Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Abstract

La retina del pulcino è stata a lungo un importante sistema modello nella neurobiologia dello sviluppo, con vantaggi tra cui le sue grandi dimensioni, il rapido sviluppo e l'accessibilità per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. Tuttavia, il suo principale limite tecnico era la mancanza di solidi approcci di perdita di funzione per le analisi della funzione genica. Questo protocollo descrive una metodologia di silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo che coinvolge l'espressione transgenica di microRNA artificiali (miRNA) utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. In questo approccio, un plasmide trasposone Tol2 che contiene una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e sequenze pre-miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo . Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l'escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell'ospite, portando all'espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che l'espressione di Nel, una glicoproteina che esercita molteplici funzioni nello sviluppo neurale, può essere significativamente soppressa nella retina del pulcino in via di sviluppo utilizzando questa tecnica. I nostri risultati indicano che questa metodologia induce una soppressione stabile e robusta dell'espressione genica e quindi fornisce un approccio efficiente alla perdita di funzione per gli studi sullo sviluppo della retina.

Introduzione

La retina dei vertebrati è un importante sistema modello per lo studio dello sviluppo neurale. Nonostante la sua posizione periferica, la retina è anatomicamente e dal punto di vista dello sviluppo un'estensione del sistema nervoso centrale e il nervo ottico, costituito da assoni di cellule gangliari retiniche, rappresenta un tratto all'interno del sistema nervoso centrale. La retina del pulcino presenta vantaggi significativi come sistema modello per studiare il meccanismo molecolare dello sviluppo neurale: è grande e si sviluppa rapidamente; presenta somiglianze strutturali e funzionali con la retina umana; È altamente accessibile per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. I meccanismi molecolari della proliferazione e della differenziazione cellulare, della morfogenesi e della guida degli assoni durante lo sviluppo neurale sono stati ampiamente studiati utilizzando la retina di pollo.

Nell'ovo, l'elettroporazione è stata utilizzata con successo negli ultimi due decenni per introdurre geni ectopici nelle cellule dell'embrione di pulcino in via di sviluppo. Questa tecnica consente la marcatura delle cellule in via di sviluppo, il tracciamento del destino cellulare e il tracciamento della migrazione cellulare e dei tratti assonici, nonché l'espressione genica ectopica per l'analisi in vivo della funzione genica. Le condizioni dell'elettroporazione in ovo per un'efficiente espressione genica ectopica negli embrioni di pulcino sono state ben stabilite ^1,2,3.

Nonostante questi vantaggi, la mancanza di una tecnica stabile di perdita di funzione per gli studi sulla funzione genica era stata una delle principali limitazioni tecniche dell'embrione di pulcino. Mentre gli embrioni di pulcino elettropostati con piccoli RNA interferenti (siRNAs)⁴ o vettori di espressione per RNA a forcina corta (shRNAs)⁵ mostrano knockdown del gene bersaglio, la soppressione genica in questi approcci è transitoria perché gli effetti scompaiono una volta che le cellule perdono gli RNA o i DNA introdotti. Una soppressione genica più stabile può essere ottenuta somministrando siRNA negli embrioni di pulcino mediante un sistema di retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) con un accettore di plice S)⁶. Il vettore virale si integra nel genoma dell'ospite e i geni ectopici sono espressi in modo stabile. Tuttavia, il retrovirus può integrarsi nel genoma delle cellule in divisione solo durante la fase mitotica (M) del ciclo cellulare, il che può imporre una limitazione agli stadi di sviluppo e/o ai tipi di cellule per i quali questo approccio di perdita di funzione può essere applicato. Inoltre, l'espressione dei transgeni da parte di RCAS appare più lenta e meno robusta di quella indotta dall'elettroporazione in ovo ⁷.

I trasposoni sono elementi genetici che si spostano da una posizione all'altra del genoma. L'elemento Tol2 è un membro della famiglia degli elementi trasponibili hAT e contiene un gene interno che codifica per una trasposasi che catalizza la reazione del trasposone dell'elemento Tol2⁸. Quando un vettore plasmidico che trasporta una cassetta di espressione genica affiancata dalle sequenze delle estremità sinistra e destra degli elementi Tol2 (200 bp e 150 bp, rispettivamente) viene introdotto in cellule di vertebrati con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2, la cassetta di espressione viene asportata dal plasmide e integrata nel genoma dell'ospite, che supporta un'espressione stabile del gene ectopico (Figura 1). È stato dimostrato che l'elemento trasponibile Tol2 può indurre la trasposizione genica in modo molto efficiente in diverse specie di vertebrati, tra cui il pesce zebra^9,10, le rane 11, i pulcini¹² e i topi ^13, ed è quindi un utile metodo di transgenesi e mutagenesi inserzionale. Il sistema di trasposoni Tol2 è stato utilizzato con successo per il knockdown condizionale di un gene bersaglio mediante integrazione genomica di siRNA che viene processato da RNA¹⁴ a doppio filamento lungo.

Questo protocollo descrive un approccio di perdita di funzione nell'embrione di pulcino che prevede l'introduzione di microRNA artificiali (miRNA) da parte del sistema di trasposone Tol2^15,16. In questo approccio, una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene clonata in un vettore di trasposone Tol2. Il costrutto del trasposone Tol2 viene quindi introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo. Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l'escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell'ospite, portando all'espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nei nostri studi precedenti, abbiamo abbattuto con successo l'espressione di Nel, una glicoproteina extracellulare espressa prevalentemente nel sistema nervoso, nella retina del pulcino in via di sviluppo (vedi Risultati rappresentativi). I nostri risultati indicano che la soppressione genica stabile ed efficiente può essere ottenuta in ovo con questa tecnica.

Protocollo

1. Costruzione di vettori di espressione dei miRNA

NOTA: Le procedure per la costruzione di vettori di espressione di miRNA (passaggi 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sono ottimizzate per il kit di espressione di miRNA, kit di espressione di miRNA Block-iT Pol II miR con EmGFP, come descritto in precedenza^15,16. Il kit fornisce il vettore di espressione progettato per consentire l'espressione di miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vettore di controllo (plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reagenti accessori e istruzioni per produrre vettori di espressione di miRNA (vedere Tabella dei materiali)¹⁷.

1. Progettazione di oligo di DNA a singolo filamento che codificano pre-miRNA contro il gene bersaglio: Progettazione di oligo di DNA a singolo filamento (oligo a "filamento superiore" (pre-miRNA bersaglio) e oligo a "filamento inferiore" (complementi di oligo a filamento superiore)) utilizzando lo strumento online RNAi Designer (vedere Tabella dei materiali). Vedere la Figura 2 per le caratteristiche richieste degli oligo a singolo filamento (Figura 2A) ed esempi di sequenze bersaglio (Figura 2B).
   NOTA: Si raccomanda di generare 5-10 sequenze di pre-miRNA per un dato gene bersaglio e di sottoporle a screening per le attività di knockdown in vitro (fase 1.4).
2. Ricottura degli oligo del filamento superiore e inferiore per generare un oligo a doppio filamento
   1. Impostare la seguente reazione di ricottura (Tabella 1) in una provetta sterile per microcentrifuga da 0,5 mL.
   2. Incubare la miscela di reazione a 95 °C per 4 min. Ricottura degli oligo del filamento superiore e inferiore per generare un oligo a doppio filamento lasciando raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente (RT) per 5-10 minuti. Centrifugare brevemente il campione (~5 s).
      NOTA: Gli oligo ricotto possono essere conservati a -20 °C senza degradazione per almeno un anno.
3. Clonazione degli oligo a doppio filamento nel vettore di espressione del miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fornito nel kit di espressione del miRNA)): clonare singoli oligo a doppio filamento nel vettore di espressione del miRNA linearizzato, secondo il manuale del produttore¹⁷.
4. Valutazione degli effetti knockdown
   NOTA: Si raccomanda di testare le singole sequenze di miRNA per l'efficienza di soppressione genica in vitro prima di essere applicate in ovo. L'efficienza di knockdown può essere testata trasfettando i plasmidi di espressione dei miRNA in una linea cellulare che esprime il gene bersaglio. In alternativa, i singoli plasmidi di espressione dei miRNA possono essere co-trasfettati in linee cellulari con un costrutto di espressione per il gene bersaglio. Per i geni bersaglio che codificano proteine che non sono ancorate alla membrana nel loro stato nativo (ad esempio, proteine solubili), una proteina di fusione della fosfatasi alcalina (AP) può essere utilizzata per monitorare l'espressione della proteina bersaglio. Una sequenza di cDNA che codifica per la proteina bersaglio può essere fusa in frame con la fosfatasi alcalina placentare umana in vettori AP-tag (APtag-1- APtag-5; vedi Tabella dei materiali) e introdotta nelle cellule¹⁸. Quando espressa in cellule di coltura (ad esempio, cellule HEK293T), la proteina bersaglio marcata con AP viene secreta ad alti livelli nei terreni di coltura, e quindi gli effetti di knockdown delle sequenze di miRNA possono essere valutati misurando la diminuzione dell'attività di AP nei terreni di coltura di cellule trasfettate con miRNA (sottopassaggi 1.4.1-1.4.4).
   1. Coltura HEK293T cellule in una piastra da 24 pozzetti (8 x 10⁴ cellule/pozzetto) per una notte. Trasfettare transitoriamente le cellule con singoli costrutti di espressione di miRNA con un plasmide di espressione di una proteina bersaglio marcata con AP. Utilizzare il plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo (fornito nel kit di espressione del miRNA) come controllo. (Se vengono utilizzate linee cellulari che esprimono stabilmente una proteina bersaglio marcata con AP, trasfettare le cellule solo con singoli costrutti di espressione di miRNA.)
      NOTA: Per la trasfezione viene utilizzato un reagente di lipofezione convenzionale (vedere la tabella dei materiali).
   2. Raccogliere il terreno condizionato 48-72 h dopo la trasfezione e inattivare a caldo l'attività endogena dell'AP in un bagno d'acqua a 65 °C per 5 min. Spinout dei detriti in una microcentrifuga da tavolo alla massima velocità per 5 min.
   3. Tamponare il surnatante con HEPES 10 mM, pH 7,0 e farlo passare attraverso un filtro da 0,45 μm.
   4. Prelevare 100 μL (per la misurazione in un lettore di piastre) o 500 μL (per uno spettrofotometro) del surnatante e aggiungere una quantità uguale di 2 tamponi di substrato AP (Tabella 2). Controllare l'attività dell'AP misurando OD₄₀₅ in un lettore di piastre o in uno spettrofotometro.
      NOTA: Se l'attività AP del terreno condizionato è troppo elevata per una misurazione accurata, diluirlo con tampone HBAH (soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), albumina sierica bovina 0,5 mg/mL, HEPES 20 mM (pH 7,0)) o un altro tampone contenente una proteina trasportatrice. Non utilizzare tamponi contenenti fosfato (ad es. PBS) perché il fosfato inorganico agisce come inibitore competitivo dell'AP.
5. Concatenamento della sequenza di miRNA
   NOTA: Gli effetti di knockdown possono essere potenziati concatenando diversi miRNA contro lo stesso gene bersaglio o ripetendo lo stesso miRNA. Il vettore di espressione dei miRNA supporta il concatenamento di più sequenze di pre-miRNA e la loro espressione co-cistronica¹⁷.
   1. Concatenare due diverse sequenze di pre-miRNA (contro lo stesso gene bersaglio) che mostrano le più elevate attività di knockdown nei saggi in vitro (fase 1.4), secondo le istruzioni del produttore¹⁷.
   2. Valutare l'efficienza di soppressione genica dei costrutti concatenati utilizzando saggi in vitro come descritto nel passaggio 1.4. Se tre o più sequenze di pre-miRNA mostrano attività di knockdown altrettanto elevate, testare diverse combinazioni di due sequenze e utilizzare le combinazioni che mostrano la più alta attività di knockdown (vedere Risultati rappresentativi).
6. Trasferimento della cassetta di espressione EmGFP-pre-miRNA al vettore del trasposone Tol2
   NOTA: La cassetta di espressione contenente il cDNA EmGFP e due sequenze di pre-miRNA viene trasferita nel vettore del trasposone Tol2 (vettore pT2K-CAGGS, vedi Tabella dei materiali). A tal fine, la cassetta di espressione (che comprende dall'estremità 3' del promotore del CMV al sito del primer di sequenziamento inverso del miRNA del vettore di espressione del miRNA) viene amplificata mediante PCR utilizzando primer con un sito enzimatico di restrizione artificiale e il prodotto della PCR viene clonato nel vettore del trasposone Tol2. Il vettore trasposone Tol2 contiene l'onnipresente promotore CAGGS, che guida l'espressione della cassetta di espressione inserita. Il promotore CAGGS e la cassetta di espressione sono affiancati dalle sequenze Tol2 (Figura 1).
   1. Amplificazione PCR della cassetta di espressione EmGFP-pre-miRNA: Seguire la configurazione della reazione e le condizioni di ciclo termico descritte nella Tabella 3.
   2. Legare il prodotto della PCR purificata con gel (circa 1,3 kb) nel vettore del trasposone Tol2 digerito dall'enzima di restrizione. Elettroporare il plasmide in cellule competenti di E. coli (vedi Tabella dei materiali) e selezionare i ricombinanti (costrutti di miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
   3. Preparare il plasmide utilizzando un kit maxiprep convenzionale (vedere la tabella dei materiali). Controllare la struttura e la sequenza del plasmide mediante mappatura di restrizione e utilizzando i primer utilizzati per la PCR, rispettivamente.

2. Conservazione e incubazione delle uova

1. Acquista uova di Livorno bianco (Gallus gallus) fecondate da fattorie locali o venditori commerciali.
   NOTA: Le uova possono essere conservate a 12-16 °C o a 4 °C fino a 1 settimana prima dell'incubazione senza perdita significativa di vitalità o ritardo nello sviluppo durante l'incubazione.
2. Etichettare le uova con la data di inizio dell'incubazione e segnare il lato superiore dell'uovo (dove verrà posizionato l'embrione). Incubare gli ovuli fecondati in posizione orizzontale a 38 °C fino a quando gli embrioni non hanno raggiunto gli stadi 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)¹⁹.

3. Elettroporazione in ovo

1. Preparazione per l'elettroporazione in ovo
   1. Preparazione della soluzione fast green allo 0,25%: Sciogliere 25 mg di Fast Green FCF in 10 mL di PBS. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm. La soluzione può essere conservata presso RT.
   2. Cocktail di DNA: preparare la soluzione iniettabile mescolando i singoli plasmidi di miRNA pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (sottofase 1.6.3) con il plasmide di espressione della trasposasi Tol2 (vettore pCAGGS-T2TP; vedere la tabella dei materiali) (5 μg/μL ciascuno) in un rapporto di 2:1. Aggiungere 1/10 di volume di soluzione verde veloce allo 0,25% per visualizzare l'area iniettata.
      NOTA: La concentrazione ottimale di DNA può variare a seconda dei costrutti.
   3. Installazione dell'apparecchio per microiniezione (Figura 3A,B): L'apparecchio per microiniezione è costituito dai seguenti elementi (vedere la tabella dei materiali): siringa Hamilton, ago da 18 G (lunghezza dell'ago = 2"), tubo in PVC (cloruro di polivinile) (lunghezza 2 cm), ago per micropipetta (può essere realizzato tirando tubi capillari con fibra omega dot (1 mm O.D. X 0,75 mm I.D) con un estrattore per micropipette).
      1. Riempire una siringa Hamilton con olio minerale pesante. Collegare un ago da 18 G alla siringa e riempire lo spazio interno dell'ago con olio premendo lo stantuffo della siringa.
      2. Attacca un pezzo di tubo in PVC lungo 2 cm all'estremità dell'ago e riempi il tubo con l'olio.
      3. Collegare un ago per micropipetta tirato al tubo. Rompere la punta dell'ago della micropipetta fino a un diametro di 10-20 μm con una pinza sottile per creare una piccola apertura. Riempi l'intero ago con olio.
         NOTA: Bisogna fare attenzione a non intrappolare bolle d'aria nel sistema, in quanto inibirebbero il flusso della soluzione di DNA.
   4. Mettere 5 μL del cocktail di DNA colorato (sottofase 3.1.2) su una capsula di Petri sterile. Sotto il microscopio da dissezione, posizionare la punta dell'ago della micropipetta nella soluzione di DNA sulla piastra di Petri sterile e aspirare lentamente la soluzione nell'ago.
   5. Attendere che la pressione si equilibri all'interno e all'esterno dell'ago (per evitare che l'aria entri nell'ago) ed estrarre la punta dell'ago dalla soluzione di DNA. Tenere la punta dell'ago immersa in PBS sterile in un piccolo becher fino all'iniezione.
   6. Installazione dell'apparecchio per l'elettroporazione (Figura 3A,C):
      1. Posizionare una coppia di elettrodi in platino con un portaelettrodo su un micromanipolatore. Regolare la distanza tra la punta degli elettrodi a 2 mm (Figura 3C,E).
      2. Collegare gli elettrodi a un generatore di impulsi a onda quadra con cavi (vedi Tabella dei materiali).
2. Microiniezione di soluzione di DNA (Figura 3D)
   1. Togliete un uovo di gallina dall'incubatrice e pulite la superficie dell'uovo con un fazzoletto imbevuto di etanolo al 70%.
   2. Collegare un ago da 18 G a una siringa da 10 ml. Inserire l'ago attraverso l'estremità smussata dell'uovo, inclinato verso il basso (45°) per evitare di danneggiare il tuorlo.
   3. Prelevare 2-3 ml di albumina dall'uovo. Sigilla il foro con un pezzo di nastro adesivo. Verificare che l'embrione e la membrana vitellina si siano staccati dal guscio "incandando" l'uovo con la luce.
   4. Rimuovere un pezzo di guscio d'uovo (cerchio di 2-3 cm di diametro) dalla parte superiore dell'uovo usando forbici e pinze per esporre l'embrione. Non finestrare più di cinque ovuli alla volta per evitare che gli embrioni si secchino durante l'elettroporazione.
      NOTA: Se è difficile aprire una finestra senza rompere l'uovo, l'intera parte superiore dell'uovo può essere coperta con nastro adesivo o scotch prima di rimuovere un pezzo di guscio d'uovo.
   5. Inserire la punta dell'ago nella vescicola ottica dal lato prossimale con un angolo di 45° e iniettare il cocktail di DNA premendo lentamente (o picchiettando) lo stantuffo fino a quando la soluzione di colore blu riempie il lume (Figura 3D).
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema di microiniezione a pressione (vedi Tabella dei materiali) per l'iniezione di soluzioni di DNA.
   6. Estrarre l'ago e riposizionare la punta nel PBS.
3. Elettroporazione (Figura 3E)
   1. Impostare i parametri dell'impulso dell'elettroporatore come segue: Tensione: 15 V, Lunghezza dell'impulso: 50 ms, Intervallo dell'impulso: 950 ms, Numero di impulsi: 5
   2. Aggiungere alcune gocce di HBSS sulla membrana vitellina sopra l'embrione. Abbassare gli elettrodi nell'HBSS utilizzando il micromanipolatore, perpendicolare all'asse antero-posteriore dell'embrione.
      NOTA: In alternativa, questa procedura può essere eseguita senza l'aggiunta di HBSS, poiché l'albumina è un buon conduttore elettrico che consente un'elettroporazione efficiente.
   3. Posizionare gli elettrodi su entrambi i lati (lato anteriore (nasale) e lato posteriore (temporale)) della vescicola ottica (Figura 3E). Assicurarsi che gli elettrodi non tocchino l'embrione o i vasi sanguigni. Applicare campi elettrici pulsati.
   4. Rimuovere gli elettrodi e pulirli delicatamente con un batuffolo di cotone sterile imbevuto d'acqua per evitare l'accumulo di albumina.
   5. Sigillare la finestra con dello scotch e reincubare l'embrione fino allo stadio di sviluppo desiderato.

Risultati

Costruzione di costrutti di trasposoni Tol2 per l'espressione di miRNA artificiali contro Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; noto anche come Nell2) è una glicoproteina extracellulare. Ha somiglianze strutturali con la trombospondina-1 ed è prevalentemente espressa nel sistema nervoso^20,21. Abbiamo precedentemente dimostrato che Nel regola la differenziazione e la sopravvivenza delle cellule gangliari ret...

Discussione

Questo protocollo fornisce una guida dettagliata al silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo mediante l'espressione transgenica di miRNA artificiali utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposone Tol2.

I seguenti fattori sono di fondamentale importanza per eseguire con successo questa tecnica. In primo luogo, è fondamentale utilizzare sequenze di miRNA che hanno dimostrato di esercitare robusti effetti di knockdown. Prima di applicarli per l'...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needle, 2"	VWR	89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B	GenHunter Corp	Q201 and Q202	Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg	Sigma-Aldrich	A2153
C115CB cables	Sonidel	C115CB	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables	Sonidel	C117	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)	FHC	30-30-1	1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator	Nepa Gene	CUY21
Diethanolamine (pH 9.8)	Sigma-Aldrich	D8885
Dissecting microscope
Egg incubator	Kurl	B-Lab-600-110	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder	Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF	Sigma-Aldrich	F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)	Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent	Promega	E2691
Hamilton syringe (50 μL)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6648
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-Homoarginine	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
Micromanipulator	Narishige (Japan)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller	Shutter Instrument	P97
p-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich	20-106
PBS	Sigma-Aldrich	D8662
pCAGGS-T2TP vector			Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (Optional)	Parker		Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit	Qiagen	12163	Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector			Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing	VWR (UK)	228-3830
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP	Invitrogen	K493600	Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler