傍矢状切開はPFMを解放する(図4ixおよび図4x)。
    注:間脳の残りの半部の内側表面には、乳頭小体、筋膜後屈曲、および線条体髄質を含む多数の解剖学的特徴が見える。半円形のパターン(背側凹面側)が見え、視 床 と HYの間のマージンを示します。 HY は、前腹側および前側擬状前葉側の視神経吻合、および後部筋膜後屈筋とともに乳孔体ごとに、中矢状断面図で容易に識別される。後者のランドマークは、アトラス¹⁷ およびアルビノマウス前脳コンテキスト¹⁹によく表示されている。
15. マンミラリー体の後方に部分的な冠状動脈カットを行い、視床下部の硫黄まで横方向にのみ延びる。この時点で、視床下部の硫黄の長さに沿った傍矢状切断が HY を解放するようになりました。
16. 外側心室の可動性を伴い、追加の大脳辺縁系接続および残りの大脳辺縁系構成要素を明らかにする。間脳の残りの半部の内側面を見ると、湾曲した鉗子は、技術者が扁桃腺を切断するために使用される周囲領域の他の繊細な部分の周りを操作し、側心室に挿入され、心室を開き、 HC を回転させるために鈍い解剖を使用して穏やかに拡張されるため、最良の選択肢となる。垂直から水平面まで90°。尖った先端が正確な切り口に役立つ可能性があるため、脈絡膜動脈/脈絡叢を切除するために#11ブレードを使用する必要があるかもしれません。
17. CNG を 90° (ただし、HC とは反対方向に) 回転させて、水平面にします。鉗子を使用して、HCをさらに外側と横方向に180°静かに回転させると、ERCの内面が見え、上向きになります。
18. ERCから生じる有髄線維のファン様放射が収束して、穿孔経路およびHCへの付着を含む角束を形成するのが見られるであろう。視床とMB 180°を背側に回転させて腹側にAYを明らかにする。
19. 必要に応じて、視床の心室表面の側縁に沿って走る線維のバンドをAYに含み、 AY の 輪郭を明確にするため 、視路を持ち上げて線条体末端の付着を明らかにする。
    注: HC およびフォルニクスは、その全体がはっきりと見え、側脳室にネストされ、容易に持ち上げることができる。側心室はピアマットで裏打ちされ、 ERC の非常に透明な亜膝下側面を通る穿孔経路のファンのような起源が見える²⁰。
20. 内側 ERC の外表面は、大きな錐体細胞の目に見える顕著な層を有するであろう。さらに、ゴルジ染色繊維の緻密な収束は、内側 ERCの顕著な特徴となるであろう。この解剖手順では、側脳室を切断した後、これらの線維は、心室の内面を覆うピアマーターを介して内側表面に容易に見え、非常に顕著な扇状構造を形成する。
21. 線維が下部に集まり、腹側ERCを下降して離れ、後方に伸び、次に垂直に上昇してHCを穿孔していることに注意してください。ERCのこの扇状構造は、解剖の目的でマージンを定義するために使用されます。AY、ERC、CNG、HC構造の順に識別して除去します。
    注: AY 解剖のための良いランドマークを定義することは次のステップの鍵となり、線条体末端が AY と出会う後縁の接合部は良い点になるでしょう。
22. この時点で、残りの構造には 視床 と MBが含まれます。正中線吻側尾面に延びる背側表面の線条体髄質を可視化することにより視床の同定を確認する。 視床 を 中脳 から完全に分離するには、冠状動脈の尾部をハベヌラに、吻側を上大腸に切断します。 ROC はこのステップで保存されます。
23. この時点で、すべての脳領域の完全な収集と、直ちに(それぞれが取得されるように)さらなる処理までサンプルをフラッシュ凍結して保存する。

結果

複雑な脳の構造と機能に関する私たちの理解は急速に進化し、改善されています。脳には複数の異なる領域が含まれており、分子マップを構築することは、脳がどのように機能するかをよりよく理解するのに役立ちます。この方法論文では、マウスの脳を複数の異なる領域に解剖することについて議論しました(表1)。このプロトコルでは、構造は重要なランドマークに基づいて?...

ディスカッション

哺乳類の脳は、多様な分子シグネチャを持つ形態学的に明確で機能的にユニークな細胞の配列と、特殊で離散的な機能を実行する複数の領域で構成される複雑な器官です。ここで報告する解剖手順は、ラボの要件に応じて複数の目標を持つことができます。私たちの研究室では、ストレスのようなPTSDに曝露されたマウスから採取した複数の脳領域における転写を評価した¹⁶ ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Removal
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6762	5.5" straight sharp/sharp
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6763	5.5" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6703	4.75" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6702	4.75" straight sharp/sharp
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved Sharp/Sharp
Micro spatula, radius and tapered flat ends			stainless steel mirror finish
Operating scissors 6.5"	Roboz Surgical Store	RS-6846	curved sharp/sharp
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160	4.5” 1X2 teeth 2mm tip width
Rongeur (optional)	Roboz Surgical Store	RS-8321 many styles to choose	Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades	Roboz Surgical Store	RS-9801-11	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Super fine forceps Inox	Roboz Surgical Store	RS-4955	tip size 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A magnification visor	Penn Tool Col	40-178-6	2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier
Dissection cold plate	Cellpath.com	JRI-0100-00A	Iceberg cold plate & base
Graefe forceps, full curve extra delicate	Roboz Surgical Store	RS-5138	0.5 mm Tip 4” (10 cm) long
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved sharp/sharp
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843 (repeated above)	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades (especially #11)	Roboz Surgical Store	RS-9801-11 (repeated above)	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Spatula	Amazon	MS-SQRD9-4	Double Ended Spatula Square AND Round End
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160 (repeated above)	4.5” 1X2 teeth