JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt robuste grundlegende Routinen, wie isotopenmarkierte Membranproteinproben präpariert und mit modernen Festkörper-NMR-Spektroskopiemethoden hochauflösend analysiert werden können.

Zusammenfassung

Membranproteine sind für die Zellfunktion lebenswichtig und stellen daher wichtige Angriffspunkte für Medikamente dar. Die Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie (ssNMR) bietet einen einzigartigen Zugang, um die Struktur und Dynamik solcher Proteine in biologischen Membranen zunehmender Komplexität zu untersuchen. Hier stellen wir die moderne Festkörper-NMR-Spektroskopie als Werkzeug vor, um die Struktur und Dynamik von Proteinen in natürlichen Lipidmembranen und auf atomarer Skala zu untersuchen. Solche spektroskopischen Untersuchungen profitieren von der Verwendung hochempfindlicher ssNMR-Methoden, d.h. proton-(1H)-detektierter ssNMR und DNP (Dynamic Nuclear Polarization) unterstützter ssNMR. Unter Verwendung des bakteriellen Beta-Fass-Proteins BamA und des Ionenkanals KcsA stellen wir Methoden zur Herstellung isotopenmarkierter Membranproteine und zur Ableitung von Struktur- und Bewegungsinformationen mittels ssNMR vor.

Einleitung

Struktur- und Bewegungsstudien von Membranproteinen in physiologisch relevanten Umgebungen stellen eine Herausforderung für traditionelle strukturbiologische Technikendar 1. Moderne Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie (ssNMR)-Methoden bieten einen einzigartigen Ansatz für die Charakterisierung von Membranproteinen 2,3,4,5,6,7 und werden seit langem zur Untersuchung von Membranproteinen eingesetzt, einschließlich membraneingebetteter Proteinpumpen8, Kanäle 9,10,11 oder Rezeptoren 12,13,14,15. Technische Fortschritte wie ultrahohe Magnetfelder >1.000 MHz, schnelle Drehfrequenzen mit magischen Winkeln >100 kHz und Hyperpolarisationstechniken16 haben die ssNMR als leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Membranproteinen in Umgebungen mit ständig zunehmender Komplexität etabliert, von Liposomen über Zellmembranen bis hin zu ganzen Zellen. Zum Beispiel ist DNP zu einem leistungsfähigen Werkzeug für solche Experimente geworden (siehe Referenz 17,18,19,20,21,22,23,24,25). In jüngerer Zeit bietet die 1H-detektierte ssNMR zunehmend Möglichkeiten, Membranproteine mit hoher spektraler Auflösung und Empfindlichkeit zu untersuchen 25,26,27,28,29. Diese Arbeit beleuchtet zwei bakterielle Membranproteine, die an essentiellen Funktionen beteiligt sind, d.h. an der Proteininsertion und dem Ionentransport. Die entsprechenden Proteine, BamA 25,30,31,32,33 und KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (oder chimäre Varianten davon 10,40) wurden mittels ssNMR untersucht Methoden seit mehr als einem Jahrzehnt.

Ein repräsentatives Protokoll für die Aufbereitung und ssNMR-Charakterisierung von Membranproteinen bakteriellen Ursprungs wird hier vorgestellt. Die verschiedenen Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1 dargestellt. Zunächst wird die Expression, Isotopenmarkierung, Reinigung und Membranrekonstitution von BamA erläutert. Anschließend wird ein allgemeiner Arbeitsablauf für die Charakterisierung des Membranproteins mittels ssNMR vorgestellt; insbesondere die Zuweisung von Membranprotein-Rückgraten mittels 1H-detektierter ssNMR bei schnellem Magic Angle Spining. Schließlich werden der grundlegende Aufbau und die Erfassung von Experimenten, die die dynamische Kernpolarisation (DNP) unterstützen und die Empfindlichkeit des ssNMR-Signals signifikant erhöhen, detailliert beschrieben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Herstellung von einheitlich gekennzeichnetem BamA-P4P5 mit 2H, 13C, 15N gekennzeichnetem BamA-P4P5

HINWEIS: Während dieses Protokoll die Arbeit mit nicht-pathogenen gramnegativen Bakterien erfordert, ist die Einhaltung grundlegender biologischer Sicherheitsverfahren ein Muss, nämlich das Tragen von Schutzbrille, Laborkitteln, Handschuhen und die Befolgung institutioneller Standardarbeitsanweisungen für die Arbeit mit Mikroorganismen.

  1. Es wird eine einzelne Kolonie von E. coli BL 21 Star (DE3) verwendet, die das für E. coli BamA-P4P5 kodierende Plasmid pET11aΔssYaeT enthält, um 50 ml Lysogenese-Bouillon zu impfen, die mit 50 μg/l Ampicillin ergänzt ist.
  2. Wachsen Sie die Kultur bei 37 °C bei 200 U/min, bis ein OD600 von 0,6 erreicht ist. Bei 2.000 x g für 10 min schleudern. Das Pellet wird in 50 ml M9 (siehe Tabelle 1) auf einen maximalen OD600 von 0,1 resuspendiert.
    HINWEIS: Alle zukünftigen Wachstumsschritte finden unter den oben genannten Bedingungen statt, sofern nicht anders angegeben.
  3. Vergrößern Sie die Kultur bis zu OD600 von 0,5. Bei 2.000 x g 10 min bei Raumtemperatur schleudern. Das Pellet wird in 50 ml M9 mit einem Gehalt von 90 % D2O (Rezeptur siehe Tabelle 1 ) auf einen maximalen OD600 von 0,1 resuspendiert. Lass die Kultur über Nacht bei 30 °C bei 200 U/min wachsen.
  4. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Das Pellet in den vorgewärmten 50 mL 90 % D2O M9 auf einen maximalen OD600 von 0,1 resuspendieren. Wachsen, bis ein OD600 von 1,0 erreicht ist.
  5. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Bereiten Sie 100 ml 100%igesD2O M9-Medium mit isotopenangereicherten Mengen an nicht angereicherter Glukose und Ammoniumchlorid vor. Resuspendieren Sie in 100 % D2O M9 Medium bis zu einem maximalen OD600 von 0,1. Wachsen, bis ein OD600 von 0,7 erreicht ist.
  6. Schleudern Sie die Kultur bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur herunter. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 500 ml 100 % D2O M9-Medium mit Isotopen (siehe Tabelle 1) bis zu einem Maximum OD600 von 0,1 resuspendiert.
  7. Lassen Sie die Kultur wachsen, bis ein OD600 von 0,6-0,9 erreicht ist. Induzieren Sie mit 1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG). 4 h exprimieren und Zellen bei 4.000 x g für 15 min bei Raumtemperatur ernten.

2. Reinigung, Wiederfaltung und Bildung von BamA-P4P5-Proteo-Liposomen

HINWEIS: Alle Schritte dieses Abschnitts sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Besondere Vorsicht ist geboten beim Öffnen der Röhrchen nach der Zentrifugation zur Begrenzung schädlicher Aerosole.

  1. Tauen Sie das Pellet auf Eis auf. Das Pellet wird in 20 ml kaltem Puffer 1 resuspendiert. Siehe Tabelle 2 für die Puffer.
  2. Schleudern Sie die Lösung bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunter. Das Pellet wird in 20 ml kalt destilliertem H2O resuspendiert. Die Suspension wird 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.
  3. Die Suspension bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. In 10 mL kaltem Puffer 2 resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren lassen.
  4. Ergänzen Sie die Mischung mit weiteren 10 mL kaltem Puffer 2 und inkubieren Sie weitere 30 Minuten auf Eis. 0,5 % n-Dodecyl-B-D-Maltosid (DDM) zugeben und vorsichtig schwenken.
  5. Die Probe wird auf Eis bei 13 kHz beschallt, bis sie 10 s lange Ein-/Aus-Impulse auslöst. Bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C runterschleudern. Dreimal mit 20 ml Puffer 3 waschen. Zentrifugieren Sie bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C.
  6. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 mL Puffer 4. Bei 37 °C 30 min inkubieren. Die Probe wird auf Eis bei 13 kHz beschallt, bis 10 s lange Ein-/Aus-Impulse abgegeben werden.
  7. Die Probe bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. Die Schritte 2.4 bis 2.6 werden unter Wegfall der Zugabe des Proteaseinhibitors und der Inkubation bei 37 °C wiederholt.
  8. Waschen Sie das Pellet mit 20 mL Wasser und zweimal mit Buffer 3. Bei 25.000 x g für 20 min bei 4 °C runterschleudern. Aliquotieren Sie die Suspension in 1 mL Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen 20 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit auf einer Tischzentrifuge. Die Reinheit des Einschlusskörpers wird anhand von 10 % SDS-Page-Gel bewertet, siehe Abbildung 2A. Die erwartete Ausbeute für gereinigtes BamA-P4P5 dreifach (2 H,13 C,15N) beträgt 30 mg/L.
  9. Solubilisieren Sie Einschlusskörper in 200 μl Puffer 5 und 300 μl H2O. Fügen Sie 6M Guanidiumchlorid (GdnCl) hinzu. Stellen Sie das Volumen des Mikrozentrifugenröhrchens auf 1 ml mit H2O ein. Wirbeln Sie die Mischung vor und inkubieren Sie sie 4 h lang bei Raumtemperatur. Wirbeln Sie die Mikrozentrifugenröhrchen regelmäßig (alle 30 min) durch.
  10. Bei 100.000 x g 1 h bei 4 °C schleudern. Verwenden Sie das Beer-Lambertsche Gesetz, um die Proteinkonzentration um 280 nm zu bestimmen. Der molare Extinktionskoeffizient beträgt 117.120 M-1 cm-1. Bei einer Konzentration von >100 μM mit 1x Puffer 5 mit 6 M GdnCl verdünnen. Das Protein in Puffer 6 schnell 10x verdünnen. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Ultrazentrifugation 1,5-ml-Röhrchen in Ultrazentrifugationsqualität.
  11. Bestimmen Sie die Rückfaltungseffizienz mit einem semi-nativen SDS-Page-Gel. Nehmen Sie zwei 10-μl-Aliquote aus Schritt 2.10 und fügen Sie jedem Aliquot 10 μl Lameili-Puffer (Puffer 8) hinzu. Eine Probe 10 Minuten lang bei 95 °C kochen; Lassen Sie das andere Aliquot auf Eis. Anschließend führen Sie beide Proben bei 14 mA auf einem 10%igen SDS-Page-Gel durch. Den Stapel- und Laufteilen der Gele fehlen Reduktionsmittel und SDS. Die Proteinfärbung wird mit dem Coomassie-Farbstoff erreicht. Die erwarteten Ergebnisse sind in Abbildung 2B dargestellt.
  12. Die Probe bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C herunterschleudern. Konzentrieren Sie die Probe mit einem 30-kDa-Zentrifugalfilter auf ein Arbeitsvolumen von 8 mL. Schleudern Sie die Probe bei 4.000 x g für 20 min bei 4 °C. Messen Sie die Proteinabsorption bei 280 nm. Bestimmen Sie wie in Schritt 2.10 die Proteinkonzentration.
  13. Berechnen Sie die Menge an Lipiden, die für ein Lipid-Protein-Verhältnis von 10:1 (LPR-mol/mol) erforderlich ist. Aus einem Chloroform-Stamm wird die erforderliche Menge an Lipiden, wie in Schritt 2.12 berechnet, in einen 100-ml-Rundkolben (RBF) gegeben. Evakuieren Sie das Chloroform aus dem RBF unter einem sanften Stickstoffstrahl. RBF für 3 h auf Hochvakuum stellen. Hydratisieren Sie den Lipidfilm mit 1 mL Puffer 7. RBF 10 min bei 37 °C inkubieren.
  14. Geben Sie die Proteinmischung (aus Schritt 2.12) in den RBF.
  15. Das Protein-Lipid-Gemisch (aus Schritt 2.14) wird auf das Endvolumen von 50 ml in der RBF verdünnt. Puffer 7 mit 1x Proteaseinhibitor, gelöst in DMSO, verwenden und 30 min bei 37 °C inkubieren.
  16. Dialysieren Sie 2 Wochen lang gegen 100 Volumina Puffer 7 (verwenden Sie einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von 12-14 kDa). In den ersten 24 Stunden ist die Dialyse bei Raumtemperatur unter Zugabe von frischem Buffer 7 alle 8 Stunden durchzuführen. Wechseln Sie danach den Puffer einmal täglich und führen Sie die Dialyse bei 4 °C durch.

3. Befüllen des ssNMR-Rotors

  1. Nach Schritt 2.16 30-60 min bei 10.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, so dass ein Pellet entsteht. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
    HINWEIS: Die unten beschriebene Technik wurde für einen 3,2-mm-Rotor optimiert, ist aber für fast jeden Rotordurchmesser anwendbar.
  2. Pipettieren Sie die Probe in den Rotor und schleudern Sie sie vorsichtig mit einer Tischzentrifuge nach unten.
    HINWEIS: Abhängig von der Konsistenz der Probe kann entweder ein Verdichtungswerkzeug verwendet werden, um die Probe zu verdichten, oder ein Spatel anstelle einer Pipette, um die Probe in den Rotor zu geben.
  3. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3x, bis der Rotor auf die richtige Höhe gefüllt ist, und prüfen Sie, ob noch genügend Platz für die Kappe vorhanden ist, wie durch die Markierungslinie auf dem Verdichtungswerkzeug angezeigt. Schließen Sie den Rotor mit dem Kappenpositionierungswerkzeug auf einer ebenen Fläche. Markieren Sie die Hälfte der Unterkante des Rotors.
    HINWEIS: Neue ssNMR-Rotorgenerationen sind mit einer dauerhaften Lasermarkierung am unteren Rand zur optischen Erfassung der Rotordrehfrequenz ausgestattet. Andernfalls wird die Verwendung eines Edding-Stifts empfohlen; da der MAS-Detektor speziell für Sharpie-Tinte optimiert wurde.
  4. Überprüfen Sie mit einer Lupe, ob die Kappe gut platziert ist.

4. Probencharakterisierung mittels 2D 13C- 13C ssNMR-Spektroskopie

  1. Setzen Sie den Rotor mit der automatischen Drehroutine der MAS-Einheit in den Magneten ein, drehen Sie die Probe auf die gewünschte MAS-Frequenz zwischen 10 und 20 kHz MAS, während Sie die Probe auf die eingestellte Temperatur von 270 K abkühlen. Stimmen Sie die Kanäle 1H und 13C ab.
    ANMERKUNG: Bei der Wahl der MAS-Frequenz ist zu vermeiden, dass der chemische Verschiebungsabstand zwischen dem spektralen Cα-Bereich und dem Carbonylkohlenstoffbereich versehentlich an die Spinnfrequenz angepasst wird, d. h. die Rotationsresonanzbedingung erster Ordnung41 ist zu vermeiden.
  2. Optimieren Sie ein1 H-13C Kreuzpolarisation42 (CP) Experiment, indem Sie die HF-Leistung auf dem Protonenkanal von 25-80 kHz variieren. Typische Parameter sind 45 kHz HF-Leistung bei 13C, 80-100 kHz heteronukleare 1H-Entkopplung43 während der Erfassung, 1,8-2,0 s Recycle-Verzögerung und 64 Scans.
    1. Optimieren Sie die CP-Kontaktzeit für maximale Signalempfindlichkeit an den aliphatischen Kohlenstoffen.
    2. Bestimmen Sie 1H 90° Pulslänge im 13C-CP Experiment, indem Sie den Startimpuls mit vier multiplizieren, d.h. einen 360° Puls optimieren, und variieren Sie die Länge, bis das Signal verschwunden ist. Fügen Sie direkt nach dem CP-Transfer einen Rechteckpuls hinzu und optimieren Sie die 13C 90° Pulslänge analog.
  3. Führen Sie ein 2D-13 C-13C Protonengetriebenes Spindiffusionsexperiment (PDSD) wie PARIS mit einer Magnetisierungstransferzeit von 30 ms durch, um Korrelationen innerhalb der Reste zu erkennen und die Probenqualität zu messen. Übertragen Sie die Leistungspegel, die Kontaktzeit und die 90°-Pulslängen aus dem zuvor optimierten 13C-CP-Experiment. Verwenden Sie eine Erfassungszeit von 4-6 ms in der indirekten Dimension. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) oder, für unempfindliche Proben, mit exponentieller Linienverbreiterung in beiden Dimensionen.
  4. Extrahieren Sie Schichten isolierter Querpeaks und bestimmen Sie die Linienbreite in halben Höhen. Eine Linienbreite zwischen ~0,3 und 1,0 13C ppm ist ein Hinweis auf eine gut geordnete Probe, ideal für die ssNMR-Charakterisierung, während eine Linienbreite über 1,0 13C ppm auf eine Konformationsheterogenität hinweist, die die ssNMR-Charakterisierung beeinträchtigen kann. Das in Abbildung 3A gezeigte 2D CC PARIS-Spektrum von BamA ist ein Beispiel für ein wohlgeordnetes Protein, das qualitativ hochwertige Spektren liefert.

5. Zuweisung des Rückgrats durch 1H-detektierte 3D-ssNMR-Spektroskopie

  1. Erfassung von spektralen 2D-NH-Fingerabdrücken
    1. Füllen Sie die Probe in einen 1,3-mm-Rotor, wie oben beschrieben. Setzen Sie den Rotor in den Magneten ein, drehen Sie die Probe auf 10-20 kHz MAS und kühlen Sie die Probe auf die eingestellte Temperatur von 240-250 K oder niedriger ab, abhängig von den Spezifikationen des ssNMR-Sondenkopfes. Verwenden Sie die MAS-Einheitenschnittstelle, um die MAS-Frequenz schrittweise in Schritten von 5 kHz bis 60 kHz MAS zu erhöhen.
    2. Optimieren Sie die CP-Amplituden, Kontaktzeiten und 90°-Pulslängen in 13C- und 15N CP-Experimenten. Verwenden Sie Amplituden um 30-50 oder 70-100 kHz auf den heteronuklearen Kanälen und variieren Sie die Amplitude auf dem 1H-Kanal von 80-180 kHz. Verwenden Sie eine Recyclingverzögerung von 0,7 bis 1,2 s zusammen mit einer heteronuklearen Protonenentkopplung von 15 kHz44 mit geringer Leistung. Siehe auch Referenz45 für weitere praktische Details zum Einrichten von CP ssNMR-Experimenten.
    3. Erfassen Sie ein 2D-NH-Experiment, um die1-H-Auflösung zu messen. Übertragen Sie die 15N-CP-Parameter und verwenden Sie eine Erfassungszeit von ca. 15 und 25 ms in den direkten und indirekten Dimensionen. Für die erste Übertragung von 1H auf 15N CP ist die zuvor optimierte Kontaktzeit zu nutzen. Für den Rücktransfer von 15N auf 1H ist eine Kontaktzeit von 0,7 bis 1,0 ms zu verwenden, um die Übertragung der Magnetisierung zwischen den Resten zu minimieren.
    4. Verwenden Sie 50-250 ms Wasser MISSISSIPPI Suppression46, abhängig vom Wassergehalt der Probe. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in beiden Dimensionen. Extrahieren Sie Schichten isolierter Querpeaks und bestimmen Sie die Linienbreite in halben Höhen. Ein Beispiel für ein hochwertiges 2D-NH-Spektrum25 ist für membraneingebettetes BamA-P4P5 in Figur 3B dargestellt.
  2. Backbone-Zuweisungen
    1. Optimierung eines 1D-CP-Experiments mit 15N bis 13Cα47. Platzieren Sie den 13-C-Träger in der Mitte des Cα-Bereichs bei etwa 55 ppm. Verwenden Sie eine 13C HF-Amplitude von 20 kHz und variieren Sie die 15N-Amplitude von 35 bis 45 kHz für eine maximale Übertragung auf die Cα-Signale und eine minimale Übertragung auf die Carbonylsignale. Optimieren Sie die Kontaktzeit von 3 bis 10 ms in Schritten von 1 ms.
    2. Führen Sie ein 3D-CαNH-Experiment durch. Übertragen Sie alle CP-Amplituden, Kontaktzeiten und Pulslängen aus den zuvor optimierten Schritten. Verwenden Sie ca. 10 ms und 30 ms in den Dimensionen indirekte und direkte Erfassung. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in allen drei Dimensionen.
    3. Optimierung eines 1D-Cα-zu-CO-DREAM-Magnetisierungstransfers48. Beginnen Sie mit einem spezifischen CP-Transfer von 15N auf 13Cα. Übertragen Sie dann die Magnetisierung von Cα auf CO mit Hilfe einer Spinsperre auf dem 13C-Kanal. Variieren Sie die HF-Amplitude von 20 bis 35 kHz für eine optimale Übertragung. Optimieren Sie die Übertragungszeit von 4 auf 10 ms.
    4. Führen Sie ein 3D-Cα(CO)NH-Experiment durch. Übertragen Sie alle HF-Amplituden, Kontaktzeiten und Impulslängen aus den zuvor optimierten Schritten. Verwenden Sie ca. 10 ms und 30 ms in den Dimensionen indirekte und direkte Erfassung. Verarbeiten Sie das Spektrum mit quadrierten Sündenglockenfunktionen (QSIN) in allen drei Dimensionen.
    5. Wiederholen und adaptieren Sie die Schritte 1-4 für die analogen 3D-CONH- und CO(Cα)NH-Experimente. Verwenden Sie dieses Quartett von 3D-Experimenten für sequentielle Cα- und CO-Walks, um das Proteinrückgrat zuzuweisen, wie am Beispiel von KcsA in Abbildung 428 gezeigt.

6. Proteindynamik durch 1H-detektierte ssNMR-Spektroskopie

  1. Verwenden Sie für 15N T1-Studien das zuvor optimierte 2D-NH-Experiment bei 60 kHz MAS und fügen Sie eine Verzögerung nach dem ersten Kreuzpolarisationsschritt von 1H auf 15N hinzu. Erfassen Sie eine Reihe von 2D-NH-Experimenten und variieren Sie die Verzögerung von 0 bis 16 s in Schritten von z. B. 0, 2, 4, 8 und 16 s.
  2. Plotten Sie die normierten Intensitäten für aufgelöste Signale als Funktion der zunehmenden Verzögerungszeit. Passen Sie den Zerfall von T1 an einzelne Exponentielle gemäß y = exp(-x/T1) an, wobei y die Signalintensität zur Abklingzeit x ist.
  3. Analog dazu ist für 15N T1rho-Studien ein Spin-Lock-Impuls in das Pulsprogramm auf dem 15N-Kanal mit einer HF-Amplitude zwischen 15 und 20 kHz nach dem ersten 1H bis 15N Kreuzpolarisationsschritt26,49 aufzunehmen. Erfassen Sie eine Reihe von 2D-NH-Experimenten, variieren Sie die Verzögerung von 0 bis 150 ms und passen Sie denT1rho-Zerfall aufgelöster Signale an einzelne Exponentiale an. Illustrative 15N T1rho-Daten sind für membraneingebettete K+-Kanäle in Abbildung 527,28 dargestellt.

7. Dynamische Kernpolarisation

HINWEIS: Die folgenden vorbereitenden Schritte beziehen sich auf die Verwendung eines kommerziellen DNP-Setups mit 3,2-mm-Saphir-MAS-Rotoren (Abbildung 6)20. Die Verwendung von Zirkonoxid-Rotoren oder anderen DNP-Geräten kann zu einer geringeren DNP-Signalverbesserung führen.

  1. Resuspendieren Sie das Membranproteinpellet (aus Schritt 3.1) in 50 μl deuteriertem DNP-Puffer (60 % (v/v) deuteriertes d8- und Glycerin und 15 mM AMUPol50. Für Experimente bei 800 MHz empfehlen wir die Verwendung von 10 mM NATriPOL-351. Siehe auch Referenz52 für weitere praktische Aspekte zu DNP ssNMR-Experimenten.
  2. 10-20 min bei 100.000 x g bei 4 °C zentrifugieren, so dass ein Pellet entsteht. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
  3. Kühle den Zentrifugaladapter und die 3,2 mm Saphir-MAS-Rotorkomponenten auf <4 °C vor. Die folgenden Schritte (7.4-7.7) müssen so schnell wie möglich ausgeführt werden, um zu verhindern, dass die DNP-Agenten reduziert werden.
  4. Setzen Sie den 3,2 mm Saphirrotor in den Zentrifugenadapter ein und befüllen Sie ihn mit der Suspension der Proteo-Liposomen aus Schritt 7.2.
  5. Pipettieren Sie die resuspendierte Membranproteinprobe vorsichtig mit einer 200-μl-Pipettenspitze gegen die Innenwand des Rotors. Lassen Sie die Lösung bis zum Boden des Rotors gleiten. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen bilden.
  6. Schleudern Sie die Probe im Rotor 5-10 Minuten lang bei 4.500 x g bei 4 °C herunter. Entfernen Sie den Überstand mit überschüssigem DNP-Saft, indem Sie ihn vorsichtig herauspipettieren, ohne das Zellpellet zu beschädigen. Wiederholen Sie die Schritte 6.4-6.6, bis der Rotor voll ist.
  7. Positionieren Sie den Abstandhalter aus Polytetrafluorethylen (PTFE) vorsichtig mit der Distanzschraube oben auf dem Rotor.
  8. Setzen Sie den Rotor mit der Kappe nach unten in einen Rotorkolben53 und tauchen Sie den Rotor in flüssigen Stickstoff. Lassen Sie den Rotor und die Probe mindestens 30-60 s einfrieren.
  9. Starten Sie die Wärmetauschereinheit und kühlen Sie die DNP-Sonde auf ~90 K ab.
  10. Stellen Sie das MAS-Gerät auf den manuellen Modus und stellen Sie die variable Temperatur (VT) auf 135 l/h und den Gasfluss in Lager und Antrieb auf ~6 l/h ein.
  11. Aktivieren Sie Eject auf der MAS-Konsole.
  12. Übertragen Sie die gefrorene Probe aus Schritt 7.8 aus der Flüssigkeit N2 in den Probenfänger und legen Sie sie in die Sonde (siehe auch Referenz53).
  13. Erhöhen Sie den Sondenlagerdruck (Bp) manuell auf ~500 mbar, bevor Sie den "Einsatz" einrasten. Dies ist für ein stabiles und sicheres Drehen des Rotors ratsam.
  14. Erhöhen Sie die MAS-Rate auf den gewünschten Wert mit dem in Referenz53 beschriebenen Verfahren.
  15. Überprüfen Sie, ob DNP-Erweiterungen mit und ohne Mikrowellen unter Verwendung von Standard-1D-CP-Experimenten (siehe auch z. B. Referenz51,54) (Abbildung 7) durchgeführt werden, bevor Sie mit mehrdimensionalen Experimenten fortfahren, z. B. 2D-CC-Experimente, die in Abschnitt 3 dieses Artikels beschrieben werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Gele für die Reinheit des Einschlusskörpers (Panel A) und die Rückfaltung von Einschlusskörpern (Panel B3). Abbildung 2 bestätigt die erfolgreiche Aufreinigung von 13 C,15N-markiertem BamA-P4P5.

Figur 3A zeigt ein typisches 2D 13 C-13C Spektrum eines wohlgeordneten Membranproteins, und

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Membranproteine spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation lebenswichtiger zellulärer Funktionen sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen. Daher ist das Verständnis ihrer Wirkmechanismen auf atomarer Auflösungsebene von entscheidender Bedeutung. Die bestehenden strukturbiologischen Techniken haben das wissenschaftliche Verständnis von Membranproteinen ziemlich weit vorangetrieben, sich aber stark auf experimentelle Daten gestützt, die von In-vitro-Systeme...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit ist Teil der Forschungsprogramme ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI und VIDI mit den Projektnummern 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 und 718.015.00, die vom Niederländischen Forschungsrat (NWO) finanziert werden. Dieser Artikel wurde unterstützt von iNEXT-Discovery (Projektnummer 871037).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium molibdateMerck277908
Ammonium-15N ChlorideCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonaseEMD Millipore Corp70746-3
Boric acidMerckB6768
bromophenol blueSigmaB0126
calcium dichlorideMerck499609
Choline chlorideSigmaC-1879
Cobalt chlorideMerck449776
Copper sulphateMerckC1297
D-BiotinMerck8512090025
Deuterium OxideCortecnetCD5251P1000
Dimethyl sulfoxideMerckD9170
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichL6876
Folic acidSigmaF-7876
Glucose 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlycerolHoneywellG7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)HoneywellG7757-1L
GlycineSigma Aldrich50046
Guanidine hydrochlorideRoth CarlNR.0037.1
Iron sulphateMerck307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideThermofisherR0392
Lysogeny BrothMerckL3022
LysozymeSigma AldrichL6876
Magnesium chloride - hexahydrateFluka63064
magnesium sulphateMerckM5921
monopotassium phosphateMerck1051080050
MyoinositolSigmaI-5125
n-Dodecyl-B-D-maltosideAcros Organics3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxideMerck40236
NicatinamideSigmaN-3376
Panthotenic acidSigma21210-25G-F
protease inhibitorSigmaP8849
Pyridoxal-HClSigma AldrichP9130
RiboflavinAldrichR170-6
Sodium ChlorideMerckK51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrateSigma Aldrich1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfateThermo-scientific28365
Sodium hydroxideMerck1,06,49,81,000
SucroseSigma Life ScienceS9378
Thiamine-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
Zinc chlorideMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1.5 mL Ultra-tubesBeckman Coulter357448
30 kDa centrifugal filterAmiconUFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with capsCortecnetH13861
3.2 mm teflon insertCortecnetB6628
3.2 mm sample packer/unpackerCortecnetB6988
3.2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotorCortecnetHZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotorCortecnetB136904
1.3 mm MAS rotor + capsCortecnetHZ14752
1.3 mm filling toolCortecnetHZ14714
1.3 mm sample packerCortecnetHZ14716
1.3 mm cap removerCortecnetHZ14706
1.3 mm cap set toolCortecnetHZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie - BlackMerckHS15094

Referenzen

  1. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  2. Kaplan, M., Pinto, C., Houben, K., Baldus, M. Nuclear magnetic resonance (NMR) applied to membrane-protein complexes. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 15(2016).
  3. Brown, L. S., Ladizhansky, V. Membrane proteins in their native habitat as seen by solid-state NMR spectroscopy. Protein Science. 24 (9), 1333-1346 (2015).
  4. Ladizhansky, V. Applications of solid-state NMR to membrane proteins. Biochimica Et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics. 1865 (11), Pt B 1577-1586 (2017).
  5. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. H. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 1-24 (2012).
  6. Shahid, S. A., et al. Membrane-protein structure determination by solid-state NMR spectroscopy of microcrystals. Nature Methods. 9 (12), 1212-1217 (2012).
  7. Wang, S. L., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nature Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  8. Herzfeld, J., Lansing, J. C. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31 (1), 73-95 (2002).
  9. Ketchem, R. R., Hu, W., Cross, T. A. High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid-state NMR. Science. 261 (5127), 1457-1460 (1993).
  10. Lange, A., et al. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR. Nature. 440 (7086), 959-962 (2006).
  11. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  12. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  13. Luca, S., et al. The conformation of neurotensin bound to its G protein-coupled receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10706-10711 (2003).
  14. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14 (3), 284-290 (2018).
  15. Krug, U., et al. The conformational equilibrium of the neuropeptide Y2 receptor in bilayer membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 59 (52), 23854-23861 (2020).
  16. Maly, T., et al. Dynamic nuclear polarization at high magnetic fields. Journal of Chemical Physics. 128 (5), (2008).
  17. Bajaj, V. S., Mak-Jurkauskas, M. L., Belenky, M., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Functional and shunt states of bacteriorhodopsin resolved by 250 GHz dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9244-9249 (2009).
  18. Linden, A. H., et al. Neurotoxin II bound to acetylcholine receptors in native membranes studied by dynamic nuclear polarization NMR. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19266-19269 (2011).
  19. Ong, Y. S., Lakatos, A., Becker-Baldus, J., Pos, K. M., Glaubitz, C. Detecting substrates bound to the secondary multidrug efflux pump EmrE by DNP-enhanced solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15754-15762 (2013).
  20. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  21. Becker-Baldus, J., et al. Enlightening the photoactive site of channelrhodopsin-2 by DNP-enhanced solid-state NMR spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), 9896-9901 (2015).
  22. Kaplan, M., et al. EGFR dynamics change during activation in native membranes as revealed by NMR. Cell. 167 (5), 1241-1251 (2016).
  23. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K+ channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  24. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14, 284(2018).
  25. Pinto, C., et al. Formation of the beta-barrel assembly machinery complex in lipid bilayers as seen by solid-state NMR. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Good, D. B., et al. Conformational dynamics of a seven transmembrane helical protein Anabaena Sensory Rhodopsin probed by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (7), 2833-2842 (2014).
  27. Medeiros-Silva, J., et al. (1)H-detected solid-state NMR studies of water-inaccessible proteins in vitro and in situ. Angewandte Chemie (International Edition in English). 55 (43), 13606-13610 (2016).
  28. Jekhmane, S., et al. Shifts in the selectivity filter dynamics cause modal gating in K(+) channels. Nature Communications. 10 (1), 123(2019).
  29. Schubeis, T., Le Marchand, T., Andreas, L. B., Pintacuda, G. 1H magic-angle spinning NMR evolves as a powerful new tool for membrane proteins. Journal of Magnetic Resonance. 287, 140-152 (2018).
  30. Sinnige, T., et al. Solid-state NMR studies of full-length BamA in lipid bilayers suggest limited overall POTRA mobility. Journal of Molecular Biology. 426 (9), 2009-2021 (2014).
  31. Sinnige, T., et al. Insight into the conformational stability of membrane-embedded BamA using a combined solution and solid-state NMR approach. Journal of Biomolecular NMR. 61 (3-4), 321-332 (2015).
  32. Sinnige, T., et al. Conformational plasticity of the POTRA 5 domain in the outer membrane protein assembly factor BamA. Structure. 23 (7), 1317-1324 (2015).
  33. Renault, M., Bos, M. P., Tommassen, J., Baldus, M. Solid-state NMR on a large multidomain integral membrane protein: the outer membrane protein assembly factor BamA. Journal of the American Chemical Society. 133 (12), 4175-4177 (2011).
  34. Doyle, D. A., et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280 (5360), 69-77 (1998).
  35. Wylie, B. J., Bhate, M. P., McDermott, A. E. Transmembrane allosteric coupling of the gates in a potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 185-190 (2014).
  36. Xu, Y., Zhang, D., Rogawski, R., Nimigean, C. M., McDermott, A. E. Identifying coupled clusters of allostery participants through chemical shift perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2078-2085 (2019).
  37. vander Cruijsen, E. A. W., Prokofyev, A. V., Pongs, O., Baldus, M. Probing conformational changes during the gating cycle of a potassium channel in lipid bilayers. Biophysical Journal. 112 (1), 99-108 (2017).
  38. Varga, K., Tian, L., McDermott, A. E. Solid-state NMR study and assignments of the KcsA potassium ion channel of S. lividans. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (12), 1604-1613 (2007).
  39. Zhang, D., Howarth, G. S., Parkin, L. A., McDermott, A. E. NMR studies of lipid regulation of the K+ channel KcsA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. , 183491(2020).
  40. Schneider, R., et al. Solid-state NMR spectroscopy applied to a chimeric potassium channel in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (23), 7427-7435 (2008).
  41. Raleigh, D. P., Levitt, M. H., Griffin, R. G. Rotational resonance in solid-state Nmr. Chemical Physics Letters. 146 (1-2), 71-76 (1988).
  42. Schaefer, J., Stejskal, E. O. C-13 nuclear magnetic-resonance of polymers spinning at magic angle. Journal of the American Chemical Society. 98 (4), 1031-1032 (1976).
  43. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An improved broadband decoupling sequence for liquid crystals and solids. Journal of Magnetic Resonance. 142 (1), 97-101 (2000).
  44. Weingarth, M., Bodenhausen, G., Tekely, P. Low-power decoupling at high spinning frequencies in high static fields. Journal of Magnetic Resonance. 199 (2), 238-241 (2009).
  45. Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (127), (2017).
  46. Zhou, D. H., Rienstra, C. M. High-performance solvent suppression for proton detected solid-state NMR. Journal of Magnetic Resonance. 192 (1), 167-172 (2008).
  47. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Molecular Physics. 95 (6), 1197-1207 (1998).
  48. Verel, R., Baldus, M., Ernst, M., Meier, B. H. A homonuclear spin-pair filter for solid-state NMR based on adiabatic-passage techniques. Chemical Physics Letters. 287 (3-4), 421-428 (1998).
  49. Lewandowski, J. R., Sass, H. J., Grzesiek, S., Blackledge, M., Emsley, L. Site-specific measurement of slow motions in proteins. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16762-16765 (2011).
  50. Sauvee, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie (International Edition in English). 52 (41), 10858-10861 (2013).
  51. Zhai, W., et al. Postmodification via thiol-click chemistry yields hydrophilic trityl-nitroxide biradicals for biomolecular high-field dynamic nuclear polarization. The Journal of Physical Chemistry. B. 124 (41), 9047-9060 (2020).
  52. Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  53. Narasimhan, S., et al. Characterizing proteins in a native bacterial environment using solid-state NMR spectroscopy. Nature Protocols. , (2020).
  54. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  55. Weingarth, M., et al. Quantitative analysis of the water occupancy around the selectivity filter of a K+ channel in different gating modes. Journal of the American Chemical Society. 136 (5), 2000-2007 (2014).
  56. Lalli, D., et al. Proton-based structural analysis of a heptahelical transmembrane protein in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (37), 13006-13012 (2017).
  57. Schubeis, T., et al. A beta-barrel for oil transport through lipid membranes: Dynamic NMR structures of AlkL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21014-21021 (2020).
  58. Baker, L. A., Daniels, M., vander Cruijsen, E. A. W., Folkers, G. E., Baldus, M. Efficient cellular solid-state NMR of membrane proteins by targeted protein labeling. Journal of Biomolecular NMR. 62 (2), 199-208 (2015).
  59. Linser, R., et al. Proton-detected solid-state NMR spectroscopy of fibrillar and membrane proteins. Angewandte Chemie (International Edition in English). 50 (19), 4508-4512 (2011).
  60. Shukla, R., et al. Mode of action of teixobactins in cellular membranes. Nature Communications. 11 (1), 2848(2020).
  61. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nature Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  62. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K(+) channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  63. Narasimhan, S., et al. DNP-supported solid-state NMR spectroscopy of proteins inside mammalian cells. Angewandte Chemie (International Edition in English). 58 (37), 12969-12973 (2019).
  64. Wu, R., Stephenson, R., Gichaba, A., Noinaj, N. The big BAM theory: An open and closed case. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1862 (1), 183062(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

MembranproteineWirkstoffzieleFestk rper NMRSsNMR SpektroskopieBiologische Membranenatomare Skalahochempfindliche MethodenProtonendetektierte SsNMRDynamische KernpolarisationBamAKcsAIsotopenmarkierte ProteineStrukturinformationenBewegungsinformationen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten