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要約

この研究では、同位体標識膜タンパク質サンプルを調製し、最新の固体NMR分光法で高分解能で分析する方法について、堅牢な基本ルーチンについて詳しく説明します。

要約

膜タンパク質は細胞機能に不可欠であり、したがって重要な薬物標的です。固体核磁気共鳴(ssNMR)分光法は、複雑さが増す生体膜におけるそのようなタンパク質の構造とダイナミクスを調査するための独自のアクセスを提供します。ここでは、天然の脂質膜および原子スケールでのタンパク質の構造とダイナミクスを研究するためのツールとして、最新の固体NMR分光法を紹介します。このような分光学的研究は、高感度のssNMR法、すなわち陽子(1H)で検出されるssNMRとDNP(Dynamic Nuclear Polarization)で支えられたssNMRの使用から利益を得ます。細菌の外膜βバレルタンパク質BamAとイオンチャネルKcsAを用いて、同位体標識膜タンパク質を調製し、ssNMRによる構造情報と運動情報を導出する方法を提示します。

概要

生理学的に関連性のある環境における膜タンパク質の構造的および運動的研究は、従来の構造生物学技術に課題を提起しています1。最新の固体核磁気共鳴分光法(ssNMR)法は、膜タンパク質2,3,4,5,6,7の特性評価に独自のアプローチを提供し、膜埋め込みタンパク質ポンプ8、チャネル9,10,11、受容体12,13などの膜タンパク質の研究に長い間使用されてきました、14、15。超高磁場>1,000 MHz、高速マジック角回転周波数>100 kHz、超分極技術16などの技術の進歩により、ssNMRは、リポソームから細胞膜、さらには細胞全体まで、複雑化が進む環境下での膜タンパク質の研究のための強力な方法として確立されました。例えば、DNPはこのような実験のための強力なツールとなっています(参考文献17,18,19,20,21,22,23,24,25を参照)。最近では、1H検出ssNMRは、高いスペクトル分解能と感度で膜タンパク質を研究する可能性を高めています25,26,27,28,29。この研究では、タンパク質の挿入とイオン輸送という重要な機能に関与する2つの細菌膜タンパク質に焦点を当てています。対応するタンパク質、BamA 25,30,31,32,33およびKcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39(またはそのキメラ変異体10,40)をssNMRにより調べた10年以上の方法。

ここでは、細菌由来の膜タンパク質の調製とssNMR特性評価のための代表的なプロトコールを示します。プロトコルのさまざまなステップを 図 1 に示します。まず、BamAの発現、同位体標識、精製、膜再構成について説明する。次に、ssNMRによる膜タンパク質の特性評価の一般的なワークフローを示します。具体的には、高速マジック角回転で 1つのH検出ssNMRを使用した膜タンパク質骨格の割り当て。最後に、ssNMR信号感度を大幅に向上させる動的核分極(DNP)支援実験の基本的なセットアップと取得について詳しく説明します。

プロトコル

1. 均一標識2H, 13C, 15N標識BamA-P4P5の作製

注:このプロトコルでは、非病原性グラム陰性菌を扱う必要がありますが、基本的な生物学的安全手順の遵守、すなわち、安全メガネ、白衣、手袋を着用し、微生物を扱うための施設の標準的な操作手順に従うことが必須です。

  1. 大腸菌BamA-P4P5のpET11aΔssYaeTプラスミドをコードする大腸菌BL 21 Star(DE3)の単一コロニーを使用して、50 μg/Lのアンピシリンを添加した50 mLのLysogenyブロスを接種します。
  2. OD600 が0.6に達するまで、37°C、200rpmで培養物を増殖させます。2,000 x g で10分間遠心します。ペレットを50 mLのM9( 表1を参照)に再懸濁し、最大OD600 が0.1になるようにします。
    注:将来のすべての成長ステップは、特に明記されていない限り、上記の条件で行われます。
  3. OD600 の0.5まで培養を成長させます。2,000 x g で室温で10分間遠心します。ペレットを90%D2Oを含むM9 50 mL(レシピについては 表1 を参照)に再懸濁し、最大OD600 が0.1になるようにします。培養物を30°C、200rpmで一晩培養します。
  4. 培養物を2,000 x g で室温で10分間スピンダウンします。予熱した50 mLの90% D2O M9にペレットを再懸濁し、最大OD600 の0.1まで戻します。OD600 が 1.0 に達するまで成長します。
  5. 培養物を2,000 x g で室温で10分間スピンダウンします。100 mLの100% D2O M9培地に、同位体が富む量の非濃縮グルコースと塩化アンモニウムを調製します。100% D2O M9 中程度で、最大 OD600 0.1 まで再懸濁します。OD600 が 0.7 に達するまで成長します。
  6. 培養物を2,000 x g で室温で10分間スピンダウンします。上清を捨て、ペレットを同位体を含む500 mLの100% D2O M9培地( 表1を参照)に再懸濁し、最大OD600 を0.1にします。
  7. OD600 が0.6〜0.9に達するまで、培養物を成長させます。1 mM のイソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) で誘導します。4時間搾露し、細胞を4,000 x g で室温で15分間回収します。

2. 精製、リフォールディング、BamA-P4P5プロテオリポソーム形成

注意: このセクションのすべての手順は、ドラフト内で実行する必要があります。遠心分離後にチューブを開くときは、有害なエアロゾルを制限するため、特別な注意を払う必要があります。

  1. ペレットを氷の上で解凍します。ペレットを20 mLの冷たい緩衝液1に再懸濁します。バッファについては 、表 2 を参照してください。
  2. 溶液を4,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 ペレットを20mLの冷蒸留H2Oに再懸濁し、懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。
  3. 懸濁液を4,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 10 mLの冷たいバッファー2に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
  4. 混合物にさらに10 mLの冷緩衝液2を添加し、氷上でさらに30分間インキュベートします。0.5%n-ドデシル-B-D-マルトシド(DDM)を添加し、穏やかに渦巻く。
  5. サンプルを13 kHzの氷上で超音波処理し、10秒の長さのオン/オフパルスを悪質に使用するまで加熱します。25,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 20 mLのバッファー3で3回洗浄します。25,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。
  6. ペレットを20 mLのバッファー4に再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートします。10秒の長さのオン/オフパルスがクリアに使用されるまで、13kHzの氷上でサンプルを超音波処理します。
  7. サンプルを25,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 プロテアーゼ阻害剤の添加を省略し、37°Cでインキュベートする手順2.4〜2.6を繰り返します。
  8. ペレットを20 mLの水で洗浄し、バッファー3で2回洗浄します。25,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 懸濁液を1 mLの微量遠心チューブに分注し、卓上型遠心分離機で微量遠心チューブを最大速度で20分間回転させます。封入体の純度は、10% SDS-Pageゲルで評価します( 図2Aを参照)。精製BamA-P4P5を三重(2H、13C、15N)で標識した場合の予想収率は30 mg/Lです。
  9. 200 μL のバッファー 5 と 300 μL の H2O に封入体を可溶化し、6M 塩化グアニジウム (GdnCl) を加えます。マイクロ遠心チューブの容量をH2Oで1 mLに調整し、混合物をボルテックスし、室温で4時間インキュベートします。微量遠心チューブを定期的に(30分ごとに)ボルテックスします。
  10. 100,000 x g で4°Cで1時間遠心します。 ランベルトベールの法則を使用して、タンパク質濃度を280nmで測定します。モル吸光係数は117,120 M-1 cm-1です。濃度が>100 μMの場合は、1x Buffer 5と6 M GdnClで希釈し、Buffer 6でタンパク質を10倍に急速に希釈します。混合物を室温で一晩インキュベートします。
    注:超遠心分離には、超遠心分離グレードの1.5 mLチューブを使用してください。
  11. セミネイティブSDS-Pageゲルを使用してリフォールディング効率を測定します。ステップ 2.10 で採取した 10 μL アリコートを 2 つ取り、各アリコートに 10 μL の Lameili バッファー (バッファー 8) を加えます。1つのサンプルを95°Cで10分間煮沸します。他のアリコートは氷の上に置いておきます。その後、両方のサンプルを10% SDS-Pageゲルで14 mAで分析します。ゲルのスタッキング部分とランニング部分には、還元剤とSDSが不足しています。タンパク質染色は、Coomassie色素を使用して行われます。予想される結果を 図 2B に示します。
  12. サンプルを4,000 x g で4°Cで20分間スピンダウンします。 30 kDa遠心フィルターを使用して、サンプルを8 mLの作業量に濃縮します。サンプルを4,000 x g で4°Cで20分間遠心します。 280nmでのタンパク質吸光度を測定します。ステップ 2.10 と同様に、タンパク質濃度を決定します。
  13. 脂質とタンパク質の比率が10:1(LPR-mol/mol)の場合に必要な脂質の量を計算します。クロロホルムストックから、ステップ2.12で計算した必要量の脂質を100 mLの丸底フラスコ(RBF)に加えます。窒素の穏やかな流れの下でRBFからクロロホルムを排出します。RBFを高真空に3時間置きます。脂質フィルムを1 mLのバッファー7で水和します。RBFを37°Cで10分間インキュベートします。
  14. タンパク質混合物(ステップ2.12から)をRBFに加えます。
  15. タンパク質/脂質混合物(ステップ2.14)をRBFの最終容量50mLまで希釈します。DMSOに溶解した1xプロテアーゼ阻害剤を添加したバッファー7を使用し、37°Cで30分間インキュベートします。
  16. 100容量のバッファー7に対して2週間透析します(12〜14 kDaの分子量カットオフ透析チューブを使用)。最初の24時間は、8時間ごとに新鮮なバッファー7を添加して室温で透析を行います。その後、1日1回バッファーを交換し、4°Cで透析を行います。

3. ssNMRローターの充填

  1. ステップ2.16の後、10,000 x g 、4°Cで30〜60分間遠心分離し、ペレットが形成されます。ピペットで上清を取り除きます。
    注:以下で説明する手法は、3.2 mmローター用に最適化されていますが、ほぼすべてのローター直径に適用できます。
  2. サンプルをローターにピペットで入れ、テーブル遠心分離機でサンプルを静かに回転させます。
    注:サンプルの一貫性に応じて、高密度化ツールを使用してサンプルを圧縮するか、ピペットの代わりにスパチュラを使用してサンプルをローターに入れることができます。
  3. ローターが正しい高さまで充填されるまでこのプロセスを2〜3回繰り返し、高密度化ツールのマーカー線で示されているように、キャップに十分なスペースが残っているかどうかを確認します。キャップ位置決めツールを使用して、平らな面でローターを閉じます。ローターの下端の半分に印を付けます。
    注:新世代のssNMRローターには、ローターの回転周波数を光学的に検出するための耐久性のあるレーザーマークが下端に付いています。それ以外の場合は、シャーピーペンの使用をお勧めします。MAS検出器はシャーピーインク用に特別に最適化されているためです。
  4. 虫眼鏡を使用して、キャップが適切に配置されているかどうかを確認します。

4. 2D 13C- 13C ssNMR分光法による試料評価

  1. MASユニットの自動回転ルーチンを使用して、ローターを磁石に挿入し、サンプルを10〜20kHzMASの目的のMAS周波数まで回転させ、サンプルを270Kの設定温度に冷却します。 1Hチャンネルと 13Cチャンネルをチューニングして一致させます。
    注:MAS周波数の選択については、スペクトルCα領域とカルボニル炭素領域との間の化学シフト距離を誤って回転周波数に一致させることを避けること、すなわち、一次回転共振条件41を避けること。
  2. プロトンチャネルのRFパワーを25〜80kHzに変化させることにより、 1 H-13C交差偏波42 (CP)実験を最適化します。典型的なパラメータは、 13Cで45 kHzのRF電源、取得中の80〜100 kHzの異種核 1Hデカップリング43 、1.8〜2.0秒のリサイクル遅延、および64スキャンです。
    1. CP接触時間を最適化して、脂肪族カーボンの信号感度を最大化します。
    2. 13C-CP実験では、開始パルスに4を掛けて(つまり、360°パルスを最適化することで)、1H 90°のパルス長を決定し、信号が消えるまで長さを変化させます。CP転送の直後に矩形パルスを含め、13C 90°のパルス長を同様に最適化します。
  3. 磁化移動時間を30ミリ秒のパリスなどの2D 13 C-13Cプロトン駆動スピン拡散(PDSD)タイプの実験で実行し、残留内部の相関を検出し、サンプルの品質を測定します。パワーレベル、接触時間、および90°のパルス長を、以前に最適化した 13C-CP実験から転送します。間接寸法では4〜6ミリ秒の取得時間を使用します。二乗サインベル関数(QSIN)でスペクトルを処理し、感度の低いサンプルの場合は、両方の次元で指数関数的な線の広がりを処理します。
  4. 孤立したクロスピークのスライスを抽出し、半分の高さでの線幅を決定します。線幅が~0.3-1.0 13C ppmの場合は、ssNMRの特性評価に最適な整然としたサンプルを示し、1.0 13C ppmを超える線幅は、ssNMRの特性評価を損なう可能性のある立体構造の不均一性を示しています。 図3A に示すBamAの2D CC PARISスペクトルは、高品質のスペクトルを提供する整然としたタンパク質の一例です。

5. 1H検出3D ssNMR分光法によるバックボーンアサイン

  1. 2D NHスペクトルフィンガープリントの取得
    1. 上記のように、サンプルを1.3mmローターに充填します。ローターを磁石に挿入し、サンプルを10-20 kHz MASに回転させ、ssNMRプローブヘッドの仕様に応じて、サンプルを240-250 K設定温度以下に冷却します。MASユニットインターフェースを使用して、MAS周波数を5kHz〜60kHzMASのステップで徐々に上げます。
    2. 13C-および15N CP実験におけるCP振幅、接触時間、および90°パルス長を最適化します。異種核チャネルでは約30〜50kHzまたは70〜100kHzの振幅を使用し、1Hチャネルの振幅を80〜180kHzから変化させます。0.7〜1.2秒のリサイクル遅延と、15kHzの低電力異種核プロトンデカップリング44を使用します。また、CP ssNMR実験の設定方法に関する実用的な詳細については、参考文献45を参照してください。
    3. 2D NH実験を取得して、 1H分解能を測定します。 15個のN-CPパラメータを転送し、直接寸法と間接寸法で約15msと25msの取得時間を使用します。最初の 1H から 15N CP への転送では、以前に最適化された接触時間を使用します。 15Nから 1Hへの逆転写では、0.7〜1.0 msの接触時間を使用して、残留磁化の伝達を最小限に抑えます。
    4. サンプルの含水量に応じて、50-250 msの水MISSISSIPPI Suppression46を使用します。両方の次元で 2 乗サイン ベル関数 (QSIN) を使用してスペクトルを処理します。孤立したクロスピークのスライスを抽出し、半分の高さでの線幅を決定します。高品質の2D NHスペクトル25 の例を、 図3Bに膜包埋BamA−P4P5について示している。
  2. バックボーンの割り当て
    1. 1D 15Nから 13Cαへの特異的CP実験47を最適化します。 13CキャリアをCα領域の中央に55 ppm付近に配置します。 13C rf 振幅を 20 kHz とし、 15N 振幅を 35 kHz から 45 kHz まで変化させて、Cα 信号への伝達を最大化し、カルボニル信号への伝達を最小限に抑えます。接触時間を3〜10ミリ秒に1ミリ秒単位で最適化します。
    2. 3D CαNH実験を行います。以前に最適化されたステップからすべてのCP振幅、接触時間、およびパルス長を転送します。間接取得ディメンションと直接取得ディメンションでは、約 10 ms と 30 ms を使用します。3 次元すべてで 2 乗サイン ベル関数 (QSIN) を使用してスペクトルを処理します。
    3. 1D Cα to CO DREAM磁化トランスファー48を最適化します。 15Nから 13Cαへの特異的CPトランスファーから開始します。次に、 13Cチャネルのスピンロックを使用して、CαからCOに磁化を移します。最適な転送のために、 rf 振幅を20〜35kHzで変化させます。転送時間を4〜10ミリ秒に最適化します。
    4. 3D Cα(CO)NH実験を行います。すべてのrf振幅、接触時間、パルス長を、以前に最適化されたステップから転送します。間接取得ディメンションと直接取得ディメンションでは、約 10 ms と 30 ms を使用します。3 次元すべてで 2 乗サイン ベル関数 (QSIN) を使用してスペクトルを処理します。
    5. ステップ1〜4を繰り返して、類似の3D CONHおよびCO(Cα)NH実験に適合させます。この3D実験のカルテットをシーケンシャルなCαおよびCOウォークに使用して、 図428のKcsAの例に示すように、タンパク質骨格を割り当てます。

6. 1H検出ssNMR分光法によるタンパク質ダイナミクス

  1. 15N T1 研究では、以前に最適化された 60 kHz MAS での 2D NH 実験を使用し、最初の 1H から 15N の交差偏波ステップ後の遅延を含めます。一連の2D NH実験を取り込み、0、2、4、8、16秒などのステップを使用して遅延を0秒から16秒まで変化させます。
  2. 分解された信号の正規化された強度を、遅延時間の増加の関数としてプロットします。T1 の減衰を y = exp(-x/T1) に従って 1 つの指数関数に当てはめます (y は減衰時間 x での信号強度です)。
  3. 同様に、15N、T、1rhoの研究では、最初の1Hから15Nの交差偏波ステップ26,49の後、15〜20kHzのrf振幅を持つ15Nチャネルのパルスプログラムにスピンロックパルスを含めます。一連の 2D NH 実験を取り込み、遅延を 0 ミリ秒から 150 ミリ秒まで変化させ、分解された信号の T1rho 減衰を 1 つの指数関数に当てはめます。メンブレン包埋K+チャネルの15N T1rhoデータを図527,28に示します。

7. 動的核分極

注:以下の準備手順は、3.2 mmサファイアMASローターを使用した市販のDNPセットアップの使用に関連しています(図6)20。ジルコニアローターまたはその他のDNP機器を使用すると、DNP信号の増強が低下する可能性があります。

  1. 膜タンパク質ペレット(ステップ3.1から)を重水素化DNPバッファー50 μL(60%(v/v)重水素化d8-およびグリセロール、および15 mMAMUPol 50)に再懸濁します。800 MHzでの実験には、10 mM NATriPOL-351の使用を推奨します。DNP ssNMR実験のさらなる実用的な側面については、参考文献52 も参照してください。
  2. 100,000 x g 、4°Cで10〜20分間遠心分離し、ペレットが形成されます。ピペットで上清を取り除きます。
  3. 遠心アダプターと3.2 mmサファイアMASローターコンポーネントを<4°Cに予冷します。 次の手順 (7.4 から 7.7) は、DNP エージェントの減少を防ぐために、できるだけ早く実行する必要があります。
  4. 3.2 mmサファイアローターを遠心分離アダプターにセットし、ステップ7.2のプロテオリポソーム懸濁液を充填します。
  5. 再懸濁したメンブレンタンパク質サンプルを、200 μLのピペットチップを使用して、ローターの内壁に慎重にピペットで移します。溶液をローターの底までスライドさせます。気泡が形成されていないことを確認してください。
  6. ローター内でサンプルを4,500 x g 、4°Cで5〜10分間スピンダウンします。 余分なDNPジュースを含む上清は、細胞ペレットを乱さずに慎重にピペッティングして取り除きます。ローターがいっぱいになるまで、手順6.4〜6.6を繰り返します。
  7. ローターの上部にあるスペーサースクリューを使用して、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)スペーサーを慎重に配置します。
  8. ローターをキャップ側を下にしてロータープランジャー53 に置き、ローターを液体窒素に突っ込む。ローターとサンプルが凍結するまで、少なくとも30〜60秒待ちます。
  9. 熱交換器ユニットを起動し、DNPプローブを~90Kに冷却します。
  10. MASユニットを 手動モード に設定し、可変温度(VT)を135 l/hに、ベアリングとドライブのガス流量を~6 l/hに設定します。
  11. MASコンソールで イジェクト をエンゲージします。
  12. ステップ7.8で凍結したサンプルを液体N2からサンプルキャッチャーに移し、プローブに入れます(参考文献53も参照)。
  13. 「インサート」をかみ合わせる前に、プローブのベアリング圧力(Bp)を手動で~500 mbarに上げます。これは、ローターを安定して安全に回転させるために推奨されます。
  14. 参考文献53に記載されている手順を使用して、MAS率を目的の値まで増加させます。
  15. 標準的な1次元CP実験(参考文献51,54など)(図7)を使用して、マイクロ波を使用する場合と使用しない場合のDNP強化を確認してください。次に、この記事のセクション3で説明した2D CC実験などを進めます。

結果

図2は、介在物体の純度(パネルA)と介在物体のリフォールディング(パネルB3)の代表的なゲルを示しています。 図2 は、 13 C,15N標識BamA-P4P5の精製が成功したことを確認しています。

図3Aは、整然とした膜タンパク質の典型的な2D 13C-13Cスペクトルを示し、

ディスカッション

膜タンパク質は、原核生物と真核生物の両方における重要な細胞機能の調節において重要なプレーヤーです。したがって、原子レベルの分解能でそれらの作用メカニズムを理解することは非常に重要です。既存の構造生物学技術は、膜タンパク質の科学的理解をかなり前進させてきましたが、膜のないin vitroシステムから収集された実験データに大きく依存してきま?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、プロジェクト番号 723.014.003、711.018.001、700.26.121、700.10.443、718.015.00 の研究プログラム ECHO、TOP、TOP-PUNT、VICI、VIDI の一部であり、オランダ研究評議会 (NWO) によって資金提供されています。この記事は、iNEXT-Discovery(プロジェクト番号871037)がサポートしました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium molibdateMerck277908
Ammonium-15N ChlorideCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonaseEMD Millipore Corp70746-3
Boric acidMerckB6768
bromophenol blueSigmaB0126
calcium dichlorideMerck499609
Choline chlorideSigmaC-1879
Cobalt chlorideMerck449776
Copper sulphateMerckC1297
D-BiotinMerck8512090025
Deuterium OxideCortecnetCD5251P1000
Dimethyl sulfoxideMerckD9170
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichL6876
Folic acidSigmaF-7876
Glucose 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlycerolHoneywellG7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)HoneywellG7757-1L
GlycineSigma Aldrich50046
Guanidine hydrochlorideRoth CarlNR.0037.1
Iron sulphateMerck307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideThermofisherR0392
Lysogeny BrothMerckL3022
LysozymeSigma AldrichL6876
Magnesium chloride - hexahydrateFluka63064
magnesium sulphateMerckM5921
monopotassium phosphateMerck1051080050
MyoinositolSigmaI-5125
n-Dodecyl-B-D-maltosideAcros Organics3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxideMerck40236
NicatinamideSigmaN-3376
Panthotenic acidSigma21210-25G-F
protease inhibitorSigmaP8849
Pyridoxal-HClSigma AldrichP9130
RiboflavinAldrichR170-6
Sodium ChlorideMerckK51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrateSigma Aldrich1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfateThermo-scientific28365
Sodium hydroxideMerck1,06,49,81,000
SucroseSigma Life ScienceS9378
Thiamine-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
Zinc chlorideMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1.5 mL Ultra-tubesBeckman Coulter357448
30 kDa centrifugal filterAmiconUFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with capsCortecnetH13861
3.2 mm teflon insertCortecnetB6628
3.2 mm sample packer/unpackerCortecnetB6988
3.2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotorCortecnetHZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotorCortecnetB136904
1.3 mm MAS rotor + capsCortecnetHZ14752
1.3 mm filling toolCortecnetHZ14714
1.3 mm sample packerCortecnetHZ14716
1.3 mm cap removerCortecnetHZ14706
1.3 mm cap set toolCortecnetHZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie - BlackMerckHS15094

参考文献

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