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要約

本稿では、雌と雄の両方を含むいくつかの属の蚊における成功した低ノイズのエレクトロアンテノグラムのための段階的なプロトコルについて詳しく説明します。

要約

雌の蚊は地球上で最も致命的な動物であり、血粉を獲得するときに感染する病原体のために、毎年100万人以上の命を奪っています。餌を与える宿主を見つけるために、蚊は視覚的、機械的、熱的、嗅覚を含む幅広い感覚的手がかりに依存しています。この研究では、研究者が蚊が濃度依存的に個々の化学物質と化学物質のブレンドを検出できるかどうかを評価できるようにする技術であるエレクトロアンテノグラフィー(EAG)について詳しく説明しています。ガスクロマトグラフィー(GC-EAG)と組み合わせると、この技術はアンテナを完全なヘッドスペース/複雑な混合物にさらすことを可能にし、目的のサンプルに存在するどの化学物質を蚊が検出できるかを決定することができます。これは、宿主の体臭だけでなく、植物の花束やその他の生態学的に関連する匂い(産卵場所の匂い物質など)にも適用できます。ここでは、長時間の準備応答時間を可能にし、 ネッタイシマカ、 アカイエカ、 ハマダラカ、ト キソリンカイト 蚊など、複数の属の雌と雄の両方の蚊に適用できるプロトコルについて説明しました。嗅覚は蚊と宿主の相互作用および蚊の生物学全般において主要な役割を果たすので、EAGおよびGC-EAGは、新しい疾患ベクター制御戦略(例えば、餌)の開発に関心のある化合物を明らかにすることができる。行動アッセイで補完して、各化学物質の価数(例えば、誘引剤、忌避剤)を決定することができる。

概要

蚊は地球上で最も致命的な生物であり、年間100万人以上の命を奪い、世界人口の半分以上を噛みながら、蚊が感染する病原体にさらされるリスクにさらしています1。これらの昆虫は、広範囲の手がかり(すなわち、熱的、視覚的、機械的、嗅覚的、聴覚的)に依存して、餌となる宿主(植物と動物の両方)を見つけ、交尾と産卵のために、そして幼虫と成虫の両方の段階で捕食者を避けます2,3。これらの感覚の中で、嗅覚は、特に匂い分子の中距離から長距離の検出において、上記の挙動において重要な役割を果たす2,3。宿主または産卵部位によって放出される匂いは、蚊の触側、足根、および触角2,3に位置する様々な特異的嗅覚受容体(例えば、GR、OR、IR)によって検出される。

嗅覚は宿主探索(植物および動物)、交尾および産卵行動の重要な要素であるため、蚊駆除のための新しいツールを開発するための研究の理想的なターゲットを構成します4。忌避剤(DEET、IR3535、ピカリジンなど)と餌(BGセンチネルヒトルアーなど)の研究は非常に多作ですが5、蚊の防除における現在の課題(殺虫剤耐性、侵入種など)のために、蚊の生物学に基づいた新しい効率的な防除方法の開発が不可欠です。

多くの技術(例えば、嗅覚計、着陸アッセイ、電気生理学)は、蚊の化合物または化合物の混合物の生物活性を評価するために使用されてきた。その中で、エレクトロアンテノグラム(またはエレクトロアンテノグラム(EAG))を使用して、匂い物質が蚊のアンテナによって検出されるかどうかを決定できます。この技術は当初シュナイダー6によって開発され、それ以来、蛾7,8,9、マルハナバチ10,11、ミツバチ12,13、ショウジョウバエ14,15など、さまざまな昆虫属で使用されてきました。エレクトロアンテノグラフィはまた、蚊16、17、18、19、20、21、22、23、24、25における単一または複数のアンテナを含む様々なプロトコルを用いて採用されている。

蚊は比較的小さくて繊細な昆虫で、アンテナはかなり細いです。蛾やマルハナバチなどの大きな昆虫にEAGを実行することは、サイズが大きく、アンテナが厚いため比較的簡単ですが、蚊でEAGを実施するのは難しい場合があります。特に、良好な信号対雑音比の維持と応答性の高い準備は、データの再現性と信頼性の2つの主要な要件です。

ここで提案されている低ノイズEAGのステップバイステップガイドは、これらの制限に対する解決策を直接提供し、このプロトコルを ネッタイシマカ、 ハマダラカ、 アカイエカ、ト キソリンカイトなどのさまざまな属のいくつかの蚊種に適用できるようにし、女性と男性の両方の技術について説明します。エレクトロアンテノグラフィーは、生物活性化合物をスクリーニングして測定するための迅速で信頼性の高い方法を提供し、行動アッセイで原子価が決定された後、餌の開発に活用できます。

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プロトコル

1.生理食塩水の準備

  1. 事前に生理食塩水を準備し、冷蔵庫に保管してください。
  2. バイエンバッハとマシア26 に従って、溶液を準備します。
    注:生理食塩水レシピ(mM):150.0 NaCl、25.0 HEPES、5.0グルコース、3.4 KCl、1.8 NaHCO3、1.7 CaCl 2、および1.0 MgCl2。pHは1 M NaOHで7.1に調整されます。棚の貯蔵量を増やすために、この時点でブドウ糖またはスクロースを調製物に加えないでください。EAGを実行する直前に、必要な量を生理食塩水に追加します(実験あたり約50 mL)。

2.臭気の準備と保管

  1. 匂い物質混合物または単一化合物希釈液を1.5 mLの琥珀色のバイアルで事前に調製し、化合物の分解を防ぐために-20°Cで保存します。
    注意: 濃度は、実施するテストによって異なります。0.1%または1%は、化合物を検出できるかどうかを判断するために一般的に使用されます。用量反応曲線については、特定の化学物質の連続希釈を準備し、その濃度を最低濃度から最高濃度までテストします。
  2. 試験した化学物質の溶解度に応じて、水、エタノール、ヘキサン、パラフィン油、または鉱油で希釈液を調製します。
  3. 実験のために溶媒コントロール(溶媒のみを含むバイアル)を必ず準備してください。
  4. 実験開始の30分前に冷凍庫から匂い物質を取り除き、解凍します。使用前に各バイアルをボルテックスし、薬液と溶媒とをよく混合する。
  5. 10 μLの溶液を、ラベル付きガラスシリンジまたはパスツールピペット内に装填したろ紙(0.5 cm x 2 cm)にピペットで貼り付けます。
  6. 汚染を防ぐために、各化合物または混合物を特定のパスツールピペットまたはシリンジに入れます。
    注意: 実験を開始する10分前に負荷をかけると、臭いがシリンジ内で拡散する可能性がありますが、劣化を防ぐために長くは拡散しません。この時点でパスツールピペットまたはシリンジをキャップしたままにして、実験を開始する前に化学物質を十分に拡散させます。
  7. EAGを実行するたびに、ろ紙を廃棄して新しいものと交換し、紙が浸すぎて針が詰まる危険がないようにします。定期的に(10回ごとに)針を交換してください。

3.蚊の分離

  1. 実験当日に蚊を隔離する。
  2. 実験当日に少なくとも6日齢の蚊を使用して、宿主関連の匂い物質に対する反応を高めるために雌が交尾する可能性を高めます。
    注:プロジェクトに応じて、テスト時に蚊の年齢を調整します。生理学的状態を確認して調和させます(例:血液で育てられた、飢えている、以前に給餌されたことがないなど)。
  3. 蚊を最大12時間飢えさせ(つまり、砂糖にアクセスできない)、モチベーションと感度を高めます。
  4. 蚊帳が飛ぶのを止めるまで冷蔵庫(4°C)に入れて、個体を鉗子付きのシングルカップに繊細に移すことができるようにします。
    注:耐寒性が高い種は、CO2 フライパッドを使用して倒すことができます。蚊のEAG製剤の応答性を低下させる乾燥を防ぐために、蚊が長時間その上にとどまらないようにしてください。
  5. EAGを実行する前に、単一の蚊が入ったカップを室温で保管し、日中使用しない可能性のある蚊は廃棄してください。

4.電極ホルダーとキャピラリーの準備

  1. キャピラリーの引っ張り、準備、保管
    1. フィラメント付きのホウケイ酸キャピラリーを使用します(内径:0.78 mm、外径:1 mm)。機器に応じてそれらを引っ張る27.
      注意: 引っ張った毛細血管をペトリ皿に保管します。ペトリ皿をワックスまたは無香料のモデリング粘土の上に置き、それらが動いたり壊れたりしないようにします。
    2. EAG実験を実行する前に、顕微鏡下で2つの毛細血管の先端を一対の鉗子で静かに壊します。
      注意: 首(大きな毛細管)またはアンテナの先端(小さい毛細管)のいずれかに合うように、一方が他方よりわずかに大きいことを確認してください。毛細管壁に亀裂がなく、切り込みがきれいであることを確認してください。これには忍耐と練習が必要です。
    3. それでも無傷の場合は、実験終了後に脱イオン(DI)水ですすいだ後、これらの毛細血管を再利用してください。先端にクリーニングワイプをそっと当てて、余分な水分を取り除きます。保管ペトリ皿に戻します。先端が曲がっている場合は、毛細管を廃棄してください。
  2. 電極ホルダーとキャピラリー取り付け
    1. 異なる色のラボテープを使用して、2つの電極ホルダーに「記録」および「参照」というラベルを付けます。これは、蚊の頭と電極の取り付けをガイドするのに役立ちます。
    2. 電極ホルダーの内部が透明で、ホウケイ酸の破片がないことを確認してください。
    3. 塩素化:電極ホルダーの銀線を純粋な漂白剤に約5分間浸します。ワイヤーは光沢のあるライトグレーからマットなダークグレーに変わります。
    4. ゴム栓を緩め、20Gの針を使用してキャピラリーの内側を10%生理食塩水で満たします。
    5. シリンジを使用してホウケイ酸キャピラリーを生理食塩水で満たします。電極ホルダーにも引っ張られたキャピラリーにも気泡が存在しないことを確認してください。
      注意: 毛細血管に気泡が発生する可能性を減らすために、針をそっと引き出しながら毛細血管内の生理食塩水を押し続け、フィラメント付きの毛細血管を使用します。キャピラリーに1:3電極ゲルと生理食塩水からなる溶液を装填することができる。これは生理食塩水の蒸発を防ぐのに役立ち、実験者がさまざまなステップを完了するのにより多くの時間を必要とするため、EAGを学習および練習するときに特に役立ちます。
    6. 浸した後、銀線をDI水ですすぎ、2つの毛細管に挿入します。ワイヤーの先端がキャピラリーの先端から1mm未満であることを確認してください。キャピラリーが壊れずに電極ホルダー内のゴムリングを通過することを確認してください。ゴム栓をそっと締めます。気泡がないことを確認します。
    7. 参照電極ホルダー(ネック)の開口部が広く、記録電極ホルダー(アンテナ)の開口部が小さいキャピラリーを使用します。
    8. ヘッドを取り付ける準備ができるまで先端が乾かないように、取り付けられた2つの電極ホルダーをウェットクリーニングワイプの上に置いておきます。

5. EAGリグの準備(図1)

  1. エアテーブルが上がっていること、航空会社に詰まりがないことを確認してください。実験の途中で交換しないように、医療用空気のタンクがまだいっぱいであることを確認してください。加湿器に気泡があることを確認してください。
  2. エアおよびパルスデリバリーシステム
    1. 医療用エアガスタンクの電源を入れます。
    2. 2つの流量計のレベルを確認してください。
      注:実験全体を通して準備を入浴する主な気流を制御する流量計は140mL / minである必要があり、臭気パルスに関連する他の流量計は15mL / minを読み取る必要があります。
  3. GC-EADを実行する場合は、マシン、ガスタンクの電源を入れ、ファイル/メソッドを作成/ロードします。
  4. コンピューター、ソフトウェアアプリケーション、バルブ電源の電源を入れ、ソフトウェアアプリケーションが機能するようにインターネット接続を確認します。
    1. ソフトウェアアプリケーション:パルスを配信するための短いスクリプトを作成できます。
    2. EAGソフトウェア:任意の電気生理学ソフトウェアを使用します。
    3. ソフトウェアにパラメータ(アンプ、録音時間、パルスの持続時間など)を実装します。
  5. 制御パルスを配信して、パルスを配信するバルブが機能していることを確認します。
  6. 電源を5.2Vに設定します。 アンプのパラメータを確認します。
    注:ここに示すデータに使用されるパラメータは次のとおりです:0.1Hzの低カットオフフィルター。500Hzの高カットオフフィルター。ゲインは100倍です。

6.蚊の頭の準備と取り付け(図2)

  1. アルミ板を氷の上に置き、その上にウェットクリーニングワイプを置きます。
  2. 隅に電極ゲルを少し入れます。
  3. 蚊のカップを氷の上に置き、蚊を数分間、または飛行が止まるまで冷まします。
    注:一部の種は耐寒性があり、下降するにはCO2 フライパッド上で迅速な麻酔が必要になる場合があります。蚊がどちらかにとどまるのは少ないほど良いです。
  4. 蚊を背中に置き、各アンテナの先端(最後のセグメントのごく一部)をマイクロハサミでクリップします。
  5. 鉗子を使用して、電極ゲルのドロップの横にある蚊をドラッグし、各アンテナの先端をゲルにそっと浸します。電極ゲルの最後のセグメント以上のものを浸すことは避けてください。
  6. 鉗子を使用して、蚊のアンテナを隣り合わせに保ちながら引き出します。それらをゲルから一緒に出させてください。アンテナがクリーニングワイプの表面に触れないようにしないと、アンテナが分離する可能性があることを確認してください。
  7. 蚊を横に置き、マイクロハサミまたはかみそりの刃を使って頭を切り刻みます。
    注意: ヘッドが切り刻まれたら、すぐに次のステップに進み、EAGリグに進んで録音を開始します。準備は約30分間反応し続ける必要があります。
  8. 参照電極を取り、ゲルの先端をそっと深くします。首のティッシュと接触させ、頭をそれに貼り付けます。
  9. 電極ホルダーをEAG顕微鏡の下に移動し、顕微鏡を通して見て、ヘッド(つまり、参照)電極をマイクロマニピュレーターに配置します。アンテナが中央にあることを確認します。
  10. 記録電極をつかみ、アンテナ先端の前に置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、先端にできるだけ近づけて位置合わせします。顕微鏡を使用して、記録電極の先端をアンテナに向かって動かします。
  11. 両方の電極ホルダーを接続します amp挿入後にチップが動かないように、チップを挿入する前に。
  12. アンテナチップを記録電極に挿入します。生理食塩水と電極ゲルに接触するだけで、毛細管を通して透明に見えることを確認してください。アンテナは「吸引効果」によって入ります。
  13. 必要に応じて、顕微鏡下で鉗子で頭と先端の位置を調整します。
  14. エアラインチューブを蚊の頭の準備の近くに置きます(距離:1 cm)。
    注意: 頭が落ちた場合は、解剖ステーションに戻って頭を取り付け直すか、頭を紛失した場合、または頭が切断されてから5分以上経過している場合は、新しい頭を準備します。キャピラリーとネック/アンテナの間の良好な接続は、低ノイズと信頼性の高い録音に不可欠です。理想的には、アンテナの先端は、一度挿入された記録電極のワイヤから1mm未満になります。
  15. 光源を使用する場合は、オフにします。
  16. 蚊帳の準備(距離:20 cm)の近くに真空ラインを配置し、メインエアラインに合わせます。
    注:真空は、刺激後のヘッドの準備を取り巻く化学物質を除去するのに役立ち、パルスが適用された後にEAG応答につながる可能性があります。

7. 録音

  1. アンテナの先端を挿入した後、電源を入れます ampリファイアとノイズリデューサー。ベースライン信号を観察し、ノイズが多くないことを確認します。
    注意: 電気信号に大きな振動が存在するかどうかを観察してください。信号がきれいになるまで、必要に応じてヘッドとアンテナの先端の位置を調整します。ワニ口クリップを使用して、ファラデーケージまたはエアテーブルにノイズをもたらすものをすべて接地します。振幅が0.01mV未満のベースライン信号は、微小なEAG応答を検出して識別するのに理想的です。
  2. 騒音レベルが満たされたら、最初の臭気シリンジを挿入してエアラインの穴にテストします。
  3. ファラデーケージを閉じます。騒音を減らすために、準備の前にとどまらないでください。
  4. EAGソフトウェアの記録をクリックします。
  5. ソフトウェアアプリケーションを使用してパルスを配信します。
    注:パルスの数と持続時間は、実験によって異なります。ここでは、匂い物質あたり単一の1秒パルスが使用されています。匂い物質は45秒分離された。
  6. ラボノートの蚊触角の応答に注意してください。
    注意: 蚊のアンテナによって匂い物質が検出されると、信号の明らかな偏向が観察されます( 図3Aを参照)。
  7. 次の臭いまたは濃度に進みます。用量反応曲線が実行されない限り、匂い物質の提示をランダム化することを忘れないでください。.
    注:実験では、ネガティブコントロールとポジティブコントロールを使用する必要があります。これにより、観察された応答が実際に嗅覚応答であり、機械的または電気的ノイズによるものではないことが保証されます。
  8. 記録の最後に、ポジティブコントロールを適用して、アンテナがまだ応答していることを確認します。
    注:これまでにテストされたすべての蚊種がこの化合物に反応したため、0.1%または1%のベンズアルデヒドを使用してください。
  9. 次の蚊の準備を進めます。

8.クリーニング

  1. 電源を切ります ampリファイア、ノイズリデューサー、航空会社、およびコンピューター。
  2. 匂い物質を冷凍庫に戻します。
  3. ガラスシリンジからろ紙を取り除き、壁に残留物が見える場合は100%エタノールで洗浄します。クリーニングワイプで一晩乾かします。
  4. 電極ホルダーをDI水で洗浄して、塩の痕跡を取り除きます。クリーニングワイプにそっと当てて乾かします。
  5. 蚊の残りを冷凍庫に入れ、24時間後に処分します。
    注:感染した蚊を扱う場合は、施設の安全要件に従ってください。

9. データ分析

  1. EAGの応答を手動または自動で測定します。
    注:EAG振幅(-mV)はここで測定されます。各化合物に複数のパルスが適用されている場合の平均。使用するソフトウェアに応じて、EAGを自動的に検出および測定できます。ただし、各応答を個別に検査して応答の形状を確認し、キャリーオーバー、応答の遅延などを評価することが不可欠です。理想的なEAG応答は脈拍と一致し、明確なたわみを示し、蚊の準備間で再現可能です(図3)。
  2. 生データを提示して、変動を最小限に抑え、ノイズ信号が少なく、応答が明確であることを示します(図3B)。
    注:データは正規化することもできます(Zスコアなど)。陰性管理値(例えば、鉱油)(すなわち、ベースライン)は、応答から差し引くことができ、そうでない場合は、図に提示する必要があります。ポジティブコントロールも提示する必要があります。
  3. 任意の統計ソフトウェア28を用いて統計分析を行う。

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結果

エレクトロアンテノグラフィは、化学物質または化学物質のブレンドが昆虫アンテナによって検出されたかどうかを判断するための強力なツールです。また、濃度の漸進的な増加を使用して、所与の化学物質の検出閾値を決定するためにも使用できます(すなわち、用量曲線応答、 図4B)。さらに、宿主関連臭気29に対する応答に対する忌避剤の効果を試...

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ディスカッション

嗅覚を介した行動は、生理学的(年齢、時刻など)や環境(温度、相対湿度など)など、多くの要因の影響を受けます30。したがって、EAGを実施する際には、同じ生理学的状態にある昆虫(すなわち、年齢、飢餓、交尾のモニタリング)31 を使用し、乾燥を避けるために準備の周囲に暖かく湿気の多い環境を維持することが不可欠です。25°C前後の温度が理想的で、...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

有益な議論をしてくれたクレマン・ヴィノーガー博士とジェフリー・リッフェル博士に感謝します。以下の試薬は、BEI Resources、NIAID、NIHを通じて入手しました: Anopheles stephensi、Strain STE2、MRA-128、Mark Q. Benedictが寄稿。 ネッタイシマカ、ストレインロック、MRA-734、デビッドW.セバーソンによる寄稿。 アカイエカ、JHB株、卵、NR-43025。著者は、 アカイエカ と ハマ ダラカの蚊の卵を提供してくれたジェイク・トゥ博士、ニシャ・ダガル博士、ジェームズ・ウェガー博士、ジェフリー・マラノに感謝します。 ネッタイシマカ と トキソリンチテス・ルチルス・セプテントリオナリス は、著者がニューリバーバレー地域(米国バージニア州)で収集した野蚊に由来します。この研究は、生化学部門とフラリン生命科学研究所の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Air table Clean BenchTMChttps://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriessNoise reducer
Analog-to-digital boardNational InstrumentsBNC-2090A
Benchtop Flowbuddy CompleteGenesee Scientific59-122BCTo anesthesize mosquitoes
Borosillicate glass capillarySutter InstrumentB100-78-10To make the recording and references capillaries
ChemicalsSigma AldrichBenzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1LChemicals used for the experiments presented here
CO2Airgas or PraxairN/ATo anesthesize mosquitoes
Cold Light SourceVolpiNCL-150
Disposable syringesBD1 mL (309628)  / 3 mL (309657)
Electrode cablesWorld Precision Instruments5371
Electrode gel salt freeParkerlabs12-08-Spectra-360
Faraday cageTMChttps://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycagesNoise reducer
FlowmetersBel-art65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)One of each
GCMS vials and capsThermo-fisher scientific2-SVWKA8-CPKTo prepare odorant dilutions
Glass syringes (Fortuna)Sigma AldrichZ314307For odor delivery to the EAG prep
HumbugQuest Scientifichttp://www.quest-sci.com/Noise reducer
2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With WireA-M Systems675748Electrode holder
Magnetic basesKanetecMB-FXx 2
MATLAB + ToolboxesMathworkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlFor delivering the pulses
Medical airAirgas or PraxairN/AFor main airline
MicroscopeNikkonSMZ-800N
Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact MicromanipulatorNarishigeMHW-3x 2
Microelectrode amplifier with headstageA-M SystemsModel 1800
Mosquito rearing suppliesBioquiphttps://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
NeedlesBD25G (305127) / 21G (305165)
Pasteur pipettesFisher Scientific13-678-6AFor odor delivery to the EAG prep
PTFE Tubing of different diametersMc Master CarrN/ATo connect solenoid valve, flowmeter, airline ect.
30V/5A DC Power SupplyDr. MeterPS-305DM
R version 3.5.1R projecthttps://www.r-project.org/For data analyses
Relay for solenoid valveN/ACustom made
Silver wire 0.01”A-M Systems782500
Solenoid valve (3-way)The Lee CompanyLHDA0533115H
WinEDR softwareStrathclyde Electrophysiology SoftwareWinEDR V3.9.1For EAG recording
Whatman paperCole ParmerUX-06648-03To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette

参考文献

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