Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l'introduzione e l'integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.

Abstract

La retina del pulcino è stata a lungo un importante sistema modello nella neurobiologia dello sviluppo, con vantaggi tra cui le sue grandi dimensioni, il rapido sviluppo e l'accessibilità per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. Tuttavia, il suo principale limite tecnico era la mancanza di solidi approcci di perdita di funzione per le analisi della funzione genica. Questo protocollo descrive una metodologia di silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo che coinvolge l'espressione transgenica di microRNA artificiali (miRNA) utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. In questo approccio, un plasmide trasposone Tol2 che contiene una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e sequenze pre-miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo . Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l'escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell'ospite, portando all'espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che l'espressione di Nel, una glicoproteina che esercita molteplici funzioni nello sviluppo neurale, può essere significativamente soppressa nella retina del pulcino in via di sviluppo utilizzando questa tecnica. I nostri risultati indicano che questa metodologia induce una soppressione stabile e robusta dell'espressione genica e quindi fornisce un approccio efficiente alla perdita di funzione per gli studi sullo sviluppo della retina.

Introduzione

La retina dei vertebrati è un importante sistema modello per lo studio dello sviluppo neurale. Nonostante la sua posizione periferica, la retina è anatomicamente e dal punto di vista dello sviluppo un'estensione del sistema nervoso centrale e il nervo ottico, costituito da assoni di cellule gangliari retiniche, rappresenta un tratto all'interno del sistema nervoso centrale. La retina del pulcino presenta vantaggi significativi come sistema modello per studiare il meccanismo molecolare dello sviluppo neurale: è grande e si sviluppa rapidamente; presenta somiglianze strutturali e funzionali con la retina umana; È altamente accessibile per la visualizzazione e le manipol....

Protocollo

1. Costruzione di vettori di espressione dei miRNA

NOTA: Le procedure per la costruzione di vettori di espressione di miRNA (passaggi 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sono ottimizzate per il kit di espressione di miRNA, kit di espressione di miRNA Block-iT Pol II miR con EmGFP, come descritto in precedenza^15,16. Il kit fornisce il vettore di espressione progettato per consentire l'espressione di miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vettore di controllo (plasmide di controllo pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativo), reagenti accessori e istruzioni per produrre vettori di espressione di miR....

Risultati

Costruzione di costrutti di trasposoni Tol2 per l'espressione di miRNA artificiali contro Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; noto anche come Nell2) è una glicoproteina extracellulare. Ha somiglianze strutturali con la trombospondina-1 ed è prevalentemente espressa nel sistema nervoso^20,21. Abbiamo precedentemente dimostrato che Nel regola la differenziazione e la sopravvivenza delle cellule gangliari ret.......

Discussione

Questo protocollo fornisce una guida dettagliata al silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo mediante l'espressione transgenica di miRNA artificiali utilizzando l'elettroporazione in ovo e il sistema di trasposone Tol2.

I seguenti fattori sono di fondamentale importanza per eseguire con successo questa tecnica. In primo luogo, è fondamentale utilizzare sequenze di miRNA che hanno dimostrato di esercitare robusti effetti di knockdown. Prima di applicarli per l'.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needle, 2"	VWR	89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B	GenHunter Corp	Q201 and Q202	Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg	Sigma-Aldrich	A2153
C115CB cables	Sonidel	C115CB	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables	Sonidel	C117	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)	FHC	30-30-1	1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator	Nepa Gene	CUY21
Diethanolamine (pH 9.8)	Sigma-Aldrich	D8885
Dissecting microscope
Egg incubator	Kurl	B-Lab-600-110	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder	Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF	Sigma-Aldrich	F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)	Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent	Promega	E2691
Hamilton syringe (50 μL)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6648
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-Homoarginine	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
Micromanipulator	Narishige (Japan)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller	Shutter Instrument	P97
p-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich	20-106
PBS	Sigma-Aldrich	D8662
pCAGGS-T2TP vector			Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (Optional)	Parker		Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit	Qiagen	12163	Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector			Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing	VWR (UK)	228-3830
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP	Invitrogen	K493600	Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler