Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

Resumo

Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.

Resumo

O cérebro é o centro de comando do sistema nervoso mamífero e um órgão com enorme complexidade estrutural. Protegido dentro do crânio, o cérebro consiste em uma cobertura externa de matéria cinzenta sobre os hemisférios conhecidos como córtex cerebral. Abaixo dessa camada residem muitas outras estruturas especializadas que são essenciais para múltiplos fenômenos importantes para a existência. A aquisição de amostras de regiões cerebrais brutas específicas requer passos de dissecção rápidos e precisos. Entende-se que, no nível microscópico, existem muitas sub-regiões e provavelmente cruzam as fronteiras regionais arbitrárias que impomos para efeitos desta dissecção.

Modelos de camundongos são usados rotineiramente para estudar funções e doenças cerebrais humanas. Alterações nos padrões de expressão genética podem estar confinadas a áreas cerebrais específicas visando um fenótipo específico, dependendo do estado doente. Assim, é de grande importância estudar a regulação da transcrição no que diz respeito à sua organização estrutural bem definida. Uma compreensão completa do cérebro requer estudar regiões cerebrais distintas, definir conexões e identificar diferenças fundamentais nas atividades de cada uma dessas regiões cerebrais. Uma compreensão mais abrangente de cada uma dessas regiões distintas pode abrir caminho para novos e aprimorados tratamentos no campo da neurociência. Aqui, discutimos uma metodologia passo a passo para dissecar o cérebro do rato em dezesseis regiões distintas. Neste procedimento, focamos na remoção e dissecção cerebral do camundongo C57Bl/6J (6-8 semanas) em múltiplas regiões usando marcos neuroanatomáticos para identificar e amostrar regiões cerebrais discretas e relevantes do funcionamento e comportamentalmente relevantes. Este trabalho ajudará a estabelecer uma base forte no campo da neurociência, levando a abordagens mais focadas na compreensão mais profunda da função cerebral.

Introdução

O cérebro, juntamente com a medula espinhal e a retina, compreendem o sistema nervoso central que executa comportamentos complexos, controlados por tipos de células especializadas, precisamente posicionadas e interagindo em todo o corpo¹. O cérebro é um órgão complexo com bilhões de neurônios interconectados e glia com circuitos precisos realizando inúmeras funções. É uma estrutura bilateral com dois lobos distintos e diversos componentes celulares². A medula espinhal conecta o cérebro ao mundo exterior e é protegida por ossos, meninges e fluido cefalorraquidiano e encaminha mensagens de e para o cérebro ^2,3,4. A superfície do cérebro, o córtex cerebral, é desigual e tem dobras distintas, chamadas gyri, e sulcos, chamados sulci, que separam o cérebro em centros funcionais⁵. O córtex é suave em mamíferos com um cérebro pequeno ^6,7. É importante caracterizar e estudar a arquitetura do cérebro humano para entender os transtornos relacionados às diferentes regiões cerebrais, bem como seus circuitos funcionais. A pesquisa em neurociências se expandiu nos últimos anos e uma variedade de métodos experimentais estão sendo usados para estudar a estrutura e a função do cérebro. Desenvolvimentos nos campos da biologia molecular e de nível de sistemas iniciaram uma nova era de exploração da complexa relação entre estruturas cerebrais e o funcionamento das moléculas. Além disso, biologia molecular, genética e epigenética estão se expandindo rapidamente, permitindo-nos avançar nosso conhecimento dos mecanismos subjacentes envolvidos na forma como os sistemas funcionam. Essas análises podem ser realizadas de forma muito mais localizada, para ajudar na investigação e desenvolvimento de terapias mais eficazes.

O cérebro mamífero é estruturalmente definido em regiões discretas claramente identificáveis; no entanto, as complexidades funcionais e moleculares dessas estruturas discretas ainda não são claramente compreendidas. A natureza multidimensional e multicamadas do tecido cerebral torna essa paisagem difícil de estudar no nível funcional. Além disso, o fato de que múltiplas funções são executadas pela mesma estrutura e vice-versa complica ainda mais a compreensão do cérebro⁸. É vital que a abordagem experimental executada para a caracterização estrutural e funcional das regiões cerebrais utilize metodologias precisas de pesquisa para obter consistência na amostragem para correlacionar arquitetura neuroanatomical com função. A complexidade do cérebro foi recentemente explicada usando sequenciamento de células únicas ^9,10, como o giro temporal do cérebro humano que é composto por 75 tipos de células distintas¹¹. Comparando esses dados com os de uma região análoga do cérebro do camundongo, o estudo não só revela semelhanças em sua arquitetura e tipos celulares, mas também apresenta as diferenças. Para desvendar os mecanismos complexos, é importante, portanto, estudar diversas regiões do cérebro com plena precisão. Estruturas conservadas e função entre um cérebro humano e rato permitem o uso de um rato como substituto preliminar para elucidar a função cerebral humana e os resultados comportamentais.

Com o avanço das abordagens de biologia de sistemas, a obtenção de informações de regiões cerebrais discretas em roedores tornou-se um procedimento fundamental na pesquisa em neurociência. Embora alguns protocolos como a microdisseção de captura a laser¹² possam ser caros, os protocolos mecânicos são baratos e realizados usando ferramentas comumente disponíveis^13,14. Usamos várias regiões cerebrais para ensaios transcriômicos¹⁵ e desenvolvemos um procedimento prático e rápido para dissecar regiões cerebrais de camundongos de interesse de forma passo a passo em pouco tempo. Uma vez dissecadas, essas amostras podem ser armazenadas imediatamente em condições frias para preservar os ácidos nucleicos e proteínas desses tecidos. Nossa abordagem pode ser realizada mais rapidamente, levando a alta eficiência e permitindo menos chances de deterioração tecidual. Isso, em última análise, aumenta as chances de gerar experimentos reprodutíveis de alta qualidade usando tecidos cerebrais.

Protocolo

O manejo animal e os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais para o cuidado animal. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) no Centro de Pesquisa em Saúde Ambiental do Exército dos EUA, agora Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) e realizados em uma instalação credenciada pela Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC).
NOTA: O procedimento será realizado em camundongos machos de seis a oito semanas de idade da cepa C57BL/6j eutanizada por deslocamento cervical¹⁶. Não são realizadas perfusões em nosso laboratório, mas este protocolo pode ser modificado pelo qual perfusões para limpar o sangue da vasculatura poderiam ser realizadas. Todos os suprimentos necessários para a dissecção estão listados na Tabela de Materiais. A dissecção é subdividida em três componentes, incluindo a remoção do cérebro, a remoção da glândula pituitária e a dissecção cerebral. A intenção da coleta de tecido cerebral é processá-los para ensaios transcriômicos após extrações de RNA. Assim que a região cerebral é dissecada, transferimos imediatamente cada uma das regiões cerebrais para um frasco congelador já rotulado e, em seguida, armazenamos o frasco em nitrogênio líquido ou -80 °C.
NOTA: O conhecimento completo da neuronatomia é essencial para realizar este procedimento. Seções horizontais e longitudinais, bem como as seções transversais usuais, devem ser estudadas e aprendidas. Uma vez que o tecido cerebral se degrada muito rapidamente, não há tempo para consultar um atlas durante a realização deste procedimento.

1. Remoção do cérebro do rato

1. Fixar a maxila da cabeça decapitada com um hemosta (Figura 2i) e usar uma gaze para refletir o couro cabeludo rostrally criando ainda mais um campo seco no dorso do crânio (Figura 2ii).
2. Insira a tesoura curva fina no forame magnum para separar as meninges adesórias. Aqui, insira a tesoura na abertura na base do crânio é o forame magnum, onde a medula espinhal passa com a lâmina apontando verticalmente (posição 12 horas), mas paralelamente e pressionando contra a superfície interior do osso da placa basal (ou seja, squama occipital) e girando a lâmina 45° para o lado esquerdo e, em seguida, para o lado direito.
3. Continue a girar o pulso para arrancar o osso da placa basal que cortará o meio do osso restante continuando no osso occipital e ossos intraparietais intrometendo os ossos esquerdo e direito até que eles sejam removidos. Da mesma forma, remova o osso occipital e o osso intraparietal para expor o cerebelo.
   NOTA: Neste ponto, a estrutura óssea oca chamada bíblica tympanic, na porção posterior ventral do crânio que inclui partes do ouvido médio e interno, pode ser removida a menos que se esteja dissecando os lobos posterior e anterior dos pituitários (Figura 2ii).
4. Remova os acessórios musculares ao cume temporal usando uma lâmina de tesoura afiada curvada. Coloque um membro da tesoura afiada curva sob a sutura lambdoide penetrando na junção dos seios transversais e sagitários (Figura 2iv).
5. Avance a tesoura rostrally ao longo da sutura midsagittal até o bregma e corte-a com muita gentileza enquanto levanta cuidadosamente para cima para evitar laceração de cortices cerebrais. Este é um passo crítico no procedimento (Figura 2v).
6. Nesta etapa, os ossos parietal são levantados e girados, raspando assim a superfície interna do osso para identificar e cortar os acessórios meningeais restantes. Segure o osso temporal se intrometendo externamente, longe do cérebro. Remova o osso frontal de cada lado usando uma tesoura curva ou um rongeur na órbita e cortando coronally em um ângulo reto para a crista orbital, mas não mais longe da linha média (Figura 2vii).
7. Faça dois cortes paralelos e cerca de 4 mm de distância no plano sagital (Figura 2viii).
   NOTA: Não corte ambos os lados com um único golpe.
8. Remova os fragmentos do osso frontal evitando dilacerar a superfície cerebral (Figura 2ix). Neste ponto, use uma tesoura fina para cortar a dura mater, que deve ser acessível entre as lâmpadas olfativas.
9. Inverter suavemente o crânio para permitir que a gravidade ajude na remoção do cérebro, enquanto continua a identificar e cortar os anexos meningeais restantes e os nervos cranianos. O cérebro será liberado cortando o maior nervo trigêmeo ligado ao cérebro e é claramente visível estendendo-se da base do calvarium (Figura 2x).
   NOTA: Transfira o cérebro para uma solução salina fria (citrato de sódio sem resfriado de RNase (0,9%) ou fisiológico (0,9%) para dissecção posterior.

2. Dissecção dos Pituitários Anteriores e Posteriores

NOTA: As glândulas pituitárias são cobertas por uma membrana muito resistente como uma tenda, com um cume que corre lateralmente entre os nervos trigêmeos esquerdo e direito. Essas estruturas são extremamente macias e delicadas e, como tal, recomenda-se que os lobos posteriores e anteriores das glândulas pituitárias sejam dissecados separadamente em estágios, in situ, diretamente do crânio. Imediatamente após a dissecação, transfira a respectiva glândula pituitária para um frasco pré-rotulado e armazene o frasco em nitrogênio líquido de preferência -80 °C. A glândula pituitária repousa exatamente sobre a junção dos ossos occipital e basefenóide; se flexionarem, a arquitetura pituitária é interrompida.

1. Mantenha o bullae auditivo intacto para garantir que a anatomia pituitária esteja intacta e facilmente identificável (Figura 2ix).
2. Disseca o lobo posterior da pituitária seguido pelo lobo anterior da pituitária, do restante do crânio.
3. Faça um corte parasagittal extremamente pequeno em ambos os lados no cume da tenda membranous e levante o lobo posterior da pituitária com fórceps ultrafinas, tomando cuidado para não interromper o tecido pituitário anterior (Figura 2x).
4. Faça um corte sagital entre as margens laterais do lobo anterior da pituitária e o nervo trigêmeo mais próximo e levante o lobo anterior da pituitária posteriormente (Figura 2x).

3. Dissecção cerebral do rato

NOTA: Imediatamente após a remoção do cérebro e da hipófise, uma dissecção adicional é realizada em um bloco de aço inoxidável pré-refrigerado (Figura 3). Pós-dissecção, transfira as regiões cerebrais para frascos pré-rotulados e transfira os frascos de preferência para nitrogênio líquido de outra forma -80 °C. Estruturas produzidas pelo método de cima para baixo (em ordem cronológica) potencialmente incluem o seguinte: cerebelo (CB), tronco cerebral/cérebro traseiro (pons e medulla oblongata) (HB), lâmpadas olfativas (OB) como lâmpadas olfativas acessórias, córtex pré-frontal medial (MPFC), córtex pré-frontal lateral (FCX), estriado de corpus anterior e posterior (ST), estriatum ventral (VS) composto pelo núcleo accumbens (NAC) e tubérculo olfativo (OT), septum (SE), área pré-óptica, córtex piriforme (PFM), hipotálamo (HY), amígdala (AY), hipocampo (HC), córtex cingulado posterior (GNV), córtex entorhinal (ERC), cérebro médio (MB) com tálamo e resto do córtex cerebral (ROC) (Tabela 1). Regiões específicas serão discutidas por ordem de isolamento, trabalhando com um único hemisfério.

1. Tome muito cuidado para remover o cérebro do calvarium, pois os marcos podem ser destruídos no caso de haver lacerações. Nesta etapa, realizará todas as dissecções utilizando proteção facial, especificamente, uma viseira de joalheiros 7x, e a iluminação será fornecida por lâmpadas cirúrgicas posicionadas sobre cada um dos ombros do dissetor. Grande parte da dissecção será realizada usando fórceps pequenos e curvos (ou seja, fórceps graefe).
2. Coloque o cérebro em um bloco de aço inoxidável (Figura 4i e Figura 4ii). Mantenha o bloco frio ao redor dele com gelo e uma solução salina gelada. Moist o tecido periodicamente com solução salina gelada para preservar as estruturas.
3. Posicione o cérebro de tal forma que os cortices cerebrais estão voltados para cima. Utilizando pequenas fórceps curvas, reflita suavemente o CB expondo os peduncles cerebelar superior, médio e inferior e remova o CB (Figura 4iii e Figura 4iv).
4. Faça um corte midsagittal começando do dorso e entre o OB e os hemisférios cerebrais (Figura 4v) e certifique-se de não estender mais longe do que a comissura anterior. Neste ponto, os vermis podem ser facilmente separados das porções laterais e HB será obtido por um corte coronal na margem anterior dos pons.
5. Separe a medula por um corte coronal na margem posterior dos pons.
   NOTA: Neste ponto, o diencephalon, a parte posterior do cérebro contendo o epitálamo, tálamo, hipotálamo e tálamo ventral e o terceiro ventrículo, será virado para cima, e um corte de meados do país será feito a partir do quiasmo óptico rostrally. A dissecção dos hemisférios cerebrais seguida da remoção de OB de um dos hemisférios será nesta etapa (Figura 4v e Figura 4vi).
6. Separe os hemisférios cerebrais (Figura 4v) antes de dissecar ainda mais o diencephalon (Figura 4v). A abordagem dorsal será empregada por dissecção contundente cuidadosa para preservar os marcos médios criticamente salientes. Visualize cada conexão interhemisférica antes de cortá-las, pois isso minimizará a possibilidade de desvio da linha média.
   NOTA: Nesta etapa, um hemisfério cerebral (Hemibrain) pode ser preservado e o segundo hemisfério pode ser usado para dissecção adicional
7. Deslize as lâminas fechadas de um pequeno fórceps curvos, sob o caloso corpus e espalhe suavemente para retrair o neocórtex bilateralmente. O corpus calosum é um amplo grupo de fibras nervosas que une os dois hemisférios que serão dissecados sem rodeios por beliscar com as fórceps, sem perturbar as estruturas de linha média que estão abaixo.
   NOTA: Rostos mesiais dos hemisférios terão múltiplos marcos visíveis, como estruturas mielidas como o gênero do corpo caloso, os fornices e a comissura anterior. Além disso, embora alguns milímetros laterais à linha média, o trato mamilotalâmico e o fasciculus retroflexus também podem ser visíveis.
8. Bissecte as múltiplas estruturas que cruzam a linha média. Isso incluirá o corpus calosum, comissariação anterior, ventral fornix commissure, comissariação posterior, comissariação dorsal fornix, descussação supra mammillary, commissure de colliculus superior, ventral fornix commissure, e fibras talamicas periventriculares.
9. Tome cuidado especial nesta etapa dentro ou perto da linha média que pode ser parcialmente comprometida pelo método de abordagem dorsal. Todas as estruturas de acompanhamento estão em risco se não forem realizadas com cuidado.
10. Remova o OB (cortices olfativos em forma de cunha) e olfatos acessórios seguidos da coleta do MPFC (córtex cingulado área 1, pré-cílimico, infralimíbico, orbital medial e cortices motores secundários [M2]) e FCX por um corte coronal que é feito 1mm anterior ao genu do calosum corpus (Figura 4vii). Divida a seção resultante por um corte parasagittal de 1/3 da distância do medial para a superfície lateral, rendendo MPFC medianamente e restante do FCX lateralmente. O córtex cingulado é o análogo do camundongo do MPFC.
    NOTA: Esta fatia de tecido também conterá uma pequena quantidade do M2 (córtex motor secundário) ¹⁷ e é inevitável.
11. Faça um corte coronal ao nível da comissura anterior levando à visibilidade de pars membro anterior do comissure anterior na seção transversal na face rostral da seção coronal resultante, enquanto a porção transversal será revelada na face caudal da seção Este é um marco confirmatório para o NAC¹⁸. O VS é composto pelo NAC e OT.
    NOTA: Há um membro anterior além do segmento transversal na comissura anterior e é chamado de comissure anterior, pars anterior.
12. Corte horizontalmente horizontalmente através da porção transversal da comissura anterior da linha média sob o chifre anterior do ventrículo lateral, para liberar o núcleo septo dorsalmente e o VS ventrally. Remova a pequena quantidade do córtex da superfície lateral onde o NAC e o OT serão removidos.
13. Separe a porção rostral do ST do córtex sobrelada através de corte curvo de bisturi fora da cápsula externa, tomando cuidado para não incluir tecido estriatal na amostra cortical. Neste ponto, os núcleos septos /SE serão visíveis e podem ser facilmente retirados desta fatia (Figura 4viii).
    NOTA: Os limites anteriores e posteriores do MPF são definidos por planos coronais imaginários que estão em consonância com a comissura anterior e os corpos mammillários, respectivamente. O limite medial é definido pela cápsula externa¹⁸.
14. Na superfície lateral da seção hemi restante do diencephalon, faça um corte horizontal parcial ao longo do sulco rinal estendendo-se caudally, mas apenas até o nível de plano coronal imaginário com os corpos mammillary. Faça um corte coronal parcial, estendendo-se medialmente 1 mm da superfície cortical lateral no plano dos corpos mammillary do HY. Aqui, a incisão para-sagitar no plano do claustrum libertará o FPM (Figura 4ix e Figura 4x).
    NOTA: Na superfície medial da seção hemi remanescente do diencephalon, numerosas características anatômicas serão visíveis, incluindo os corpos mammillários, o fasciculus retroflexus e o estria medullaris. Um padrão semicircular (lado côncavo dorsal) será visível, o que denota a margem entre o tálamo e o HY. O HY será facilmente identificado na vista da seção midsagittal por meio do quiasma óptico anteroventrally e anterior comissure anterodorsalmente e os corpos mammillários, juntamente com o fasciculus retroflexus posteriormente. Estes últimos marcos foram bem exibidos no atlas¹⁷ , bem como no contexto do cérebro do rato albino¹⁹.
15. Faça um corte coronal parcial posterior aos corpos mammillários, estendendo-se apenas tão lateralmente quanto o sulco hipotalâmico. Neste ponto um corte parasagittal ao longo do comprimento do sulco hipotalâmico agora libera o HY .
16. Implica a eversão do ventrículo lateral para revelar conexões intra-límbicas adicionais e os demais componentes do sistema límbico. Visualizando a face medial da seção hemi remanescente do diencephalon, fórceps curvos serão a melhor opção, pois permitem que o técnico manipule em torno de outras seções delicadas da área circundante usadas para cortar o fornix e é inserido no ventrículo lateral e suavemente expandido, usando dissecção sem cortes para abrir o ventrículo e girar o HC 90° da vertical ao plano horizontal. Pode ser necessário usar a lâmina #11 para separar a artéria coroidal/plexo coroide, pois a ponta pontiaguda pode ajudar com cortes precisos.
17. Gire o GNV 90° (mas na direção oposta do HC) para estar no plano horizontal. Com fórceps, gire suavemente o HC mais 180° para fora e lateralmente, o que tornará visível a superfície interna do ERC e voltada para cima.
18. Uma radiação semelhante a ventilador de fibras mielidas decorrentes do ERC será vista convergindo para formar o feixe angular, incluindo o caminho perfurante e sua ligação com o HC. Gire o tálamo e o MB 180° dorsalmente para revelar o AY.
19. Se necessário, levante o trato óptico para revelar a fixação do terminal de estria, pois conterá faixas de fibras que correm ao longo da margem lateral da superfície ventricular do tálamo para o AY e deixará os contornos do AY claros.
    NOTA: O HC e o fornix serão claramente visíveis em sua totalidade, aninhados no ventrículo lateral e, podem ser facilmente retirados. O ventrículo lateral será forrado com pia mater e origens semelhantes aos ventiladores do caminho perforante através do aspecto subpial muito transparente do ERC ^{será visível 20}.
20. A superfície externa do ERC medial terá uma camada proeminente visível de grandes células piramiptárias. Além disso, uma densa convergência de fibras de manchas de Golgi será uma característica marcante no ERC medial. Neste procedimento de dissecção, após o deslocamento do ventrículo lateral, essas fibras serão facilmente visíveis na superfície medial através da pia mater, que reveste as superfícies internas dos ventrículos, formando uma estrutura muito proeminente como um ventilador.
21. Observe que as fibras estão se acumulando subpially, descendo e deixando o ERC ventral, estendendo-se posteriormente e, em seguida, subindo verticalmente para perfurar o HC. Esta estrutura semelhante ao ventilador no ERC será usada para definir as margens para fins de dissecção. Identificar e remover na ordem das estruturas AY, ERC, GNV e HC .
    NOTA: Definir um bom marco para a dissecção AY será uma chave para o próximo passo e a junção na margem posterior onde stria terminalis atende o AY será um bom ponto.
22. Neste ponto, as estruturas restantes incluem o tálamo e o MB. Confirme a identificação do tálamo pela visualização da estria medullaris em sua superfície dorsal estendendo-se no plano rostrocaudal midline. Separe o tálamo completamente do cérebro médio por um corte coronal caudal para a habenula e rostral para o colegiado superior. O ROC está salvo nesta etapa.
23. Neste ponto, a coleta completa de todas as regiões cerebrais e, imediatamente (como cada uma é obtida) armazena as amostras flash congelado até um processamento adicional.

Resultados

Nossa compreensão da complexa estrutura e função cerebral está evoluindo rapidamente e melhorando. O cérebro contém várias regiões distintas e construir um mapa molecular pode nos ajudar a entender melhor como o cérebro funciona. Neste artigo de método, discutimos a dissecação do cérebro do camundongo em múltiplas regiões distintas (Tabela 1). Neste protocolo, as estruturas são identificadas com base nos marcos críticos e são alcançadas mantendo o tecido úmido com solução salina, ma...

Discussão

O cérebro mamífero é um órgão complexo composto por uma matriz de células morfologicamente distintas e funcionalmente únicas com diversas assinaturas moleculares e múltiplas regiões que realizam funções especializadas e discretas. O procedimento de dissecção aqui relatado pode ter múltiplas metas dependendo dos requisitos do laboratório. Em nosso laboratório avaliamos a transcrição em várias regiões cerebrais coletadas de camundongos expostos ao TEPT como o estresse¹⁶ . Gostar?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Removal
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6762	5.5" straight sharp/sharp
Deaver scissors	Roboz Surgical Store	RS-6763	5.5" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6703	4.75" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6702	4.75" straight sharp/sharp
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved Sharp/Sharp
Micro spatula, radius and tapered flat ends			stainless steel mirror finish
Operating scissors 6.5"	Roboz Surgical Store	RS-6846	curved sharp/sharp
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160	4.5” 1X2 teeth 2mm tip width
Rongeur (optional)	Roboz Surgical Store	RS-8321 many styles to choose	Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades	Roboz Surgical Store	RS-9801-11	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Super fine forceps Inox	Roboz Surgical Store	RS-4955	tip size 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A magnification visor	Penn Tool Col	40-178-6	2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier
Dissection cold plate	Cellpath.com	JRI-0100-00A	Iceberg cold plate & base
Graefe forceps, full curve extra delicate	Roboz Surgical Store	RS-5138	0.5 mm Tip 4” (10 cm) long
Light operating scissors	Roboz Surgical Store	RS-6753	5" curved sharp/sharp
Scalpel handle	Roboz Surgical Store	RS-9843 (repeated above)	Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades (especially #11)	Roboz Surgical Store	RS-9801-11 (repeated above)	Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Spatula	Amazon	MS-SQRD9-4	Double Ended Spatula Square AND Round End
Tissue forceps	Roboz Surgical Store	RS-8160 (repeated above)	4.5” 1X2 teeth