JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой работе подробно описаны надежные базовые процедуры подготовки образцов мембранных белков, меченных изотопами, и их анализа с высоким разрешением с помощью современных методов твердотельной ЯМР-спектроскопии.

Аннотация

Мембранные белки жизненно важны для функционирования клеток и, таким образом, являются важными мишенями для лекарств. Твердотельная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ssNMR) предлагает уникальный доступ к исследованию структуры и динамики таких белков в биологических мембранах возрастающей сложности. В данной работе мы представляем современную твердотельную ЯМР-спектроскопию как инструмент для изучения структуры и динамики белков в естественных липидных мембранах и на атомном уровне. В таких спектроскопических исследованиях используются высокочувствительные методы ЯМР, т.е. ЯМР, детектируемый протонами (1H), и ДНФ (динамическая ядерная поляризация) с поддержкой ЯМР. Используя бактериальный бета-бочонок BamA и ионный канал KcsA, мы представляем методы получения меченых изотопами мембранных белков и получения структурной и двигательной информации с помощью ssNMR.

Введение

Структурные и двигательные исследования мембранных белков в физиологически значимых средах бросают вызов традиционным методам структурной биологии1. Современные методы твердотельной ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии (ЯМР) предлагают уникальный подход к характеризации мембранных белков 2,3,4,5,6,7 и уже давно используются для изучения мембранных белков, включая мембранные белковые насосы 8, каналы 9,10,11 или рецепторы12,13,14,15. Технические достижения, такие как сверхвысокие магнитные поля >1000 МГц, быстрые частоты вращения под магическим углом >100 кГц, а также методыгиперполяризации16, сделали ЯМР мощным методом изучения мембранных белков в средах все возрастающей сложности, от липосом до клеточных мембран и даже целых клеток. Например, ДНФ стал мощным инструментом для таких экспериментов (см. ссылку 17,18,19,20,21,22,23,24,25). В последнее время 1H-детектируемый ssNMR предлагает все больше возможностей для изучения мембранных белков с высоким спектральным разрешением и чувствительностью 25,26,27,28,29. В этой работе выделены два бактериальных мембранных белка, которые участвуют в основных функциях, т.е. в вставке белка и транспортировке ионов. Соответствующие белки, BamA 25,30,31,32,33 и KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (или их химерные варианты 10,40) были исследованы с помощью ssNMR методов уже более десяти лет.

Здесь представлен репрезентативный протокол получения и характеристики ssNMR мембранных белков, происходящих из бактериального происхождения. Различные этапы протокола показаны на рисунке 1. Во-первых, объясняется экспрессия, мечение изотопов, очистка и мембранное восстановление BamA. Затем представлен общий рабочий процесс для определения характеристик мембранного белка с помощью ssNMR; в частности, распределение белковых основ мембраны с помощью 1-H-детектируемого ssNMR при быстром магическом угле вращения. Наконец, подробно описываются основы настройки и регистрации экспериментов с динамической ядерной поляризацией (DNP), которые значительно повышают чувствительность сигнала ssNMR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Производство унифицированных марок 2H, 13C, 15N BamA-P4P5

ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что этот протокол требует работы с непатогенными грамотрицательными бактериями, соблюдение основных процедур биологической безопасности является обязательным, а именно: ношение защитных очков, лабораторных халатов, перчаток и следование стандартным рабочим процедурам учреждения для работы с микроорганизмами.

  1. Используйте одну колонию E. coli BL 21 Star (DE3), содержащую плазмиду pET11aΔssYaeT, кодирующую E. coli BamA-P4P5, для инокуляции 50 мл бульона Lysogeny с добавлением 50 мкг/л ампициллина.
  2. Выращивайте культуру при 37 °C при 200 об/мин до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр600 0,6. Вращайте при скорости 2 000 x g в течение 10 минут. Ресуспендируйте гранулу в 50 мл M9 (см. Таблицу 1) до максимального наружного диаметра600 0,1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие этапы выращивания происходят при условиях, указанных выше, если не указано иное.
  3. Выращивают культуру до ОД600 от 0,5. Вращайте при температуре 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулу в 50 мл M9, содержащей 90%D2O(рецепт см. в Таблице 1 ) до максимального наружного диаметра600 0,1. Выращивайте культуру в течение ночи при 30 °C при 200 об/мин.
  4. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте гранулу в предварительно подогретом 50 мл 90% D2O M9 до максимального наружного диаметра600 0,1. Увеличивайте до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр600 1,0.
  5. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Приготовьте 100 мл 100% среды D2O M9 с обогащенным изотопами количеством необогащенной глюкозы и хлорида аммония. Ресуспензия в среде 100% D2O M9 до максимального наружного диаметра600 0,1. Выращивайте до тех пор, пока не будет достигнут внешний диаметр600 0,7.
  6. Уменьшите температуру культуры при 2 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 мл 100% D2O M9 среды с изотопами (см. таблицу 1) до максимального наружного диаметра600 0,1.
  7. Дайте культуре расти до тех пор, пока не будет достигнут ОД600 в 0,6-0,9. Индуцировать 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранизида (IPTG). Сцеживайте в течение 4 ч и собирайте клетки при 4 000 x g в течение 15 мин при комнатной температуре.

2. Очистка, рефолдинг и формирование протеолипосомы BamA-P4P5

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы этого раздела должны выполняться в вытяжном шкафу. При открытии пробирок необходимо соблюдать особую осторожность при ограничении содержания вредных аэрозолей после центрифугирования.

  1. Разморозьте гранулу на льду. Суспендируйте гранулу в 20 мл холодного буфера 1. Буферы см. в таблице 2 .
  2. Уменьшите температуру раствора при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулу в 20 мл холодного дистиллированного H2O. Дайте суспензии инкубироваться на льду в течение 10 минут.
  3. Убавьте суспензию при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Ресуспендируйте в холодный буфер 2 объемом 10 мл и дайте инкубироваться на льду в течение 30 минут.
  4. Добавьте в смесь еще 10 мл холодного буфера 2 и инкубируйте еще 30 минут на льду. Добавьте 0,5% n-додецил-B-D-мальтозид (ДДМ) и аккуратно перемешайте.
  5. Ультразвуковая обработка образца на льду с частотой 13 кГц до интенсивного использования импульсов включения/выключения длительностью 10 с. Вращайте при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Трижды умыться 20 мл буфера 3. Центрифугируйте при 25 000 x g в течение 20 мин при 4 °C.
  6. Ресуспендируйте гранулу в 20 мл буфера 4. Выдерживать при 37 °C в течение 30 минут. Обработайте образец ультразвуком на льду с частотой 13 кГц до четких импульсов включения/выключения продолжительностью 10 с.
  7. Уменьшите температуру образца при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Повторите шаги с 2.4 по 2.6, не добавляя ингибитора протеазы, и инкубируйте при 37 °С.
  8. Промойте гранулу 20 мл воды и дважды с Буфером 3. Вращайте при 25 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Разложите суспензию в микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл и вращайте микроцентрифужные пробирки с максимальной скоростью на настольной центрифуге в течение 20 минут. Чистоту тела включения оценивают с помощью 10% геля SDS-Page, см. Рисунок 2A. Ожидаемый выход для очищенного BamA-P4P5 трижды (2 H,13 C,15N) меченого составляет 30 мг/л.
  9. Растворяют тела включения в 200 мкл буфера 5 и 300 мкл H2O. Добавляют 6М гуанидия хлорида (GdnCl). Отрегулируйте объем микроцентрифужной пробирки до 1 мл с помощью Н2О. Перебейте смесь в вихрь и выдержите в течение 4 ч при комнатной температуре. Периодически (каждые 30 минут) делайте вихревые пробирки микроцентрифуги.
  10. Вращайте при 100 000 x g в течение 1 часа при 4 °C. Используйте закон Бера-Ламберта для определения концентрации белка с точностью до 280 нм. Коэффициент затухания моляров составляет 117,120 М-1 см-1. Если концентрация составляет >100 мкМ, разбавьте 1x Буфером 5 с 6 M GdnCl. Быстро разбавьте белок в 10 раз в буфере 6. Инкубируйте смесь в течение ночи при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ультрацентрифугирования используйте пробирки класса ультрацентрифугирования 1,5 мл.
  11. Определите эффективность повторного сворачивания с помощью полунативного геля SDS-Page. Возьмите две аликвоты по 10 мкл из шага 2.10 и добавьте 10 мкл буфера Lameili (буфер 8) к каждой аликвоте. Кипятить один образец в течение 10 минут при температуре 95 °C; Оставшуюся аликвоту оставьте на льду. После этого запустите оба образца при 14 мА на 10% геле SDS-Page. В укладывающей и рабочей частях гелей отсутствует восстановитель и SDS. Окрашивание белка достигается с помощью красителя кумасси. Ожидаемые результаты показаны на рисунке 2B.
  12. Уменьшите температуру образца при 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Сконцентрируйте образец до рабочего объема 8 мл с помощью центробежного фильтра с усилием 30 кДа. Вращайте образец при температуре 4 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Измерьте абсорбцию белка при длине волны 280 нм. Как и в шаге 2.10, определите концентрацию белка.
  13. Рассчитайте количество липидов, необходимое для соотношения липидов к белку 10:1 (LPR-моль/моль). Добавьте необходимое количество липидов, рассчитанное на шаге 2.12, в колбу с круглым дном объемом 100 мл (RBF). Откачайте хлороформ из RBF под слабой струей азота. Поместите RBF в режим высокого вакуума на 3 часа. Увлажните липидную пленку 1 мл Buffer 7. Инкубируйте RBF в течение 10 минут при 37 °C.
  14. Добавьте белковую смесь (с шага 2.12) в RBF.
  15. Разбавьте смесь белка и липидов (с шага 2.14) до конечного объема 50 мл в RBF. Используйте Буфер 7 с добавлением 1х ингибитора протеазы, растворенного в ДМСО, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
  16. Диализируйте против 100 объемов Buffer 7 в течение 2 недель (используйте трубки для отсечения молекулярной массы 12-14 кДа). В течение первых 24 часов проводите диализ при комнатной температуре с добавлением свежего буфера 7 каждые 8 часов. После этого меняйте буфер один раз в день и проводите диализ при температуре 4 °C.

3. Заполнение ротора ssNMR

  1. После шага 2.16 центрифугируйте в течение 30-60 минут при 10 000 x g при 4 °C, чтобы образовалась гранула. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная ниже методика была оптимизирована для ротора диаметром 3,2 мм, но применима практически для ротора любого диаметра.
  2. Поместите образец пипеткой в ротор и аккуратно открутите его с помощью настольной центрифуги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от консистенции образца можно использовать либо инструмент для уплотнения образца, либо шпатель вместо пипетки для помещения образца в ротор.
  3. Повторите этот процесс 2-3 раза, пока ротор не заполнится до нужной высоты, и проверьте, достаточно ли места для колпачка, как указано маркерной линией на инструменте уплотнения. Закройте ротор с помощью инструмента для позиционирования крышки на ровной поверхности. Отметьте половину нижнего края ротора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Новые поколения роторов ssNMR поставляются с прочной лазерной меткой на нижнем краю для оптического обнаружения частоты вращения ротора. В противном случае рекомендуется использовать ручку для острых резон; так как детектор MAS был оптимизирован специально для чернил sharpie.
  4. Используйте лупу, чтобы проверить, правильно ли установлен колпачок.

4. Определение характеристик образцов с помощью 2D 13 C-13C ssNMR спектроскопии

  1. Вставьте ротор в магнит, используя автоматическую процедуру вращения устройства MAS, раскрутите образец до желаемой частоты MAS в диапазоне от 10 до 20 кГц MAS, охлаждая образец до заданной температуры 270 K. Настройте и совместите каналы 1H и 13C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе частоты MAS избегайте случайного совпадения расстояния химического сдвига между спектральной областью Cα и областью карбонильного углерода с частотой вращения, т.е. избегайте условия резонанса вращенияпервого порядка 41.
  2. Оптимизируйте экспериментпо кроссполяризации42 (CP) 1 H-13C путем изменения мощности радиочастот на протонном канале в диапазоне от 25 до 80 кГц. Типичными параметрами являются ВЧ мощность 45 кГц при 13С, гетероядерная развязка 80-100 кГц 1H-развязка43 во время регистрации, задержка рециркуляции 1,8-2,0 с и 64 сканирования.
    1. Оптимизируйте время контакта CP для максимальной чувствительности сигнала на алифатических углях.
    2. Определите длину импульса 1ч 90° в эксперименте 13C-CP, умножив начальный импульс на четыре, т. е. оптимизировав импульс на 360°, и изменяйте длину до тех пор, пока сигнал не исчезнет. Включите прямоугольный импульс непосредственно после переноса CP и аналогично оптимизируйте длину импульса 13C 90°.
  3. Проведите эксперимент 2D 13 C-13C по протонной спиновой диффузии (PDSD), такой как PARIS, с временем передачи намагниченности 30 мс для обнаружения внутриостаточных корреляций и оценки качества образца. Передайте уровни мощности, время контакта и длину импульсов 90° из ранее оптимизированного эксперимента 13C-CP. Используйте время сбора данных 4–6 мс в косвенном измерении. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) или, для нечувствительных образцов, экспоненциального уширения линии в обоих измерениях.
  4. Извлекаем срезы изолированных перекрестных пиков и определяем ширину линии на половинных высотах. Ширина линии в пределах ~0,3-1,0 13°C ppm указывает на хорошо упорядоченный образец, идеально подходящий для характеристики ssNMR, в то время как ширина линии выше 1,0 13C ppm указывает на конформационную гетерогенность, которая может нарушить характеристику ssNMR. Спектр BamA в 2D CC Paris, показанный на рисунке 3A , является примером хорошо упорядоченного белка, который дает высококачественные спектры.

5. Назначение магистральных магистралей с помощью 1H-детектируемой 3D ssNMR спектроскопии

  1. Получение спектральных отпечатков 2D NH
    1. Залейте образец в ротор диаметром 1,3 мм, как описано выше. Вставьте ротор в магнит, раскрутите образец до 10-20 кГц MAS и охладите образец до заданной температуры 240-250 К или ниже, в зависимости от технических характеристик зондовой головки ssNMR. Используйте интерфейс блока MAS для постепенного увеличения частоты MAS с шагом от 5 кГц до 60 кГц MAS.
    2. Оптимизируйте амплитуды CP, время контакта и длину импульсов 90° в экспериментах с CP 13C- и 15N. Используйте амплитуды около 30-50 или 70-100 кГц на гетероядерных каналах и варьируйте амплитуду на 1H-канале от 80-180 кГц. Используйте задержку рециркуляции 0,7-1,2 с, а также маломощную развязку маломощных гетероядерных протонов на частоте 15 кГц44. Кроме того, см. ссылку45 для получения дополнительной практической информации о том, как проводить эксперименты CP ssNMR.
    3. Приобретите 2D-эксперимент NH для измерения разрешения 1H. Передайте 15параметров N-CP и используйте время сбора данных приблизительно 15 и 25 мс в прямых и косвенных размерах. Для первой передачи CP от 1H до 15N используйте ранее оптимизированное время контакта. Для обратного переноса с 15Н на 1Н используйте время контакта 0,7-1,0 мс, чтобы свести к минимуму передачу межостаточной намагниченности.
    4. Используйте 50-250 мс воды MISSISSIPPI suppression46, в зависимости от содержания воды в пробе. Обработка спектра с помощью функций Син-Колокола (QSIN) в обоих измерениях. Извлекаем срезы изолированных перекрестных пиков и определяем ширину линии на половинных высотах. Пример высококачественного 2D спектраNH 25 показан для мембранного BamA-P4P5 на рисунке 3B.
  2. Назначения магистральных магистралей
    1. Оптимизация эксперимента по CP-симметрии 1D 15N до 13Cα47. Поместите носитель 13C в середину области Cα около 55 ppm. Используйте радиочастотную амплитуду 13C 20 кГц и изменяйте амплитуду 15Н в диапазоне от 35 до 45 кГц для максимальной передачи сигналам Cα и минимальной передачи карбонильных сигналов. Оптимизируйте время контакта от 3 до 10 мс с шагом 1 мс.
    2. Проведите 3D-эксперимент CαNH. Перенос всех амплитуд CP, времени контакта и длительности импульсов из ранее оптимизированных этапов. Используйте приблизительно 10 мс и 30 мс в измерениях косвенного и прямого захвата. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) во всех трех измерениях.
    3. Оптимизация переноса намагниченности 1D Cα в CO DREAM48. Начните с переноса ЦП в диапазоне от 15Н до 13Cα. Затем перенесите намагниченность с Cα на CO с помощью спинового замка на канале 13C. Изменяйте амплитуду РЧ в диапазоне от 20 до 35 кГц для оптимальной передачи. Оптимизируйте время передачи от 4 до 10 мс.
    4. Проведите 3D-эксперимент Cα(CO)NH. Перенос всех амплитуд РЧ-сигналов, времени контакта и длины импульсов с ранее оптимизированных шагов. Используйте приблизительно 10 мс и 30 мс в измерениях косвенного и прямого захвата. Обрабатывайте спектр с помощью функций квадрата син-колокола (QSIN) во всех трех измерениях.
    5. Повторите и адаптируйте шаги 1-4 для аналогичных 3D экспериментов CONH и CO(Cα)NH. Используйте этот квартет 3D-экспериментов для последовательных прогулок Cα и CO для назначения белковой основы, как показано на примере KcsA на рисунке 428.

6. Динамика белков с помощью1-H-детектируемой ssNMR-спектроскопии

  1. Для исследований 15N T1 используйте ранее оптимизированный эксперимент 2D NH на частоте MAS 60 кГц и включите задержку после первого шага кроссполяризации от 1H до 15N. Проведите серию двухмерных NH-экспериментов и изменяйте задержку от 0 до 16 с, используя шаги, например, 0, 2, 4, 8 и 16 с.
  2. Построение графика нормализованной интенсивности разрешенных сигналов в зависимости от увеличения времени задержки. Подгоним затухание T1 к одиночным экспоненциалам в соответствии с y = exp(-x/T1), где y — интенсивность сигнала в момент затухания x.
  3. Аналогично, для исследований 15Н Т1rho включите импульс спин-синхронизации в программу импульсов на канале 15Н с амплитудой РЧ в диапазоне от 15-20 кГц после первого шага кроссполяризации 26,49 от 1 Н до 15Н. Получить серию 2D NH экспериментов и варьировать задержку от 0 до 150 мс, а также подгонять затухание T1rho разрешенных сигналов к единичным экспоненциалам. Иллюстративные данные 15N T1rho для мембранных каналов K+ показаны на рисунке 527,28.

7. Динамическая ядерная поляризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие подготовительные шаги относятся к использованию коммерческих установок DNP с использованием 3,2-миллиметровых сапфировых роторов MAS (Рисунок 6)20. Использование роторов из диоксида циркония или другого оборудования DNP может привести к снижению усиления сигнала DNP.

  1. Ресуспендируйте гранулу мембранного белка (начиная со стадии 3.1) в 50 мкл дейтерированного буфера DNP (60% (v/v) дейтерированных d8- и глицерина и 15 мМ AMUPol50. Для экспериментов на частоте 800 МГц мы рекомендуем использовать 10 мМ NATriPOL-351. Также см. ссылку52 для дальнейших практических аспектов экспериментов DNP ssNMR.
  2. Центрифугируйте в течение 10-20 минут при 100 000 x g при 4 °C, чтобы образовалась гранула. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  3. Предварительно охладите центробежный адаптер и компоненты сапфирового ротора MAS диаметром 3,2 мм до <4 °C. Следующие шаги (7.4-7.7) должны быть выполнены как можно быстрее, чтобы предотвратить снижение количества агентов DNP.
  4. Поместите сапфировый ротор диаметром 3,2 мм в адаптер центрифуги и заполните его суспензией протеолипосом, начиная с шага 7.2.
  5. Осторожно прижмите образец белка ресуспендированной мембраны к внутренней стенке ротора с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Дайте раствору сползти вниз к нижней части ротора. Следите за тем, чтобы не образовывались пузырьки воздуха.
  6. Вращайте образец в роторе в течение 5-10 минут при 4 500 x g при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, содержащую избыток сока DNP, осторожно отпив его, не нарушая клеточную гранулу. Повторяйте шаги 6.4-6.6 до тех пор, пока ротор не заполнится.
  7. Осторожно расположите распорку из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с помощью распорного винта в верхней части ротора.
  8. Поместите ротор крышкой вниз в поршень ротора53 и погрузите ротор в жидкий азот. Дайте ротору и образцу не менее 30-60 секунд, чтобы они замерзли.
  9. Запустите блок теплообменника и охладите зонд DNP до ~90K.
  10. Установите блок MAS в ручной режим и установите переменную температуру (VT) на 135 л/ч, а расход газа подшипника и привода на ~6 л/ч.
  11. Включите функцию извлечения на консоли MAS.
  12. Перенесите замороженный образец из Шага 7.8 из жидкости N2 в пробоуловитель и поместите его в зонд (см. также ссылку53).
  13. Вручную увеличьте давление подшипника щупа (Bp) до ~500 мбар перед включением «Вставки». Это целесообразно для стабильного и безопасного вращения ротора.
  14. Увеличить скорость MAS до нужного значения с помощью процедуры, описанной в ссылке53.
  15. Проверьте наличие улучшений DNP с микроволнами и без них с помощью стандартных экспериментов 1D CP (см., например, ссылку51,54) (рис. 7), прежде чем приступать к многомерным экспериментам, например, экспериментам 2D CC, описанным в разделе 3 данной статьи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 2 показаны репрезентативные гели для чистоты тела включения (панель А) и повторного складывания тел включения (панель В3). Рисунок 2 подтверждает успешную очистку 13 C,15N-меченного BamA-P4P5.

На ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мембранные белки играют ключевую роль в регуляции жизненно важных клеточных функций как у прокариотических, так и у эукариотических организмов; Таким образом, понимание механизмов их действия на атомных уровнях разрешения имеет жизненно важное значение. Существующ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа является частью исследовательских программ ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI и VIDI с номерами проектов 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 и 718.015.00, которые финансируются Голландским исследовательским советом (NWO). Эта статья была поддержана iNEXT-Discovery (проект номер 871037).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium molibdateMerck277908
Ammonium-15N ChlorideCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonaseEMD Millipore Corp70746-3
Boric acidMerckB6768
bromophenol blueSigmaB0126
calcium dichlorideMerck499609
Choline chlorideSigmaC-1879
Cobalt chlorideMerck449776
Copper sulphateMerckC1297
D-BiotinMerck8512090025
Deuterium OxideCortecnetCD5251P1000
Dimethyl sulfoxideMerckD9170
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichL6876
Folic acidSigmaF-7876
Glucose 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlycerolHoneywellG7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)HoneywellG7757-1L
GlycineSigma Aldrich50046
Guanidine hydrochlorideRoth CarlNR.0037.1
Iron sulphateMerck307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideThermofisherR0392
Lysogeny BrothMerckL3022
LysozymeSigma AldrichL6876
Magnesium chloride - hexahydrateFluka63064
magnesium sulphateMerckM5921
monopotassium phosphateMerck1051080050
MyoinositolSigmaI-5125
n-Dodecyl-B-D-maltosideAcros Organics3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxideMerck40236
NicatinamideSigmaN-3376
Panthotenic acidSigma21210-25G-F
protease inhibitorSigmaP8849
Pyridoxal-HClSigma AldrichP9130
RiboflavinAldrichR170-6
Sodium ChlorideMerckK51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrateSigma Aldrich1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfateThermo-scientific28365
Sodium hydroxideMerck1,06,49,81,000
SucroseSigma Life ScienceS9378
Thiamine-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
Zinc chlorideMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1.5 mL Ultra-tubesBeckman Coulter357448
30 kDa centrifugal filterAmiconUFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with capsCortecnetH13861
3.2 mm teflon insertCortecnetB6628
3.2 mm sample packer/unpackerCortecnetB6988
3.2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotorCortecnetHZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotorCortecnetB136904
1.3 mm MAS rotor + capsCortecnetHZ14752
1.3 mm filling toolCortecnetHZ14714
1.3 mm sample packerCortecnetHZ14716
1.3 mm cap removerCortecnetHZ14706
1.3 mm cap set toolCortecnetHZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie - BlackMerckHS15094

Ссылки

  1. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  2. Kaplan, M., Pinto, C., Houben, K., Baldus, M. Nuclear magnetic resonance (NMR) applied to membrane-protein complexes. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 15(2016).
  3. Brown, L. S., Ladizhansky, V. Membrane proteins in their native habitat as seen by solid-state NMR spectroscopy. Protein Science. 24 (9), 1333-1346 (2015).
  4. Ladizhansky, V. Applications of solid-state NMR to membrane proteins. Biochimica Et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics. 1865 (11), Pt B 1577-1586 (2017).
  5. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. H. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 1-24 (2012).
  6. Shahid, S. A., et al. Membrane-protein structure determination by solid-state NMR spectroscopy of microcrystals. Nature Methods. 9 (12), 1212-1217 (2012).
  7. Wang, S. L., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nature Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  8. Herzfeld, J., Lansing, J. C. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31 (1), 73-95 (2002).
  9. Ketchem, R. R., Hu, W., Cross, T. A. High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid-state NMR. Science. 261 (5127), 1457-1460 (1993).
  10. Lange, A., et al. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR. Nature. 440 (7086), 959-962 (2006).
  11. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  12. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  13. Luca, S., et al. The conformation of neurotensin bound to its G protein-coupled receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10706-10711 (2003).
  14. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14 (3), 284-290 (2018).
  15. Krug, U., et al. The conformational equilibrium of the neuropeptide Y2 receptor in bilayer membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 59 (52), 23854-23861 (2020).
  16. Maly, T., et al. Dynamic nuclear polarization at high magnetic fields. Journal of Chemical Physics. 128 (5), (2008).
  17. Bajaj, V. S., Mak-Jurkauskas, M. L., Belenky, M., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Functional and shunt states of bacteriorhodopsin resolved by 250 GHz dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9244-9249 (2009).
  18. Linden, A. H., et al. Neurotoxin II bound to acetylcholine receptors in native membranes studied by dynamic nuclear polarization NMR. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19266-19269 (2011).
  19. Ong, Y. S., Lakatos, A., Becker-Baldus, J., Pos, K. M., Glaubitz, C. Detecting substrates bound to the secondary multidrug efflux pump EmrE by DNP-enhanced solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15754-15762 (2013).
  20. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  21. Becker-Baldus, J., et al. Enlightening the photoactive site of channelrhodopsin-2 by DNP-enhanced solid-state NMR spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), 9896-9901 (2015).
  22. Kaplan, M., et al. EGFR dynamics change during activation in native membranes as revealed by NMR. Cell. 167 (5), 1241-1251 (2016).
  23. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K+ channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  24. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14, 284(2018).
  25. Pinto, C., et al. Formation of the beta-barrel assembly machinery complex in lipid bilayers as seen by solid-state NMR. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Good, D. B., et al. Conformational dynamics of a seven transmembrane helical protein Anabaena Sensory Rhodopsin probed by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (7), 2833-2842 (2014).
  27. Medeiros-Silva, J., et al. (1)H-detected solid-state NMR studies of water-inaccessible proteins in vitro and in situ. Angewandte Chemie (International Edition in English). 55 (43), 13606-13610 (2016).
  28. Jekhmane, S., et al. Shifts in the selectivity filter dynamics cause modal gating in K(+) channels. Nature Communications. 10 (1), 123(2019).
  29. Schubeis, T., Le Marchand, T., Andreas, L. B., Pintacuda, G. 1H magic-angle spinning NMR evolves as a powerful new tool for membrane proteins. Journal of Magnetic Resonance. 287, 140-152 (2018).
  30. Sinnige, T., et al. Solid-state NMR studies of full-length BamA in lipid bilayers suggest limited overall POTRA mobility. Journal of Molecular Biology. 426 (9), 2009-2021 (2014).
  31. Sinnige, T., et al. Insight into the conformational stability of membrane-embedded BamA using a combined solution and solid-state NMR approach. Journal of Biomolecular NMR. 61 (3-4), 321-332 (2015).
  32. Sinnige, T., et al. Conformational plasticity of the POTRA 5 domain in the outer membrane protein assembly factor BamA. Structure. 23 (7), 1317-1324 (2015).
  33. Renault, M., Bos, M. P., Tommassen, J., Baldus, M. Solid-state NMR on a large multidomain integral membrane protein: the outer membrane protein assembly factor BamA. Journal of the American Chemical Society. 133 (12), 4175-4177 (2011).
  34. Doyle, D. A., et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280 (5360), 69-77 (1998).
  35. Wylie, B. J., Bhate, M. P., McDermott, A. E. Transmembrane allosteric coupling of the gates in a potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 185-190 (2014).
  36. Xu, Y., Zhang, D., Rogawski, R., Nimigean, C. M., McDermott, A. E. Identifying coupled clusters of allostery participants through chemical shift perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2078-2085 (2019).
  37. vander Cruijsen, E. A. W., Prokofyev, A. V., Pongs, O., Baldus, M. Probing conformational changes during the gating cycle of a potassium channel in lipid bilayers. Biophysical Journal. 112 (1), 99-108 (2017).
  38. Varga, K., Tian, L., McDermott, A. E. Solid-state NMR study and assignments of the KcsA potassium ion channel of S. lividans. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (12), 1604-1613 (2007).
  39. Zhang, D., Howarth, G. S., Parkin, L. A., McDermott, A. E. NMR studies of lipid regulation of the K+ channel KcsA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. , 183491(2020).
  40. Schneider, R., et al. Solid-state NMR spectroscopy applied to a chimeric potassium channel in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (23), 7427-7435 (2008).
  41. Raleigh, D. P., Levitt, M. H., Griffin, R. G. Rotational resonance in solid-state Nmr. Chemical Physics Letters. 146 (1-2), 71-76 (1988).
  42. Schaefer, J., Stejskal, E. O. C-13 nuclear magnetic-resonance of polymers spinning at magic angle. Journal of the American Chemical Society. 98 (4), 1031-1032 (1976).
  43. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An improved broadband decoupling sequence for liquid crystals and solids. Journal of Magnetic Resonance. 142 (1), 97-101 (2000).
  44. Weingarth, M., Bodenhausen, G., Tekely, P. Low-power decoupling at high spinning frequencies in high static fields. Journal of Magnetic Resonance. 199 (2), 238-241 (2009).
  45. Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (127), (2017).
  46. Zhou, D. H., Rienstra, C. M. High-performance solvent suppression for proton detected solid-state NMR. Journal of Magnetic Resonance. 192 (1), 167-172 (2008).
  47. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Molecular Physics. 95 (6), 1197-1207 (1998).
  48. Verel, R., Baldus, M., Ernst, M., Meier, B. H. A homonuclear spin-pair filter for solid-state NMR based on adiabatic-passage techniques. Chemical Physics Letters. 287 (3-4), 421-428 (1998).
  49. Lewandowski, J. R., Sass, H. J., Grzesiek, S., Blackledge, M., Emsley, L. Site-specific measurement of slow motions in proteins. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16762-16765 (2011).
  50. Sauvee, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie (International Edition in English). 52 (41), 10858-10861 (2013).
  51. Zhai, W., et al. Postmodification via thiol-click chemistry yields hydrophilic trityl-nitroxide biradicals for biomolecular high-field dynamic nuclear polarization. The Journal of Physical Chemistry. B. 124 (41), 9047-9060 (2020).
  52. Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  53. Narasimhan, S., et al. Characterizing proteins in a native bacterial environment using solid-state NMR spectroscopy. Nature Protocols. , (2020).
  54. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  55. Weingarth, M., et al. Quantitative analysis of the water occupancy around the selectivity filter of a K+ channel in different gating modes. Journal of the American Chemical Society. 136 (5), 2000-2007 (2014).
  56. Lalli, D., et al. Proton-based structural analysis of a heptahelical transmembrane protein in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (37), 13006-13012 (2017).
  57. Schubeis, T., et al. A beta-barrel for oil transport through lipid membranes: Dynamic NMR structures of AlkL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21014-21021 (2020).
  58. Baker, L. A., Daniels, M., vander Cruijsen, E. A. W., Folkers, G. E., Baldus, M. Efficient cellular solid-state NMR of membrane proteins by targeted protein labeling. Journal of Biomolecular NMR. 62 (2), 199-208 (2015).
  59. Linser, R., et al. Proton-detected solid-state NMR spectroscopy of fibrillar and membrane proteins. Angewandte Chemie (International Edition in English). 50 (19), 4508-4512 (2011).
  60. Shukla, R., et al. Mode of action of teixobactins in cellular membranes. Nature Communications. 11 (1), 2848(2020).
  61. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nature Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  62. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K(+) channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  63. Narasimhan, S., et al. DNP-supported solid-state NMR spectroscopy of proteins inside mammalian cells. Angewandte Chemie (International Edition in English). 58 (37), 12969-12973 (2019).
  64. Wu, R., Stephenson, R., Gichaba, A., Noinaj, N. The big BAM theory: An open and closed case. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1862 (1), 183062(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

BamAKcsA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены