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要約

我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。

要約

ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。

概要

脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。

卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。

これらの利点にもかかわらず、遺伝子機能の研究のための安定した機能喪失技術の欠如は、ニワトリ胚の主要な技術的限界であった。低分子干渉RNA(siRNA)4やショートヘアピンRNA(shRNA)5の発現ベクターでエレクトロポレーションしたニワトリ胚は標的遺伝子のノックダウンを示しますが、これらのアプローチでは、導入されたRNAまたはDNAを失うと細胞が効果が消失するため、遺伝子抑制は一過性です。より安定した遺伝子抑制は、RCAS(RエプリケーションCompetent Avian slicoma-leukosisウイルス(ASLV)ロングターミナルリピート(LTR)とSプライスアクセプター)レトロウイルスシステム6によってニワトリ胚にsiRNAを送達することによって達成され得る。ウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子が安定に発現します。ただし、レトロウイルスは、細胞周期の有糸分裂(M)期にのみ分裂細胞のゲノムに組み込まれるため、この機能喪失アプローチを適用できる発生段階および/または細胞型に制限が課される可能性があります。さらに、RCASによる導入遺伝子の発現は、in ovoエレクトロポレーションによって誘導されるものよりも遅く、頑健ではないようです7。

トランスポゾンは、ゲノム上のある場所から別の場所に移動する遺伝的要素です。Tol2エレメントは、hAT転移エレメントファミリーのメンバーであり、Tol2エレメント8のトランスポゾン反応を触媒するトランスポザーゼをコードする内部遺伝子を含む。Tol2エレメントの左端と右端の配列(それぞれ200 bpと150 bp)に挟まれた遺伝子発現カセットを担持したプラスミドベクターをTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトで脊椎動物細胞に導入すると、プラスミドから発現カセットが切り出され、宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子の安定発現をサポートします(図1).Tol2転移因子は、ゼブラフィッシュ9,10、カエル11、ヒナ12、マウス13を含む異なる脊椎動物種において非常に効率的に遺伝子転位を誘導できることが示されており、したがって、遺伝子導入および挿入突然変異誘発の有用な方法である。Tol2トランスポゾン系は、長鎖二本鎖RNAからプロセシングされたsiRNAのゲノム組み込みによる標的遺伝子の条件付きノックダウンに使用されています14。

このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムによる人工マイクロRNA(miRNA)の導入を含むニワトリ胚における機能喪失アプローチを説明しています15,16。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーと標的遺伝子に対する人工miRNAの発現カセットをTol2トランスポゾンベクターにクローニングします。次いで、Tol2トランスポゾン構築物を、in ovoエレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現構築物と共に胚性ニワトリ網膜に導入する。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、主に神経系に発現する細胞外糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜でノックダウンすることに成功しました(代表的な結果を参照)。我々の結果は、この手法により、ovoにおいて安定的かつ効率的な遺伝子抑制を達成できることを示しています。

プロトコル

1. miRNA発現ベクターの構築

注:miRNA発現ベクターを構築するための手順(ステップ1.1-1.3、1.5-1.6)は、前述のように、miRNA発現キットであるEmGFPを用いたBlock-iT Pol II miR RNA発現キット用に最適化されています15,16。このキットには、miRNA発現を可能にするように設計された発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド)、アクセサリー試薬、およびmiRNA発現ベクターを作製するための説明書(材料表参照)が含まれています17。

  1. 標的遺伝子に対するpre-miRNAをコードする一本鎖DNAオリゴの設計:オンラインツールRNAi Designer(材料表参照)を使用して、一本鎖DNAオリゴ(「トップストランド」オリゴ(ターゲットプレmiRNA)および「ボトムストランド」オリゴ(トップストランドオリゴの相補体))を設計します。一本鎖オリゴの必要な特徴(図2A)とターゲット配列の例(図2B)については、図2を参照してください。
    注:特定の標的遺伝子に対して5〜10個のpre-miRNA配列を生成し、 in vitro でノックダウン活性をスクリーニングすることをお勧めします(ステップ1.4)。
  2. トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニーリングして二本鎖オリゴを生成する
    1. 以下のアニーリング反応(表1)を滅菌0.5 mLマイクロ遠心チューブにセットします。
    2. 反応混合物を95°Cで4分間インキュベートします。トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニールし、反応混合物を室温(RT)に5〜10分間冷却することにより、二本鎖オリゴを生成します。サンプルを短時間(~5秒)遠心分離します。
      注:アニールされたオリゴは、-20°Cで少なくとも1年間は分解することなく保存できます。
  3. 二本鎖オリゴをmiRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA(miRNA発現キットに付属))にクローニングする:メーカーのマニュアル17に従って、個々の二本鎖オリゴを直鎖化miRNA発現ベクターにクローニングします。
  4. ノックダウン効果の評価
    注:個々のmiRNA配列は、ovoに適用する前に、in vitroで遺伝子抑制効率をテストすることをお勧めします。ノックダウン効率は、miRNA発現プラスミドを標的遺伝子を発現する細胞株にトランスフェクトすることによって試験することができる。あるいは、個々のmiRNA発現プラスミドを、標的遺伝子の発現コンストラクトを有する細胞株に同時トランスフェクトすることができる。天然状態で膜固定されていないタンパク質をコードする標的遺伝子(例えば、可溶性タンパク質)については、アルカリホスファターゼ(AP)融合タンパク質を使用して、標的タンパク質の発現をモニタリングすることができる。標的タンパク質をコードするcDNA配列を、APタグベクター(APtag-1-APtag-5;材料表参照)中のヒト胎盤アルカリホスファターゼにインフレームで融合させ、細胞18に導入することができる。培養細胞(HEK293T細胞など)で発現させると、APタグ付き標的タンパク質が培養培地中に高レベルで分泌されるため、miRNA導入細胞の培地中のAP活性の低下を測定することでmiRNA配列のノックダウン効果を評価できます(サブステップ1.4.1-1.4.4)。
    1. 細胞HEK293T 24ウェルプレート(8 x 104 細胞/ウェル)で一晩培養します。個々のmiRNA発現コンストラクトで細胞をAPタグ付き標的タンパク質の発現プラスミドで一過性にトランスフェクトします。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド(miRNA発現キットに付属)をコントロールとして使用します。(APタグ付き標的タンパク質を安定に発現する細胞株を使用する場合は、個々のmiRNA発現コンストラクトのみで細胞をトランスフェクトします。
      注:トランスフェクションには、従来のリポフェクション試薬( 材料表を参照)が使用されます。
    2. トランスフェクションの48〜72時間後に馴化培地を回収し、65°Cの水浴中で5分間、内因性AP活性を熱不活性化します。デスクトップマイクロ遠心分離機で破片を最高速度で5分間スピンアウトします。
    3. 上清を10 mM HEPES、pH 7.0で緩衝し、0.45 μmフィルターに通します。
    4. 100 μL(プレートリーダーでの測定用)または500 μL(分光光度計用)の上清を取り、等量の2x AP基質バッファーを追加します(表2)。プレートリーダーまたは分光光度計でOD405 を測定して、AP活性を確認します。
      注:馴化培地のAP活性が高すぎて正確な測定ができない場合は、HBAHバッファー(ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、0.5 mg / mLウシ血清アルブミン、20 mM HEPES(pH 7.0))またはキャリアタンパク質を含む別のバッファーで希釈してください。リン酸含有バッファー(PBSなど)は、無機リン酸がAPの競合阻害剤として作用するため、使用しないでください。
  5. miRNA配列の連鎖
    注:ノックダウン効果は、同じ標的遺伝子に対して異なるmiRNAを連鎖させるか、同じmiRNAを繰り返すことによって増強することができる。miRNA発現ベクターは、複数のpre-miRNA配列の連鎖およびそれらのコシストロン発現を支持する17。
    1. 製造業者の説明書17に従って、in vitroアッセイ(ステップ1.4)において最も高いノックダウン活性を示す2つの異なるpre-miRNA配列を(同じ標的遺伝子に対して)鎖状にする。
    2. ステップ1.4に記載される インビトロ アッセイを用いて鎖状構築物の遺伝子抑制効率を評価する。3つ以上のpre-miRNA配列が同様に高いノックダウン活性を示す場合は、2つの配列の異なる組み合わせをテストし、最も高いノックダウン活性を示す組み合わせを使用します( 代表的な結果を参照)。
  6. EmGFP-pre-miRNA発現カセットのTol2トランスポゾンベクターへの転写
    注:EmGFP cDNAおよび2つのpre-miRNA配列を含む発現カセットは、Tol2トランスポゾンベクター(pT2K-CAGGSベクター、 材料表を参照)に転写されます。この目的のために、発現カセット(CMVプロモーターの3'末端からmiRNA発現ベクターのmiRNAリバースシーケンシングプライマー部位までを包含する)を人工制限酵素部位を有するプライマーを用いてPCR増幅し、PCR産物をTol2トランスポゾンベクターにクローニングする。Tol2トランスポゾンベクターには、挿入された発現カセットの発現を駆動するユビキタスCAGGSプロモーターが含まれています。CAGGSプロモーターと発現カセットは、Tol2配列によって隣接しています(図1)。
    1. EmGFP-pre-miRNA発現カセットのPCR増幅: 表3に記載の反応セットアップおよび熱サイクリング条件に従う。
    2. ゲル精製PCR産物(約1.3 kb)を制限酵素消化Tol2トランスポゾンベクターにリゲートします。プラスミドをコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレートし( 材料表を参照)、組換え体(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAコンストラクト)を選択します。
    3. 従来のmaxiprepキットを用いてプラスミドを調製します( 材料表参照)。プラスミドの構造と配列は、それぞれ制限マッピングとPCRに使用したプライマーを使用して確認します。

2.卵の貯蔵と孵化

  1. 地元の農場や商業業者から受精したホワイトレグホン(Gallus gallus)の卵を購入します。
    注:卵は、孵卵中の生存率の大幅な損失や発育の遅延なしに、孵卵前に最大1週間、12〜16°Cまたは4°Cで保持できます。
  2. 卵に孵卵の開始日をラベル付けし、卵の上側(胚が配置される場所)に印を付けます。受精卵を38°Cで水平位置でインキュベートし、胚がハンバーガーおよびハミルトン(HH)ステージ10(33-38時間)-11(40-45時間)19に達するまでインキュベートします。

3. インオボ エレクトロポレーション

  1. in ovo エレクトロポレーションの調製
    1. 0.25%ファストグリーン溶液の調製:25 mgのファストグリーンFCFを10 mLのPBSに溶解します。0.2 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。溶液はRTに保存できます。
    2. DNAカクテル:個々のpT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAプラスミド(サブステップ1.6.3)とTol2トランスポザーゼ発現プラスミド(pCAGGS-T2TPベクター; 材料表参照)(各5 μg/μL)を2:1の比率で混合して注射液を調製します。注入された領域を視覚化するために、0.25%高速グリーン溶液の1/10ボリュームを追加します。
      注:最適なDNA濃度は、コンストラクトによって異なる場合があります。
    3. マイクロインジェクション装置のセットアップ(図3A、B):マイクロインジェクション装置は、ハミルトンシリンジ、18 Gニードル(針の長さ= 2インチ)、PVC(ポリ塩化ビニル)チューブ(長さ2 cm)、マイクロピペットニードル(マイクロピペットプラーでオメガドットファイバー(外径1 mm X 内径0.75 mm)のキャピラリーチューブを引っ張ることによって作成できます)。
      1. ハミルトンシリンジに重質鉱油を入れます。18 Gの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。
      2. 長さ2cmのPVCチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。
      3. 引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。マイクロピペット針の先端を細い鉗子で直径10〜20μmに折って小さな開口部を作ります。針全体をオイルで満たします。
        注意: 気泡はDNA溶液の流れを阻害するため、システム内に気泡を閉じ込めないように注意する必要があります。
    4. 5 μLの着色DNAカクテル(サブステップ3.1.2)を滅菌ペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端を滅菌ペトリ皿上のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。
    5. 針の内側と外側の圧力が平衡するまで待ち(空気が針に入るのを防ぐため)、針の先端をDNA溶液から取り出します。注射まで、針の先端を小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。
    6. エレクトロポレーション装置のセットアップ(図3A、C):
      1. マイクロマニピュレーターに電極ホルダー付きの一対の白金電極をセットします。電極の先端間の間隔を2 mmに調整します(図3C、E)。
      2. 電極をケーブルで方形波パルス発生器に接続します( 材料表を参照)。
  2. DNA溶液のマイクロインジェクション(図3D)
    1. インキュベーターから鶏の卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。
    2. 18 Gの針を10 mLのシリンジに取り付けます。卵黄を傷つけないように、下向き(45°)の角度で卵の鈍い端に針を挿入します。
    3. 卵から2〜3 mLのアルブミンを引き出します。スコッチテープで穴を塞ぎます。卵子を光で「キャンドリング」することによって、胚と硝子膜が殻から剥がれていることを確認します。
    4. はさみと鉗子を使用して卵の上から卵殻(直径2〜3 cmの円)を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。
      注意: 卵を割らずに窓を開けるのが難しい場合は、卵殻を取り除く前に、卵の上部全体をセロテープまたはスコッチテープで覆うことができます。
    5. 針の先端を近位側から視小胞に45°の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げる(または軽くたたく)ことによってDNAカクテルを注入します(図3D)。
      注:あるいは、圧力マイクロインジェクションシステム( 材料表を参照)を使用してDNA溶液を注入することもできます。
    6. 針を引き出し、その先端をPBSに戻します。
  3. エレクトロポレーション(図3E)
    1. エレクトロポレーターのパルスパラメータを次のように設定します:電圧:15 V、パルス長:50 ms、パルス間隔:950 ms、パルス数:5
    2. 胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えます。マイクロマニピュレーターを使用して、胚の前後軸に垂直に電極をHBSSに下げます。
      注:あるいは、アルブミンは効率的なエレクトロポレーションを可能にする優れた導電体であるため、この手順はHBSSを追加せずに行うことができます。
    3. 視小胞の両側(前(鼻)側と後側(側頭))に電極を配置します(図3E)。電極が胚や血管に触れないようにしてください。パルス電界を適用します。
    4. 電極を取り外し、アルブミンの蓄積を避けるために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。
    5. スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。

結果

Nelに対する人工miRNA発現のためのTol2トランスポゾンコンストラクトの構築
ネル(N耳Eピダーマル成長因子(EGF)-Like;Nell2としても知られています)は、細胞外糖タンパク質です。トロンボスポンジン-1と構造的に類似しており、主に神経系で発現しています20,21。我々は以前に、Nelが網膜神経節細胞15の分化...

ディスカッション

このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。

この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G needle, 2"VWR89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit BGenHunter CorpQ201 and Q202Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi DesignerInvitrogenAn online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mgSigma-AldrichA2153
C115CB cablesSonidelC115CBhttps://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cablesSonidelC117https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)FHC30-30-11 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporatorNepa GeneCUY21
Diethanolamine (pH 9.8)Sigma-AldrichD8885
Dissecting microscope
Egg incubatorKurlB-Lab-600-110https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holderSonidelCUY580https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
ElectrodesNepa GeneCUY611P3-1https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10BInvitrogen18290-015Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCFSigma-AldrichF7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagentPromegaE2691
Hamilton syringe (50 μL)Sigma-Aldrich20715Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solutionSigma-AldrichH6648
Heavy mineral oilSigma-Aldrich330760
HEPESGIBCO15630080
L-HomoarginineSigma-AldrichH10007
MgCl2Sigma-Aldrich13112
MicromanipulatorNarishige (Japan)MM3http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette pullerShutter InstrumentP97
p-NitrophenylphosphateSigma-Aldrich20-106
PBSSigma-AldrichD8662
pCAGGS-T2TP vectorTol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
PfuThermoFisherF566S
Picospritzer (Optional)ParkerPressure microinjection system
Plasmid maxi kitQiagen12163Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vectorTol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubingVWR (UK)228-3830
SpectinomycinSigma-AldrichS9007-5
T4 DNA ligasePromegaM1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFPInvitrogenK493600Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler

参考文献

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