JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo lavoro descrive in dettaglio solide routine di base su come preparare campioni di proteine di membrana marcati con isotopi e analizzarli ad alta risoluzione con i moderni metodi di spettroscopia NMR allo stato solido.

Abstract

Le proteine di membrana sono vitali per la funzione cellulare e quindi rappresentano importanti bersagli farmacologici. La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (ssNMR) offre un accesso unico per sondare la struttura e la dinamica di tali proteine in membrane biologiche di complessità crescente. Qui, presentiamo la moderna spettroscopia NMR allo stato solido come strumento per studiare la struttura e la dinamica delle proteine nelle membrane lipidiche naturali e su scala atomica. Tali studi spettroscopici traggono vantaggio dall'uso di metodi ssNMR ad alta sensibilità, ovvero ssNMR rilevata da protoni (1H) e ssNMR supportata da DNP (Dynamic Nuclear Polarization). Utilizzando la proteina batterica BamA della membrana esterna e il canale ionico KcsA, presentiamo metodi per preparare proteine di membrana marcate con isotopi e per derivare informazioni strutturali e motorie mediante ssNMR.

Introduzione

Gli studi strutturali e motori delle proteine di membrana in ambienti fisiologicamente rilevanti rappresentano una sfida per le tradizionali tecniche di biologia strutturale1. I moderni metodi di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (ssNMR) offrono un approccio unico per la caratterizzazione delle proteine di membrana 2,3,4,5,6,7 e sono stati a lungo utilizzati per studiare le proteine di membrana, comprese le pompe proteiche incluse nella membrana 8, i canali 9,10,11 o i recettori 12,13,14,15. I progressi tecnici come i campi magnetici ultra-elevati >1.000 MHz, le frequenze di rotazione dell'angolo magico veloce >100 kHz e le tecniche di iperpolarizzazione16 hanno stabilito la ssNMR come un potente metodo per lo studio delle proteine di membrana in ambienti di complessità sempre crescente, dai liposomi alle membrane cellulari e persino a intere cellule. Ad esempio, il DNP è diventato un potente strumento per tali esperimenti (vedi riferimento 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Più recentemente, la ssNMR rilevata con 1H offre crescenti possibilità di studiare le proteine di membrana ad alta risoluzione spettrale e sensibilità 25,26,27,28,29. Questo lavoro evidenzia due proteine di membrana batterica che sono coinvolte in funzioni essenziali, cioè l'inserimento delle proteine e il trasporto degli ioni. Le proteine corrispondenti, BamA 25,30,31,32,33 e KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (o loro varianti chimeriche 10,40) sono state esaminate mediante ssNMR metodi per più di un decennio.

Qui viene presentato un protocollo rappresentativo per la preparazione e la caratterizzazione ssNMR di proteine di membrana di origine batterica. I diversi passaggi del protocollo sono illustrati nella Figura 1. In primo luogo, viene spiegata l'espressione, la marcatura isotopica, la purificazione e la ricostituzione della membrana di BamA. Quindi, viene presentato un flusso di lavoro generale per la caratterizzazione della proteina di membrana mediante ssNMR; in particolare, l'assegnazione di dorsali proteiche di membrana utilizzando 1 ssNMR rilevato da Ha rotazione ad angolo magico veloce. Infine, vengono dettagliate la configurazione di base e l'acquisizione di esperimenti supportati dalla polarizzazione nucleare dinamica (DNP), che aumentano significativamente la sensibilità del segnale ssNMR.

Protocollo

1. Produzione di BamA-P4P5 etichettati in modo uniforme 2H, 13C, 15N

NOTA: Sebbene questo protocollo richieda di lavorare con batteri Gram-negativi non patogeni, l'aderenza alle procedure di sicurezza biologica di base è un must, vale a dire indossare occhiali di sicurezza, camici da laboratorio, guanti e seguire le procedure operative standard istituzionali per il lavoro con i microrganismi.

  1. Utilizzare una singola colonia di E. coli BL 21 Star (DE3) contenente il plasmide pET11aΔssYaeT che codifica per E. coli BamA-P4P5 per inoculare 50 ml di brodo di lisogenia integrato con 50 μg/L di ampicillina.
  2. Far crescere la coltura a 37 °C a 200 giri/min fino a raggiungere un OD600 di 0,6. Centrifugare a 2.000 x g per 10 min. Risospendere il pellet in 50 mL di M9 (vedi Tabella 1) fino a un OD massimodi 600 di 0,1.
    NOTA: Tutte le fasi di crescita future avvengono alle condizioni sopra indicate, se non diversamente specificato.
  3. Coltiva la coltura fino a OD600 di 0,5. Centrifugare a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 50 mL di M9 contenente il 90% di D2O (vedere la Tabella 1 per la ricetta) fino a un OD massimo di600 di 0,1. Far crescere la coltura durante la notte a 30 °C a 200 giri/min.
  4. Centrifugare la coltura a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet nei 50 mL preriscaldati 90% D2O M9 fino a un massimo diOD 600 di 0,1. Crescere fino a raggiungere un OD600 di 1.0.
  5. Centrifugare la coltura a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Preparare 100 mL di terreno 100% D2O M9 con quantità arricchite di isotopi di glucosio non arricchito e cloruro di ammonio. Risospendere in 100% D2O M9 medio fino a un massimo diOD 600 di 0,1. Crescere fino a raggiungere un OD600 di 0,7.
  6. Centrifugare la coltura a 2.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 mL di terreno D2O M9 al 100% con isotopi (vedi Tabella 1) fino ad un OD massimo di600 di 0,1.
  7. Lasciare che la coltura cresca fino a raggiungere un OD600 di 0,6-0,9. Indurre con 1 mM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). Estrarre per 4 ore e raccogliere le celle a 4.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.

2. Purificazione, ripiegamento e formazione del proteo-liposoma BamA-P4P5

NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione devono essere eseguiti in una cappa aspirante. Particolare attenzione deve essere prestata all'apertura delle provette dopo la centrifugazione limita gli aerosol dannosi.

  1. Scongelare il pellet con ghiaccio. Risospendere il pellet in 20 mL di tampone freddo 1. Vedere la Tabella 2 per i buffer.
  2. Centrifugare la soluzione a 4.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet in 20 mL di H2O distillato a freddo. Lasciare incubare la sospensione su ghiaccio per 10 minuti.
  3. Abbassare la sospensione a 4.000 x g per 20 min a 4 °C. Risospendere in 10 mL di Buffer 2 freddo e lasciare incubare su ghiaccio per 30 minuti.
  4. Integrare la miscela con altri 10 ml di tampone freddo 2 e incubare per altri 30 minuti con ghiaccio. Aggiungere lo 0,5% di n-dodecil-B-D-maltoside (DDM) e agitare delicatamente.
  5. Sonicare il campione sul ghiaccio a 13 kHz fino a quando non si utilizzano impulsi on/off della durata di 10 secondi. Centrifugare a 25.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Lavare tre volte con 20 ml di tampone 3. Centrifugare a 25.000 x g per 20 min a 4 °C.
  6. Risospendere il pellet in 20 mL di tampone 4. Incubare a 37 °C per 30 min. Sonicare il campione sul ghiaccio a 13 kHz, fino a quando non si utilizzano impulsi on/off lunghi 10 s.
  7. Centrifugare il campione a 25.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 omettendo l'aggiunta dell'inibitore della proteasi e l'incubazione a 37 °C.
  8. Lavare il pellet con 20 mL di acqua e due volte con il Buffer 3. Centrifugare a 25.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Aliquotare la sospensione in provette per microcentrifuga da 1 mL e centrifugare le provette per microcentrifuga alla massima velocità su una centrifuga da banco per 20 minuti. La purezza del corpo incluso è valutata con il 10% di gel SDS-Page, vedere la Figura 2A. La resa attesa per il BamA-P4P5 purificato triplo (2 H,13 C,15N) marcato è di 30 mg/L.
  9. Solubilizzare i corpi di inclusione in 200 μL di tampone 5 e 300 μL di H2O. Aggiungere cloruro di guanidio 6M (GdnCl). Regolare il volume della provetta da microcentrifuga a 1 mL con H2O. Agitare la miscela e incubare per 4 ore a temperatura ambiente. Agitare periodicamente le provette per microcentrifuga (ogni 30 minuti).
  10. Centrifugare a 100.000 x g per 1 ora a 4 °C. Usa la legge di Beer-Lambert per determinare la concentrazione proteica di 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare è 117.120 M-1 cm-1. Se la concentrazione è >100 μM, diluire con 1x il tampone 5 con 6 M di GdnCl. Diluire rapidamente la proteina 10x nel tampone 6. Incubare la miscela per una notte a temperatura ambiente.
    NOTA: Per l'ultracentrifugazione, utilizzare provette da 1,5 mL per ultracentrifugazione.
  11. Determinare l'efficienza del refolding utilizzando un gel SDS-Page semi-nativo. Prelevare due aliquote da 10 μL del passaggio 2.10 e aggiungere 10 μL di tampone Lameili (tampone 8) a ciascuna aliquota. Far bollire un campione per 10 minuti a 95 °C; Lasciare l'altra aliquota sul ghiaccio. Successivamente, eseguire entrambi i campioni a 14 mA su un gel SDS-Page al 10%. Le parti di impilamento e scorrimento dei gel mancano di agente riducente e SDS. La colorazione delle proteine si ottiene utilizzando il colorante Coomassie. I risultati attesi sono mostrati nella Figura 2B.
  12. Centrifugare il campione a 4.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Concentrare il campione a un volume di lavoro di 8 mL utilizzando un filtro centrifugo da 30 kDa. Centrifugare il campione a 4.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Misura l'assorbanza delle proteine a 280 nm. Come nel passaggio 2.10, determinare la concentrazione proteica.
  13. Calcolare la quantità di lipidi necessaria per un rapporto lipidi/proteine di 10:1 (LPR-mol/mol). Da un cloroformio, aggiungere la quantità necessaria di lipidi, come calcolato al punto 2.12, in un pallone a fondo tondo (RBF) da 100 mL. Evacuare il cloroformio dall'RBF sotto un leggero flusso di azoto. Mettere RBF sotto vuoto per 3 ore. Idratare il film lipidico con 1 mL di Buffer 7. Incubare RBF per 10 minuti a 37 °C.
  14. Aggiungere la miscela proteica (dal passaggio 2.12) all'RBF.
  15. Diluire la miscela proteina/lipidi (dal passaggio 2.14) fino al volume finale di 50 mL nell'RBF. Utilizzare il Buffer 7 integrato con 1x inibitore della proteasi disciolto in DMSO e incubare per 30 minuti a 37 °C.
  16. Dializzare contro 100 volumi di Buffer 7 per 2 settimane (utilizzare un tubo per dialisi con cut-off del peso molecolare di 12-14 kDa). Per le prime 24 ore, eseguire la dialisi a temperatura ambiente con l'aggiunta di Buffer 7 fresco ogni 8 ore. Successivamente, sostituire il tampone una volta al giorno ed eseguire la dialisi a 4 °C.

3. Riempimento del rotore ssNMR

  1. Dopo il passaggio 2.16, centrifugare per 30-60 minuti a 10.000 x g a 4 °C in modo da formare un pellet. Rimuovere il surnatante con una pipetta.
    NOTA: La tecnica discussa di seguito è stata ottimizzata per un rotore da 3,2 mm, ma è applicabile a quasi tutti i diametri del rotore.
  2. Pipettare il campione nel rotore e farlo girare delicatamente con una centrifuga da tavolo.
    NOTA: A seconda della consistenza del campione, è possibile utilizzare uno strumento di densificazione per compattare il campione o una spatola invece di una pipetta per inserire il campione nel rotore.
  3. Ripetere questo processo 2-3 volte fino a riempire il rotore all'altezza corretta e controllare se c'è abbastanza spazio per il tappo, come indicato dalla linea di marcatura sullo strumento di densificazione. Chiudere il rotore con l'attrezzo di posizionamento del tappo su una superficie piana. Segnare metà del bordo inferiore del rotore.
    NOTA: Le nuove generazioni di rotori ssNMR sono dotate di una marcatura laser durevole sul bordo inferiore per il rilevamento ottico della frequenza di rotazione del rotore. In caso contrario, si consiglia l'uso di una penna sharpie; poiché il rilevatore MAS è stato ottimizzato specificamente per l'inchiostro Sharpie.
  4. Usa una lente d'ingrandimento per verificare se il tappo è ben posizionato.

4. Caratterizzazione del campione mediante spettroscopia 2D 13C- 13C ssNMR

  1. Inserire il rotore nel magnete, utilizzando la routine di rotazione automatica dell'unità MAS, far girare il campione fino alla frequenza MAS desiderata tra 10 e 20 kHz MAS mentre si raffredda il campione alla temperatura impostata di 270 K. Sintonizza e abbina i canali 1H e 13C.
    NOTA: Per la scelta della frequenza MAS, evitare di far corrispondere accidentalmente la distanza di spostamento chimico tra la regione spettrale Cα e la regione del carbonio carbonilico alla frequenza di rotazione, cioè evitare la condizione di risonanza rotazionale del primo ordine41.
  2. Ottimizzare un esperimento dipolarizzazione incrociata42 (CP) 1 H-13C variando la potenza RF sul canale del protone da 25-80 kHz. I parametri tipici sono una potenza RF di 45 kHz su 13C, 80-100 kHz eteronucleare 1H-disaccoppiamento43 durante l'acquisizione, un ritardo di riciclo di 1,8-2,0 s e 64 scansioni.
    1. Ottimizza il tempo di contatto CP per la massima sensibilità del segnale sui carboni alifatici.
    2. Determinare la lunghezza dell'impulso di 1ora e 90° nell'esperimento 13C-CP moltiplicando l'impulso iniziale per quattro, cioè ottimizzando un impulso a 360°, e variare la lunghezza fino a quando il segnale non è scomparso. Includere un impulso rettangolare subito dopo il trasferimento CP e ottimizzare analogamente la lunghezza dell'impulso di 13C 90°.
  3. Eseguire un esperimento 2D 13 C-13C di tipo PDSD (Proton-driven spin diffusion) come PARIS con un tempo di trasferimento di magnetizzazione di 30 ms per rilevare le correlazioni intra-residue e misurare la qualità del campione. Trasferisci i livelli di potenza, il tempo di contatto e le lunghezze degli impulsi a 90° dall'esperimento 13C-CP precedentemente ottimizzato. Utilizzare un tempo di acquisizione di 4-6 ms nella dimensione indiretta. Elabora lo spettro con funzioni QSIN (Squared Sin Bell) o, per campioni insensibili, allargamento esponenziale della linea in entrambe le dimensioni.
  4. Estrai fette di picchi trasversali isolati e determina la larghezza della linea a metà altezza. Una larghezza di linea compresa tra ~0,3-1,0 13C ppm è indicativa di un campione ben ordinato, ideale per la caratterizzazione di ssNMR, mentre una larghezza di linea superiore a 1,0 13C ppm è indicativa di eterogeneità conformazionale che può compromettere la caratterizzazione di ssNMR. Lo spettro 2D CC PARIS di BamA mostrato nella Figura 3A è un esempio di una proteina ben ordinata che fornisce spettri di alta qualità.

5. Assegnazione della spina dorsale mediante spettroscopia3D ssNMR rilevata ad H

  1. Acquisizione di impronte spettrali 2D NH
    1. Riempire il campione in un rotore da 1,3 mm, come descritto sopra. Inserire il rotore nel magnete, far girare il campione a 10-20 kHz MAS e raffreddare il campione a una temperatura impostata di 240-250 K o inferiore, a seconda delle specifiche della testa della sonda ssNMR. Utilizzare l'interfaccia dell'unità MAS per aumentare gradualmente la frequenza MAS in incrementi da 5 kHz a 60 kHz MAS.
    2. Ottimizza le ampiezze CP, i tempi di contatto e le lunghezze degli impulsi a 90° in esperimenti CP a 13C e 15N. Utilizzare ampiezze intorno a 30-50 o 70-100 kHz sui canali eteronucleari e variare l'ampiezza sul canale H 1da 80-180 kHz. Utilizzare un ritardo di riciclo di 0,7-1,2 s, insieme al disaccoppiamento di protoni eteronucleari a bassa potenza a 15 kHz44. Inoltre, vedere il riferimento45 per ulteriori dettagli pratici su come impostare gli esperimenti CP ssNMR.
    3. Acquisisci un esperimento NH 2D per misurare la risoluzione 1H. Trasferire i 15parametri N-CP e utilizzare un tempo di acquisizione di circa 15 e 25 ms nelle dimensioni diretta e indiretta. Per il primo trasferimento CP da 1ora a 15N, utilizzare il tempo di contatto precedentemente ottimizzato. Per il backtransfer da 15N a 1H, utilizzare un tempo di contatto di 0,7-1,0 ms per ridurre al minimo il trasferimento di magnetizzazione interresidua.
    4. Utilizzare 50-250 ms di soppressione MISSISSIPPI46 in acqua, a seconda del contenuto di acqua del campione. Elabora lo spettro con funzioni di campana del seno al quadrato (QSIN) in entrambe le dimensioni. Estrai fette di picchi trasversali isolati e determina la larghezza della linea a metà altezza. Un esempio di spettro NH25 2D di alta qualità è mostrato per BamA-P4P5 incorporato nella membrana nella Figura 3B.
  2. Assegnazioni della dorsale
    1. Ottimizzare un esperimento CP specifico da 1D 15N a 13Cα47. Posizionare il portante 13C al centro della regione Cα a circa 55 ppm. Utilizzare un'ampiezza rf di 13C di 20 kHz e variare l'ampiezza di 15N da 35 a 45 kHz per il massimo trasferimento ai segnali Cα e il trasferimento minimo ai segnali carbonilici. Ottimizza il tempo di contatto da 3 a 10 ms con incrementi di 1 ms.
    2. Esegui un esperimento 3D CαNH. Trasferisci tutte le ampiezze CP, i tempi di contatto e le lunghezze degli impulsi dai passaggi precedentemente ottimizzati. Utilizzare circa 10 ms e 30 ms nelle dimensioni di acquisizione indiretta e diretta. Elabora lo spettro con funzioni di campana del seno al quadrato (QSIN) in tutte e tre le dimensioni.
    3. Ottimizza un trasferimento di magnetizzazione da 1D Cα a CO DREAM48. Inizia con un trasferimento CP specifico da 15N a 13Cα. Quindi, trasferire la magnetizzazione da Cα a CO utilizzando un blocco di rotazione sul canale 13C. Variare l'ampiezza RF da 20 a 35 kHz per un trasferimento ottimale. Ottimizza il tempo di trasferimento da 4 a 10 ms.
    4. Esegui un esperimento 3D Cα(CO)NH. Trasferisci tutte le ampiezze RF, i tempi di contatto e le lunghezze degli impulsi dai passi precedentemente ottimizzati. Utilizzare circa 10 ms e 30 ms nelle dimensioni di acquisizione indiretta e diretta. Elabora lo spettro con funzioni di campana del seno al quadrato (QSIN) in tutte e tre le dimensioni.
    5. Ripetere e adattare i passaggi 1-4 per gli analoghi esperimenti 3D CONH e CO(Cα)NH. Utilizzare questo quartetto di esperimenti 3D per passeggiate sequenziali di Cα e CO per assegnare la spina dorsale della proteina, come mostrato nell'esempio di KcsA nella Figura 428.

6. Dinamica delle proteine mediante spettroscopia ssNMR rilevata con 1H

  1. Per gli studi a 15N T1 , utilizzare l'esperimento 2D NH precedentemente ottimizzato a 60 kHz MAS e includere un ritardo dopo la prima fase di polarizzazione incrociata da 1H a 15N. Acquisisci una serie di esperimenti NH 2D e varia il ritardo da 0 a 16 s utilizzando passi di, ad esempio, 0, 2, 4, 8 e 16 s.
  2. Traccia le intensità normalizzate per i segnali risolti in funzione dell'aumento del tempo di ritardo. Adatta il decadimento T1 a singoli esponenziali secondo y = exp(-x/T1), dove y è l'intensità del segnale al tempo di decadimento x.
  3. Analogamente, per gli studi a 15N T1rho, includere un impulso spin-lock nel programma di impulsi sul canale 15N con un'ampiezza rf compresa tra 15-20 kHz dopo il primo passaggio di polarizzazione incrociata da 1H a 15N26,49. Acquisire una serie di esperimenti 2D NH e variare il ritardo da 0 a 150 ms e adattare il decadimento T1rho dei segnali risolti a singoli esponenziali. I dati illustrativi di 15N T1rho sono mostrati per i canali K+ inclusi nella membrana in Figura 527,28.

7. Polarizzazione nucleare dinamica

NOTA: Le seguenti fasi preparatorie si riferiscono all'uso di configurazioni DNP commerciali che utilizzano rotori MAS in zaffiro da 3,2 mm (Figura 6)20. L'uso dei rotori in zirconia o di altre apparecchiature DNP può portare a miglioramenti inferiori del segnale DNP.

  1. Risospendere il pellet proteico di membrana (dal passaggio 3.1) in 50 μL di tampone DNP deuterato (60% (v/v) deuterato d8- e glicerolo, e 15 mM AMUPol50. Per esperimenti a 800 MHz, si consiglia di utilizzare 10 mM NATriPOL-351. Si veda anche il riferimento52 per ulteriori aspetti pratici degli esperimenti DNP ssNMR.
  2. Centrifugare per 10-20 minuti a 100.000 x g a 4 °C in modo da formare un pellet. Rimuovere il surnatante con una pipetta.
  3. Preraffreddare l'adattatore centrifugo e i componenti del rotore MAS in zaffiro da 3,2 mm a <4 °C. I passaggi seguenti (7.4-7.7) devono essere eseguiti il più rapidamente possibile per evitare che gli agenti DNP vengano ridotti.
  4. Posizionare il rotore in zaffiro da 3,2 mm nell'adattatore della centrifuga e riempirlo con la sospensione di proteo-liposomi del passaggio 7.2.
  5. Pipettare accuratamente il campione di proteina di membrana risospeso contro la parete interna del rotore utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl. Lasciare che la soluzione scivoli verso il basso fino alla parte inferiore del rotore. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria.
  6. Far girare il campione nel rotore per 5-10 minuti a 4.500 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante contenente il succo DNP in eccesso pipettandolo con cura senza interrompere il pellet cellulare. Ripetere i passaggi 6.4-6.6 fino a quando il rotore non è pieno.
  7. Posizionare con cautela il distanziatore in politetrafluoroetilene (PTFE) utilizzando la vite distanziale sulla parte superiore del rotore.
  8. Posizionare il rotore, con il tappo rivolto verso il basso, in uno stantuffo del rotore53 e immergere il rotore nell'azoto liquido. Attendere almeno 30-60 s affinché il rotore e il campione si congelino.
  9. Avviare l'unità scambiatore di calore e raffreddare la sonda DNP a ~90K.
  10. Impostare l'unità MAS in modalità manuale e impostare la temperatura variabile (VT) su 135 l/h e i flussi di gas del cuscinetto e dell'azionamento su ~6 l/h.
  11. Attivare l'espulsione sulla console MAS.
  12. Trasferire il campione congelato dal passaggio 7.8 dal liquido N2 nel raccoglitore di campioni e posizionarlo nella sonda (vedere anche il riferimento53).
  13. Aumentare manualmente la pressione del cuscinetto della sonda (Bp) a ~500 mbar prima di innestare l'"Inserto". Ciò è consigliabile per una rotazione stabile e sicura del rotore.
  14. Aumentare la velocità MAS al valore desiderato utilizzando la procedura descritta nel riferimento53.
  15. Verificare la presenza di miglioramenti DNP con e senza microonde utilizzando un normale esperimento CP 1D (vedere anche, ad esempio, riferimento51,54) (Figura 7) prima di procedere con esperimenti multidimensionali, ad esempio, esperimenti CC 2D descritti nella sezione 3 di questo articolo.

Risultati

La Figura 2 mostra i gel rappresentativi per la purezza dei corpi di inclusione (Pannello A) e il ripiegamento dei corpi di inclusione (Pannello B3). La Figura 2 conferma il successo della purificazione di 13 C,15N-marcato BamA-P4P5.

La Figura 3A mostra un tipico spettro 2D 13 C-13C di una proteina di membrana ben ordinata, ment...

Discussione

Le proteine di membrana sono attori chiave nella regolazione delle funzioni cellulari vitali sia negli organismi procarioti che eucarioti; Pertanto, comprendere i loro meccanismi d'azione a livelli atomici di risoluzione è di vitale importanza. Le attuali tecniche di biologia strutturale hanno spinto la comprensione scientifica delle proteine di membrana molto lontano, ma si sono basate su dati sperimentali raccolti da sistemi in vitro privi di membrane. In questo articolo, viene presen...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro fa parte dei programmi di ricerca ECHO, TOP, TOP-PUNT, VICI e VIDI con i numeri di progetto 723.014.003, 711.018.001, 700.26.121, 700.10.443 e 718.015.00, finanziati dal Consiglio olandese delle ricerche (NWO). Questo articolo è stato supportato da iNEXT-Discovery (numero di progetto 871037).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium molibdateMerck277908
Ammonium-15N ChlorideCortecnetCN80P50
AmpicillinSigma AldrichA9518
AMUpolCortecnetC010P005
BenzonaseEMD Millipore Corp70746-3
Boric acidMerckB6768
bromophenol blueSigmaB0126
calcium dichlorideMerck499609
Choline chlorideSigmaC-1879
Cobalt chlorideMerck449776
Copper sulphateMerckC1297
D-BiotinMerck8512090025
Deuterium OxideCortecnetCD5251P1000
Dimethyl sulfoxideMerckD9170
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma AldrichL6876
Folic acidSigmaF-7876
Glucose 13C + 2HCortecnetCCD860P50
GlycerolHoneywellG7757
Glycerol (12C3, 99.95% D8, 98%)EurisotopeCDLM-8660-PK
glycerol (non-enriched)HoneywellG7757-1L
GlycineSigma Aldrich50046
Guanidine hydrochlorideRoth CarlNR.0037.1
Iron sulphateMerck307718
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideThermofisherR0392
Lysogeny BrothMerckL3022
LysozymeSigma AldrichL6876
Magnesium chloride - hexahydrateFluka63064
magnesium sulphateMerckM5921
monopotassium phosphateMerck1051080050
MyoinositolSigmaI-5125
n-Dodecyl-B-D-maltosideAcros Organics3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxideMerck40236
NicatinamideSigmaN-3376
Panthotenic acidSigma21210-25G-F
protease inhibitorSigmaP8849
Pyridoxal-HClSigma AldrichP9130
RiboflavinAldrichR170-6
Sodium ChlorideMerckK51107104914
Sodium dihydrogen phospahte - monohydrateSigma Aldrich1,06,34,61,000
Sodium dodecyl sulfateThermo-scientific28365
Sodium hydroxideMerck1,06,49,81,000
SucroseSigma Life ScienceS9378
Thiamine-HClMerck5871
Tris-HClSigma Aldrich10,70,89,76,001
Zinc chlorideMerck208086
E.coli BL21 DE3*New England BiolabsC2527
1.5 mL Ultra-tubesBeckman Coulter357448
30 kDa centrifugal filterAmiconUFC903024
3.2 mm sapphire DNP rotor with capsCortecnetH13861
3.2 mm teflon insertCortecnetB6628
3.2 mm sample packer/unpackerCortecnetB6988
3.2 mm Regular Wall MAS RotorCortecnetHZ16913
3.2 mm Regular Wall MAS rotorCortecnetHZ09244
Tool Kit for 3.2 mm Thin Wall rotorCortecnetB136904
1.3 mm MAS rotor + capsCortecnetHZ14752
1.3 mm filling toolCortecnetHZ14714
1.3 mm sample packerCortecnetHZ14716
1.3 mm cap removerCortecnetHZ14706
1.3 mm cap set toolCortecnetHZ14744
Dialysis tubing 12-14 kDaSpectra/Por132703
Sharpie - BlackMerckHS15094

Riferimenti

  1. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  2. Kaplan, M., Pinto, C., Houben, K., Baldus, M. Nuclear magnetic resonance (NMR) applied to membrane-protein complexes. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 15 (2016).
  3. Brown, L. S., Ladizhansky, V. Membrane proteins in their native habitat as seen by solid-state NMR spectroscopy. Protein Science. 24 (9), 1333-1346 (2015).
  4. Ladizhansky, V. Applications of solid-state NMR to membrane proteins. Biochimica Et Biophysica Acta. Proteins and Proteomics. 1865 (11), 1577-1586 (2017).
  5. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. H. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 1-24 (2012).
  6. Shahid, S. A., et al. Membrane-protein structure determination by solid-state NMR spectroscopy of microcrystals. Nature Methods. 9 (12), 1212-1217 (2012).
  7. Wang, S. L., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nature Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  8. Herzfeld, J., Lansing, J. C. Magnetic resonance studies of the bacteriorhodopsin pump cycle. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31 (1), 73-95 (2002).
  9. Ketchem, R. R., Hu, W., Cross, T. A. High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid-state NMR. Science. 261 (5127), 1457-1460 (1993).
  10. Lange, A., et al. Toxin-induced conformational changes in a potassium channel revealed by solid-state NMR. Nature. 440 (7086), 959-962 (2006).
  11. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  12. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  13. Luca, S., et al. The conformation of neurotensin bound to its G protein-coupled receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10706-10711 (2003).
  14. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14 (3), 284-290 (2018).
  15. Krug, U., et al. The conformational equilibrium of the neuropeptide Y2 receptor in bilayer membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 59 (52), 23854-23861 (2020).
  16. Maly, T., et al. Dynamic nuclear polarization at high magnetic fields. Journal of Chemical Physics. 128 (5), (2008).
  17. Bajaj, V. S., Mak-Jurkauskas, M. L., Belenky, M., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Functional and shunt states of bacteriorhodopsin resolved by 250 GHz dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9244-9249 (2009).
  18. Linden, A. H., et al. Neurotoxin II bound to acetylcholine receptors in native membranes studied by dynamic nuclear polarization NMR. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19266-19269 (2011).
  19. Ong, Y. S., Lakatos, A., Becker-Baldus, J., Pos, K. M., Glaubitz, C. Detecting substrates bound to the secondary multidrug efflux pump EmrE by DNP-enhanced solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15754-15762 (2013).
  20. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  21. Becker-Baldus, J., et al. Enlightening the photoactive site of channelrhodopsin-2 by DNP-enhanced solid-state NMR spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), 9896-9901 (2015).
  22. Kaplan, M., et al. EGFR dynamics change during activation in native membranes as revealed by NMR. Cell. 167 (5), 1241-1251 (2016).
  23. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K+ channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  24. Joedicke, L., et al. The molecular basis of subtype selectivity of human kinin G-protein-coupled receptors. Nature Chemical Biology. 14, 284 (2018).
  25. Pinto, C., et al. Formation of the beta-barrel assembly machinery complex in lipid bilayers as seen by solid-state NMR. Nature Communications. 9, (2018).
  26. Good, D. B., et al. Conformational dynamics of a seven transmembrane helical protein Anabaena Sensory Rhodopsin probed by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (7), 2833-2842 (2014).
  27. Medeiros-Silva, J., et al. (1)H-detected solid-state NMR studies of water-inaccessible proteins in vitro and in situ. Angewandte Chemie (International Edition in English). 55 (43), 13606-13610 (2016).
  28. Jekhmane, S., et al. Shifts in the selectivity filter dynamics cause modal gating in K(+) channels. Nature Communications. 10 (1), 123 (2019).
  29. Schubeis, T., Le Marchand, T., Andreas, L. B., Pintacuda, G. 1H magic-angle spinning NMR evolves as a powerful new tool for membrane proteins. Journal of Magnetic Resonance. 287, 140-152 (2018).
  30. Sinnige, T., et al. Solid-state NMR studies of full-length BamA in lipid bilayers suggest limited overall POTRA mobility. Journal of Molecular Biology. 426 (9), 2009-2021 (2014).
  31. Sinnige, T., et al. Insight into the conformational stability of membrane-embedded BamA using a combined solution and solid-state NMR approach. Journal of Biomolecular NMR. 61 (3-4), 321-332 (2015).
  32. Sinnige, T., et al. Conformational plasticity of the POTRA 5 domain in the outer membrane protein assembly factor BamA. Structure. 23 (7), 1317-1324 (2015).
  33. Renault, M., Bos, M. P., Tommassen, J., Baldus, M. Solid-state NMR on a large multidomain integral membrane protein: the outer membrane protein assembly factor BamA. Journal of the American Chemical Society. 133 (12), 4175-4177 (2011).
  34. Doyle, D. A., et al. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science. 280 (5360), 69-77 (1998).
  35. Wylie, B. J., Bhate, M. P., McDermott, A. E. Transmembrane allosteric coupling of the gates in a potassium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 185-190 (2014).
  36. Xu, Y., Zhang, D., Rogawski, R., Nimigean, C. M., McDermott, A. E. Identifying coupled clusters of allostery participants through chemical shift perturbations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2078-2085 (2019).
  37. vander Cruijsen, E. A. W., Prokofyev, A. V., Pongs, O., Baldus, M. Probing conformational changes during the gating cycle of a potassium channel in lipid bilayers. Biophysical Journal. 112 (1), 99-108 (2017).
  38. Varga, K., Tian, L., McDermott, A. E. Solid-state NMR study and assignments of the KcsA potassium ion channel of S. lividans. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1774 (12), 1604-1613 (2007).
  39. Zhang, D., Howarth, G. S., Parkin, L. A., McDermott, A. E. NMR studies of lipid regulation of the K+ channel KcsA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. , 183491 (2020).
  40. Schneider, R., et al. Solid-state NMR spectroscopy applied to a chimeric potassium channel in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (23), 7427-7435 (2008).
  41. Raleigh, D. P., Levitt, M. H., Griffin, R. G. Rotational resonance in solid-state Nmr. Chemical Physics Letters. 146 (1-2), 71-76 (1988).
  42. Schaefer, J., Stejskal, E. O. C-13 nuclear magnetic-resonance of polymers spinning at magic angle. Journal of the American Chemical Society. 98 (4), 1031-1032 (1976).
  43. Fung, B. M., Khitrin, A. K., Ermolaev, K. An improved broadband decoupling sequence for liquid crystals and solids. Journal of Magnetic Resonance. 142 (1), 97-101 (2000).
  44. Weingarth, M., Bodenhausen, G., Tekely, P. Low-power decoupling at high spinning frequencies in high static fields. Journal of Magnetic Resonance. 199 (2), 238-241 (2009).
  45. Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (127), (2017).
  46. Zhou, D. H., Rienstra, C. M. High-performance solvent suppression for proton detected solid-state NMR. Journal of Magnetic Resonance. 192 (1), 167-172 (2008).
  47. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Molecular Physics. 95 (6), 1197-1207 (1998).
  48. Verel, R., Baldus, M., Ernst, M., Meier, B. H. A homonuclear spin-pair filter for solid-state NMR based on adiabatic-passage techniques. Chemical Physics Letters. 287 (3-4), 421-428 (1998).
  49. Lewandowski, J. R., Sass, H. J., Grzesiek, S., Blackledge, M., Emsley, L. Site-specific measurement of slow motions in proteins. Journal of the American Chemical Society. 133 (42), 16762-16765 (2011).
  50. Sauvee, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie (International Edition in English). 52 (41), 10858-10861 (2013).
  51. Zhai, W., et al. Postmodification via thiol-click chemistry yields hydrophilic trityl-nitroxide biradicals for biomolecular high-field dynamic nuclear polarization. The Journal of Physical Chemistry. B. 124 (41), 9047-9060 (2020).
  52. Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  53. Narasimhan, S., et al. Characterizing proteins in a native bacterial environment using solid-state NMR spectroscopy. Nature Protocols. , (2020).
  54. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  55. Weingarth, M., et al. Quantitative analysis of the water occupancy around the selectivity filter of a K+ channel in different gating modes. Journal of the American Chemical Society. 136 (5), 2000-2007 (2014).
  56. Lalli, D., et al. Proton-based structural analysis of a heptahelical transmembrane protein in lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (37), 13006-13012 (2017).
  57. Schubeis, T., et al. A beta-barrel for oil transport through lipid membranes: Dynamic NMR structures of AlkL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21014-21021 (2020).
  58. Baker, L. A., Daniels, M., vander Cruijsen, E. A. W., Folkers, G. E., Baldus, M. Efficient cellular solid-state NMR of membrane proteins by targeted protein labeling. Journal of Biomolecular NMR. 62 (2), 199-208 (2015).
  59. Linser, R., et al. Proton-detected solid-state NMR spectroscopy of fibrillar and membrane proteins. Angewandte Chemie (International Edition in English). 50 (19), 4508-4512 (2011).
  60. Shukla, R., et al. Mode of action of teixobactins in cellular membranes. Nature Communications. 11 (1), 2848 (2020).
  61. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nature Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  62. Visscher, K. M., et al. Supramolecular organization and functional implications of K(+) channel clusters in membranes. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56 (43), 13222-13227 (2017).
  63. Narasimhan, S., et al. DNP-supported solid-state NMR spectroscopy of proteins inside mammalian cells. Angewandte Chemie (International Edition in English). 58 (37), 12969-12973 (2019).
  64. Wu, R., Stephenson, R., Gichaba, A., Noinaj, N. The big BAM theory: An open and closed case. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1862 (1), 183062 (2020).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Proteine di MembranaBersagli FarmacologiciNMR allo Stato SolidoSpettroscopia SsNMRMembrane BiologicheScala AtomicaMetodi ad Alta SensibilitSsNMR Rilevata da ProtoniPolarizzazione Nucleare DinamicaBamAKcsAProteine marcate con isotopiInformazioni strutturaliInformazioni Motorie

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati