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Resumo

Este trabalho detalha rotinas básicas robustas sobre como preparar amostras de proteínas de membrana marcadas com isótopos e analisá-las em alta resolução com métodos modernos de espectroscopia de RMN de estado sólido.

Resumo

As proteínas de membrana são vitais para a função celular e, portanto, representam importantes alvos de drogas. A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Estado Sólido (ssNMR) oferece um acesso único para sondar a estrutura e a dinâmica de tais proteínas em membranas biológicas de complexidade crescente. Aqui, apresentamos a moderna espectroscopia de RMN em estado sólido como uma ferramenta para estudar a estrutura e a dinâmica de proteínas em membranas lipídicas naturais e em escala atômica. Tais estudos espectroscópicos se beneficiam do uso de métodos de ssNMR de alta sensibilidade, ou seja, ssNMR detectado por prótons (1H) e ssNMR suportado por DNP (Dynamic Nuclear Polarization). Usando a proteína bacteriana do barril beta da membrana externa BamA e o canal iônico KcsA, apresentamos métodos para preparar proteínas de membrana marcadas com isótopos e derivar informações estruturais e de movimento por ssNMR.

Introdução

Estudos estruturais e de movimento de proteínas de membrana em ambientes fisiologicamente relevantes representam um desafio para as técnicas tradicionais de biologia estrutural1. Os métodos modernos de espectroscopia de ressonância magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) oferecem uma abordagem única para a caracterização de proteínas de membrana 2,3,4,5,6,7 e têm sido usados há muito tempo para estudar proteínas de membrana, incluindo bombas de proteína embutidas em membrana 8, canais 9,10,11 ou receptores12,13,14,15. Avanços técnicos como campos magnéticos ultra-altos >1.000 MHz, frequências de rotação rápida de ângulos mágicos >100 kHz e técnicas de hiperpolarização16 estabeleceram a ssNMR como um método poderoso para o estudo de proteínas de membrana em ambientes de complexidade cada vez maior, de lipossomas a membranas celulares e até células inteiras. Por exemplo, o DNP tornou-se uma ferramenta poderosa para tais experimentos (ver referência 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Mais recentemente, o ssNMR detectado por 1H oferece possibilidades crescentes de estudar proteínas de membrana em alta resolução espectral e sensibilidade 25,26,27,28,29. Este trabalho destaca duas proteínas da membrana bacteriana que estão envolvidas em funções essenciais, ou seja, inserção de proteínas e transporte de íons. As proteínas correspondentes, BamA 25,30,31,32,33 e KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (ou variantes quiméricas 10,40) foram examinadas por ssNMR métodos por mais de uma década.

Um protocolo representativo para a preparação e caracterização de ssNMR de proteínas de membrana de origem bacteriana é apresentado aqui. As diferentes etapas do protocolo são mostradas na Figura 1. Primeiro, a expressão, marcação de isótopos, purificação e reconstituição de membrana de BamA é explicada. Em seguida, é apresentado um fluxo de trabalho geral para a caracterização da proteína de membrana por ssNMR; especificamente, a atribuição de estruturas de proteínas de membrana usando 1 ssNMR detectado por Hem rotação rápida de ângulo mágico. Finalmente, a configuração básica e a aquisição de experimentos suportados por polarização nuclear dinâmica (DNP), que aumentam significativamente a sensibilidade do sinal ssNMR, são detalhados.

Protocolo

1. Produção de BamA-P4P5 uniformemente rotulado com 2H, 13C, 15marcados com N

NOTA: Embora este protocolo exija o trabalho com bactérias Gram-negativas não patogênicas, a adesão aos procedimentos básicos de segurança biológica é obrigatória, ou seja, o uso de óculos de segurança, jalecos, luvas e o cumprimento dos procedimentos operacionais padrão institucionais para o trabalho com microrganismos.

  1. Use uma única colônia de E. coli BL 21 Star (DE3) contendo o plasmídeo pET11aΔssYaeT que codifica E . coli BamA-P4P5 para inocular 50 mL de caldo de lisogenia suplementado com 50 μg / L de ampicilina.
  2. Cultive a cultura a 37 °C a 200 rpm até atingir um OD600 de 0,6. Gire a 2.000 x g por 10 min. Ressuspenda o pellet em 50 mL de M9 (ver Tabela 1) até um ODmáximo de 600 de 0,1.
    NOTA: Todas as etapas futuras de crescimento ocorrem nas condições indicadas acima, salvo indicação em contrário.
  3. Cultive a cultura até OD600 de 0,5. Gire a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet em 50 mL de M9 contendo 90% de D2O (consulte a Tabela 1 para receita) até um ODmáximo de 600 de 0,1. Cultive a cultura durante a noite a 30 °C a 200 rpm.
  4. Gire a cultura a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Ressuspenda o pellet nos 50 mL pré-aquecidos a 90% D2O M9 até um OD600 máximo de 0,1. Cresça até atingir um OD600 de 1,0.
  5. Gire a cultura a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Prepare 100 mL de meio 100% D2O M9 com quantidades enriquecidas com isótopos de glicose não enriquecida e cloreto de amônio. Ressuspenda em meio 100% D2O M9 até um OD600 máximo de 0,1. Crescer até atingir um OD600 de 0,7.
  6. Gire a cultura a 2.000 x g por 10 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ml de meio D2O M9 a 100% com isótopos (ver quadro 1) até um OD600 máximo de 0,1.
  7. Deixe a cultura crescer até que um OD600 de 0,6-0,9 seja alcançado. Induza com 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Extrair por 4 h e colher células a 4.000 x g por 15 min em temperatura ambiente.

2. Purificação, redobramento e formação de proteolipossomas BamA-P4P5

NOTA: Todas as etapas desta seção devem ser realizadas em uma capela de exaustão. Deve-se ter cuidado especial ao abrir os tubos pós-centrifugação para limitar os aerossóis nocivos.

  1. Descongele o pellet no gelo. Ressuspenda o pellet em 20 mL de tampão frio 1. Consulte a Tabela 2 para obter os buffers.
  2. Centrifugar a solução a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Ressuspender o pellet em 20 ml de H2O destilado a frio. Deixar incubar a suspensão no gelo durante 10 min.
  3. Gire a suspensão a 4.000 x g por 20 min a 4 °C. Ressuspenda em 10 mL de tampão frio 2 e deixe incubar no gelo por 30 min.
  4. Complemente a mistura com mais 10 mL de tampão frio 2 e incube por mais 30 minutos no gelo. Adicione 0,5% de n-Dodecil-B-D-Maltosídeo (DDM) e agite suavemente.
  5. Sonicar a amostra no gelo a 13 kHz até usar pulsos liga/desliga de 10 s de comprimento. Gire para baixo a 25.000 x g por 20 min a 4 °C. Lave três vezes com 20 mL de tampão 3. Centrifugue a 25.000 x g por 20 min a 4 °C.
  6. Ressuspenda o pellet em 20 mL de tampão 4. Incubar a 37 °C durante 30 min. Sonicar a amostra em gelo a 13 kHz, até pulsos de ligar/desligar de 10 s de duração.
  7. Centrifugar a amostra a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C. Repita as etapas 2.4 a 2.6 omitindo a adição de inibidor de protease e incubação a 37 °C.
  8. Lave o pellet com 20 mL de água e duas vezes com o tampão 3. Gire para baixo a 25.000 x g por 20 min a 4 °C. Alicote a suspensão em tubos de microcentrífuga de 1 mL e gire os tubos de microcentrífuga na velocidade máxima em uma centrífuga de bancada por 20 min. A pureza do corpo de inclusão é avaliada por gel SDS-Page a 10%, consulte a Figura 2A. O rendimento esperado para BamA-P4P5 purificado triplamente (2H, 13C, 15N) rotulado é de 30 mg / L.
  9. Solubilizar corpos de inclusão em 200 μL de tampão 5 e 300 μL de H2O. Adicionar cloreto de guanídio 6M (GdnCl). Ajuste o volume do tubo de microcentrífuga para 1 mL com H2O. Vortex a mistura e incube por 4 h em temperatura ambiente. Vortex os tubos de microcentrífuga periodicamente (a cada 30 min).
  10. Gire a 100.000 x g por 1 h a 4 °C. Use a Lei de Beer-Lambert para determinar a concentração de proteína em 280 nm. O coeficiente de extinção molar é 117.120 M-1 cm-1. Se a concentração for >100 μM, dilua com 1x Tampão 5 com 6 M GdnCl. Dilua rapidamente a proteína 10x no Tampão 6. Incube a mistura durante a noite em temperatura ambiente.
    NOTA: Para ultracentrifugação, use tubos de grau de ultracentrifugação de 1.5 mL.
  11. Determine a eficiência de redobramento usando um gel SDS-Page semi-nativo. Pegue duas alíquotas de 10 μL da etapa 2.10 e adicione 10 μL de tampão Lameili (tampão 8) a cada alíquota. Ferva uma amostra por 10 min a 95 °C; Deixe a outra alíquota no gelo. Em seguida, execute ambas as amostras a 14 mA em um gel SDS-Page a 10%. As porções de empilhamento e execução dos géis carecem de agente redutor e SDS. A coloração de proteínas é obtida usando o corante Coomassie. Os resultados esperados são mostrados na Figura 2B.
  12. Centrifugar a amostra a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Concentrar a amostra num volume de trabalho de 8 ml utilizando um filtro centrífugo de 30 kDa. Centrifugar a amostra a 4.000 x g durante 20 min a 4 °C. Meça a absorvância de proteínas a 280 nm. Como na etapa 2.10, determine a concentração de proteína.
  13. Calcule a quantidade de lipídio necessária para uma proporção de 10:1 lipídio para proteína (LPR-mol/mol). A partir de um estoque de clorofórmio, adicione a quantidade necessária de lipídios, conforme calculado na etapa 2.12, em um balão de fundo redondo de 100 mL (RBF). Evacuar o clorofórmio do RBF sob uma corrente suave de azoto. Coloque o RBF em alto vácuo por 3 h. Hidrate o filme lipídico com 1 mL de tampão 7. Incubar RBF por 10 min a 37 °C.
  14. Adicione a mistura de proteínas (da etapa 2.12) ao RBF.
  15. Diluir a mistura proteína/lípido (do passo 2.14) até ao volume final de 50 ml no RBF. Use o tampão 7 suplementado com 1x inibidor de protease dissolvido em DMSO e incube por 30 min a 37 °C.
  16. Dialisar contra 100 volumes de Buffer 7 por 2 semanas (use tubo de diálise de corte de peso molecular de 12-14 kDa). Nas primeiras 24 horas, realize a diálise à temperatura ambiente com adição de Buffer 7 fresco a cada 8 horas. Em seguida, troque o tampão uma vez ao dia e faça diálise a 4 °C.

3. Enchimento do rotor ssNMR

  1. Após a etapa 2.16, centrifugue por 30-60 min a 10.000 x g a 4 °C para formar um pellet. Remova o sobrenadante com uma pipeta.
    NOTA: A técnica discutida abaixo foi otimizada para um rotor de 3,2 mm, mas é aplicável a quase qualquer diâmetro de rotor.
  2. Pipete a amostra no rotor e gire suavemente a mesma para baixo com uma centrífuga de mesa.
    NOTA: Dependendo da consistência da amostra, pode-se usar uma ferramenta de densificação para compactar a amostra ou uma espátula em vez de uma pipeta para colocar a amostra no rotor.
  3. Repita este processo 2-3x até que o rotor esteja cheio até a altura correta e verifique se há espaço suficiente para a tampa restante, conforme indicado pela linha de marcação na ferramenta de densificação. Feche o rotor com a ferramenta de posicionamento da tampa em uma superfície plana. Marque metade da borda inferior do rotor.
    NOTA: As novas gerações de rotores ssNMR vêm com uma marca de laser durável na borda inferior para a detecção óptica da frequência de rotação do rotor. Caso contrário, sugere-se o uso de uma caneta sharpie; já que o detector MAS foi otimizado especificamente para tinta sharpie.
  4. Use uma lupa para verificar se a tampa está bem colocada.

4. Caracterização da amostra por espectroscopia 2D 13 C-13C ssNMR

  1. Insira o rotor no ímã, usando a rotina de rotação automática da unidade MAS, gire a amostra até a frequência MAS desejada entre 10 e 20 kHz MAS enquanto resfria a amostra até a temperatura definida de 270 K. Sintonize e combine os canais 1H e 13C.
    NOTA: Para a escolha da frequência MAM, evite combinar acidentalmente a distância de deslocamento químico entre a região espectral Cα e a região do carbono carbonílico com a frequência de rotação, ou seja, evite a condição de ressonância rotacional de primeira ordem41.
  2. Otimize umexperimento de polarização cruzada 1 H-13C42 (CP) variando a potência de RF no canal de prótons de 25 a 80 kHz. Os parâmetros típicos são potência de RF de 45 kHz em 13C, desacoplamento heteronuclear de 1H de 80-100 kHz43 durante a aquisição, atraso de reciclagem de 1,8-2,0 s e 64 varreduras.
    1. Otimize o tempo de contato CP para sensibilidade máxima do sinal nos carbonos alifáticos.
    2. Determine o comprimento do pulso de 1H 90 ° no experimento de 13C-CP multiplicando o pulso inicial por quatro, ou seja, otimizando um pulso de 360 °, e varie o comprimento até que o sinal desapareça. Inclua um pulso retangular diretamente após a transferência de CP e otimize o comprimento do pulso de 13C 90° de forma análoga.
  3. Execute um experimento do tipo difusão de spin acionada por prótons (PDSD) 2D 13 C-13C, como PARIS, com tempo de transferência de magnetização de 30 ms para detectar correlações intra-residuais e avaliar a qualidade da amostra. Transfira os níveis de potência, o tempo de contato e os comprimentos de pulso de 90° do experimento 13C-CP otimizado anteriormente. Use um tempo de aquisição de 4 a 6 ms na dimensão indireta. Processe o espectro com funções de sino quadrado (QSIN) ou, para amostras insensíveis, alargamento de linha exponencial em ambas as dimensões.
  4. Extraia fatias de picos cruzados isolados e determine a largura da linha em meias alturas. Uma largura de linha entre ~0,3-1,0 13C ppm é indicativa de uma amostra bem ordenada, ideal para caracterização de ssNMR, enquanto uma largura de linha acima de 1,0 13C ppm é indicativa de heterogeneidade conformacional que pode comprometer a caracterização de ssNMR. O espectro 2D CC PARIS de BamA mostrado na Figura 3A é um exemplo de uma proteína bem ordenada que fornece espectros de alta qualidade.

5. Atribuição de backbone por espectroscopia 3D ssNMR detectada por 1H

  1. Aquisição de impressões digitais espectrais NH 2D
    1. Encher a amostra num rotor de 1,3 mm, conforme descrito acima. Insira o rotor no ímã, gire a amostra para 10-20 kHz MAS e resfrie a amostra para 240-250 K de temperatura definida ou inferior, dependendo das especificações do cabeçote de sonda ssNMR. Use a interface da unidade MAS para aumentar a frequência MAS gradualmente em etapas de 5 kHz a 60 kHz MAS.
    2. Otimize as amplitudes de CP, tempos de contato e comprimentos de pulso de 90° em experimentos de 13C e 15N CP. Use amplitudes em torno de 30-50 ou 70-100 kHz nos canais heteronucleares e varie a amplitude no canal 1H de 80-180 kHz. Use um atraso de reciclagem de 0,7-1,2 s, juntamente com o desacoplamento de prótons heteronucleares de baixa potência de 15 kHz44. Além disso, consulte a referência45 para obter mais detalhes práticos sobre como configurar experimentos CP ssNMR.
    3. Adquira um experimento NH 2D para medir a resolução de 1H. Transfira os 15parâmetros N-CP e use aproximadamente 15 e 25 ms de tempo de aquisição nas dimensões direta e indireta. Para a primeira transferência de 1H a 15N CP, use o tempo de contato previamente otimizado. Para a transferência reversa de 15N a 1H, use o tempo de contato de 0,7-1,0 ms para minimizar a transferência de magnetização inter-residual.
    4. Use 50-250 ms de supressão de água MISSISSIPPI46, dependendo do conteúdo de água da amostra. Processe o espectro com funções de sino quadrado (QSIN) em ambas as dimensões. Extraia fatias de picos cruzados isolados e determine a largura da linha em meias alturas. Um exemplo para um espectro NH25 2D de alta qualidade é mostrado para BamA-P4P5 embutido em membrana na Figura 3B.
  2. Atribuições de backbone
    1. Otimize um experimento CP específico de 1D 15N a 13Cα47. Coloque o portador de 13C no meio da região Cα em torno de 55 ppm. Use uma amplitude de RF de 13C de 20 kHz e varie a amplitude de 15N de 35 a 45 kHz para transferência máxima para os sinais Cα e transferência mínima para os sinais carbonílicos. Otimize o tempo de contato de 3 a 10 ms em incrementos de 1 ms.
    2. Execute um experimento 3D CαNH. Transfira todas as amplitudes CP, tempos de contato e comprimentos de pulso das etapas otimizadas anteriormente. Use aproximadamente 10 ms e 30 ms nas dimensões de aquisição indireta e direta. Processe o espectro com funções de sino quadrado (QSIN) em todas as três dimensões.
    3. Otimize uma transferência de magnetização 1D Cα para CO DREAM48. Comece com uma transferência de CP específica de 15N a 13Cα. Em seguida, transfira a magnetização de Cα para CO usando uma trava de rotação no canal 13C. Varie a amplitude de rf de 20 a 35 kHz para uma transferência ideal. Otimize o tempo de transferência de 4 para 10 ms.
    4. Execute um experimento 3D Cα(CO)NH. Transfira todas as amplitudes de rf, tempos de contato e comprimentos de pulso das etapas otimizadas anteriormente. Use aproximadamente 10 ms e 30 ms nas dimensões de aquisição indireta e direta. Processe o espectro com funções de sino quadrado (QSIN) em todas as três dimensões.
    5. Repita e adapte as etapas 1 a 4 para os experimentos análogos 3D CONH e CO (Cα) NH. Use este quarteto de experimentos 3D para caminhadas sequenciais de Cα e CO para atribuir a estrutura da proteína, conforme mostrado no exemplo de KcsA na Figura 428.

6. Dinâmica de proteínas por espectroscopia ssNMR detectada por 1H

  1. Para estudos de 15N T1 , use o experimento 2D NH previamente otimizado a 60 kHz MAS e inclua um atraso após a primeira etapa de polarização cruzada de 1H a 15N. Adquira uma série de experimentos 2D NH e varie o atraso de 0 a 16 s usando etapas de, por exemplo, 0, 2, 4, 8 e 16 s.
  2. Plote as intensidades normalizadas para sinais resolvidos em função do tempo de atraso crescente. Ajuste o decaimento T1 a exponenciais simples de acordo com y = exp(-x/T1), com y sendo a intensidade do sinal no tempo de decaimento x.
  3. Analogamente, para estudos de 15N T1rho, inclua um pulso de bloqueio de spin no programa de pulso no canal de 15N com uma amplitude de rf entre 15-20 kHz após a primeira etapa de polarização cruzada de 1H a 15N26,49. Adquira uma série de experimentos NH 2D e varie o atraso de 0 a 150 ms e ajuste o decaimento T1rho de sinais resolvidos para exponenciais únicos. Os dados ilustrativos de 15N T1rho são mostrados para canais de K+ incorporados na membrana na Figura 527,28.

7. Polarização nuclear dinâmica

NOTA: As etapas preparatórias a seguir estão relacionadas ao uso de configurações DNP comerciais usando rotores MAS de safira de 3.2 mm (Figura 6)20. O uso dos rotores de zircônia ou outro equipamento DNP pode levar a melhorias mais baixas no sinal DNP.

  1. Ressuspenda o pellet de proteína de membrana (da etapa 3.1) em 50 μL de tampão DNP deuterado (60% (v / v) deuterado d8- e glicerol e 15 mM AMUPol50. Para experimentos em 800 MHz, recomendamos o uso de 10 mM NATriPOL-351. Consulte também a referência52 para mais aspectos práticos dos experimentos DNP ssNMR.
  2. Centrifugue por 10-20 min a 100.000 x g a 4 °C para formar um pellet. Remova o sobrenadante com uma pipeta.
  3. Pré-resfrie o adaptador centrífugo e os componentes do rotor MAS de safira de 3,2 mm a <4 °C. As etapas a seguir (7.4-7.7) precisam ser executadas o mais rápido possível para evitar que os agentes DNP sejam reduzidos.
  4. Coloque o rotor de safira de 3,2 mm no adaptador da centrífuga e encha-o com a suspensão de proteolipossomas da etapa 7.2.
  5. Pipetar cuidadosamente a amostra de proteína de membrana ressuspensa contra a parede interior do rotor utilizando uma ponta de pipeta de 200 μL. Deixe a solução deslizar para o fundo do rotor. Certifique-se de que não se formem bolhas de ar.
  6. Gire a amostra no rotor por 5-10 minutos a 4.500 x g a 4 °C. Remova o sobrenadante contendo o excesso de suco de DNP pipetando-o cuidadosamente sem interromper o pellet celular. Repita as etapas 6.4-6.6 até que o rotor esteja cheio.
  7. Posicione cuidadosamente o espaçador de politetrafluoretileno (PTFE) usando o parafuso espaçador na parte superior do rotor.
  8. Coloque o rotor, com a tampa voltada para baixo, em um êmbolo do rotor53 e mergulhe o rotor em nitrogênio líquido. Aguarde pelo menos 30-60 s para que o rotor e a amostra congelem.
  9. Inicie a unidade do trocador de calor e resfrie a sonda DNP a ~ 90K.
  10. Defina a unidade MAS para o modo Manual e defina a temperatura variável (VT) para 135 l/h e os fluxos de gás de rolamento e acionamento para ~6 l/h.
  11. Ative Ejetar no console do MAS.
  12. Transfira a amostra congelada da Etapa 7.8 do líquido N2 para o coletor de amostras e coloque-a na sonda (consulte também a referência53).
  13. Aumente manualmente a pressão do rolamento da sonda (Bp) para ~500 mbar antes de engatar o "Insert". Isso é aconselhável para uma rotação estável e segura do rotor.
  14. Aumentar a taxa de MAS para o valor desejado utilizando o procedimento descrito na referência53.
  15. Verifique se há aprimoramentos de DNP com e sem microondas usando experimentos 1D CP padrão (veja também, por exemplo, referência51,54) (Figura 7) antes de prosseguir com experimentos multidimensionais, por exemplo, experimentos CC 2D descritos na seção 3 deste artigo.

Resultados

A Figura 2 mostra géis representativos para a pureza do corpo de inclusão (Painel A) e redobramento dos corpos de inclusão (Painel B3). A Figura 2 confirma a purificação bem-sucedida de BamA-P4P5 marcado com 13 C,15N.

A Figura 3A mostra um espectro 2D 13 C-13C típico de uma proteína de membrana bem ordenada, e a

Discussão

As proteínas de membrana são atores-chave na regulação das funções celulares vitais em organismos procarióticos e eucarióticos; Assim, entender seus mecanismos de ação em níveis atômicos de resolução é de vital importância. As técnicas de biologia estrutural existentes levaram muito longe a compreensão científica das proteínas de membrana, mas dependeram fortemente de dados experimentais coletados de sistemas in vitro desprovidos de membranas. Neste artigo, é apresen...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho faz parte dos programas de pesquisa ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI e VIDI com os números de projeto 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 e 718.015.00, que são financiados pelo Conselho Holandês de Pesquisa (NWO). Este artigo foi apoiado pelo iNEXT-Discovery (número do projeto 871037).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium molibdateMerck277908
Ammonium-15N ChlorideCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonaseEMD Millipore Corp70746-3
Boric acidMerckB6768
bromophenol blueSigmaB0126
calcium dichlorideMerck499609
Choline chlorideSigmaC-1879
Cobalt chlorideMerck449776
Copper sulphateMerckC1297
D-BiotinMerck8512090025
Deuterium OxideCortecnetCD5251P1000
Dimethyl sulfoxideMerckD9170
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichL6876
Folic acidSigmaF-7876
Glucose 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlycerolHoneywellG7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)HoneywellG7757-1L
GlycineSigma Aldrich50046
Guanidine hydrochlorideRoth CarlNR.0037.1
Iron sulphateMerck307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideThermofisherR0392
Lysogeny BrothMerckL3022
LysozymeSigma AldrichL6876
Magnesium chloride - hexahydrateFluka63064
magnesium sulphateMerckM5921
monopotassium phosphateMerck1051080050
MyoinositolSigmaI-5125
n-Dodecyl-B-D-maltosideAcros Organics3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxideMerck40236
NicatinamideSigmaN-3376
Panthotenic acidSigma21210-25G-F
protease inhibitorSigmaP8849
Pyridoxal-HClSigma AldrichP9130
RiboflavinAldrichR170-6
Sodium ChlorideMerckK51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrateSigma Aldrich1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfateThermo-scientific28365
Sodium hydroxideMerck1,06,49,81,000
SucroseSigma Life ScienceS9378
Thiamine-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
Zinc chlorideMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1.5 mL Ultra-tubesBeckman Coulter357448
30 kDa centrifugal filterAmiconUFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with capsCortecnetH13861
3.2 mm teflon insertCortecnetB6628
3.2 mm sample packer/unpackerCortecnetB6988
3.2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotorCortecnetHZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotorCortecnetB136904
1.3 mm MAS rotor + capsCortecnetHZ14752
1.3 mm filling toolCortecnetHZ14714
1.3 mm sample packerCortecnetHZ14716
1.3 mm cap removerCortecnetHZ14706
1.3 mm cap set toolCortecnetHZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie - BlackMerckHS15094

Referências

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