JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали новый подход к потере функции, который включает в себя введение и геномную интеграцию искусственных последовательностей микро-РНК в эмбрионы цыплят с использованием внутрияйцевой электропорации и транспозонной системы Tol2. Этот метод обеспечивает надежную и стабильную методологию нокдауна генов для изучения функции генов во время развития.

Аннотация

Сетчатка цыпленка долгое время была важной модельной системой в нейробиологии развития, обладая такими преимуществами, как ее большой размер, быстрое развитие и доступность для визуализации и экспериментальных манипуляций. Тем не менее, его основным техническим ограничением было отсутствие надежных подходов к анализу функций генов. Этот протокол описывает методологию подавления экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка, которая включает трансгенную экспрессию искусственных микроРНК (микроРНК) с использованием системы транспозонов Tol2. В этом подходе плазмида транспозона Tol2, содержащая кассету для экспрессии маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственные последовательности пре-микроРНК против гена-мишени, вводится в сетчатку эмбриона цыпленка с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2 путем электропорации in ovo . В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что экспрессия Nel, гликопротеина, который выполняет несколько функций в развитии нервной системы, может быть значительно подавлена в развивающейся сетчатке цыпленка с помощью этого метода. Наши результаты показывают, что эта методология индуцирует стабильное и надежное подавление экспрессии генов и, таким образом, обеспечивает эффективный подход к потере функции для исследований развития сетчатки.

Введение

Сетчатка позвоночных является важной модельной системой для изучения развития нервной системы. Несмотря на периферическое расположение, сетчатка анатомически и эволюционно является продолжением центральной нервной системы, а зрительный нерв, состоящий из аксонов ганглиозных клеток сетчатки, представляет собой тракт в центральной нервной системе. Сетчатка цыпленка имеет существенные преимущества в качестве модельной системы для изучения молекулярного механизма развития нервов: она крупная и быстро развивается; она имеет структурное и функциональное сходство с сетчаткой человека; Он легко доступен для визуализации и экспериментальных манипуляций. Молекулярные механизмы пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза и управления аксонами во время развития нейронов были широко изучены с использованием сетчатки курицы.

Электропорация in ovo успешно используется в течение последних двух десятилетий для введения эктопических генов в клетки развивающегося эмбриона цыпленка. Этот метод позволяет мечить развивающиеся клетки, отслеживать судьбу клеток, отслеживать миграцию клеток и тракты аксонов, а также экспрессию эктопических генов для анализа функции генов in vivo. Хорошо установлены условия in ovo электропорации для эффективной экспрессии эктопических генов в куриных эмбрионах 1,2,3.

Несмотря на эти преимущества, отсутствие стабильного метода потери функции для изучения функции генов было основным техническим ограничением эмбриона цыпленка. В то время как эмбрионы цыплят, электропорированные малыми интерферирующими РНК (миРНК)4 или векторами экспрессии для коротких шпильчатых РНК (шРНК)5, демонстрируют нокдаун гена-мишени, подавление генов в этих подходах является временным, поскольку эффекты исчезают, как только клетки теряют введенные РНК или ДНК. Более стабильная подавление генов может быть достигнута путем доставки миРНК в эмбрионы цыплят с помощью ретровируснойсистемы RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) с длинным терминальным повтором (LTR) с акцептором S-plice). Вирусный вектор встраивается в геном хозяина, и эктопические гены стабильно экспрессируются. Тем не менее, ретровирус может интегрироваться в геном делящихся клеток только во время митотической (М) фазы клеточного цикла, что может наложить ограничения на стадии развития и/или типы клеток, для которых может быть применен этот подход с потерей функции. Кроме того, экспрессия трансгенов RCAS оказывается более медленной и менее устойчивой, чем экспрессия, индуцированная in ovo electroporation7.

Транспозоны — это генетические элементы, которые перемещаются из одного места генома в другое. Элемент Tol2 является членом семейства транспозируемых элементов hAT и содержит внутренний ген, кодирующий транспозазу, которая катализирует транспозонную реакцию элемента Tol28. Когда плазмидный вектор, несущий кассету экспрессии гена, окруженную последовательностями левого и правого концов элементов Tol2 (200.н. и 150.н., соответственно), вводится в клетки позвоночных с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2, экспрессионная кассета вырезается из плазмиды и интегрируется в геном хозяина, что поддерживает стабильную экспрессию эктопического гена (рис.). Было показано, что транспозируемый элемент Tol2 может очень эффективно индуцировать транспозицию генов у различных видов позвоночных, включая рыбок данио-рерио9,10, лягушек 11, цыплят 12 и мышей 13, и, таким образом, является полезным методом трансгенеза и инсерционного мутагенеза. Транспозонная система Tol2 была успешно использована для условного нокдауна гена-мишени путем геномной интеграции миРНК, обработанной из длинной двухцепочечной РНК14.

Этот протокол описывает подход с потерей функции у эмбриона цыпленка, который включает введение искусственных микроРНК (микроРНК) с помощью транспозонной системы Tol215,16. В этом подходе экспрессионная кассета для маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственных микроРНК против гена-мишени клонируется в транспозонный вектор Tol2. Затем транспозонная конструкция Tol2 вводится в эмбриональную сетчатку цыпленка с конструкцией экспрессии Tol2 транспозазы путем электропорации in ovo. В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В наших предыдущих исследованиях мы успешно сбивали экспрессию Nel, внеклеточного гликопротеина, преимущественно экспрессируемого в нервной системе, в развивающейся сетчатке цыпленка (см. Репрезентативные результаты). Наши результаты показывают, что стабильная и эффективная подавление генов может быть достигнута in ovo с помощью этого метода.

протокол

1. Построение векторов экспрессии микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры конструирования векторов экспрессии микроРНК (шаги 1.1-1.3, 1.5-1.6.) оптимизированы для набора экспрессии микроРНК, набора экспрессии miРНК Block-iT Pol II miR с EmGFP, как описано ранее15,16. Набор содержит вектор экспрессии, предназначенный для экспрессии микроРНК (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), контрольный вектор (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-отрицательная контрольная плазмида), вспомогательные реагенты и инструкции для получения векторов экспрессии микроРНК (см. таблицу материалов)17.

  1. Проектирование одноцепочечных ДНК-олиго, кодирующих пре-микроРНК по отношению к гену-мишени: Проектирование одноцепочечных ДНК-олиго («верхнецепочечные» олиго (целевые пре-микроРНК) и «нижнецепочечные» олиго (дополнения верхнецепочечных олиго)) с помощью онлайн-инструмента RNAi Designer (см. таблицу материалов). На рисунке 2 приведены требуемые характеристики одноцепочечных олигов (рисунок 2A) и примеры целевых последовательностей (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сгенерировать 5-10 последовательностей пре-микроРНК для данного гена-мишени и провести скрининг на нокдаунную активность in vitro (шаг 1.4).
  2. Отжиг верхне- и нижнецепочечных олигопластов с получением двухцепочечного олиго
    1. Установите следующую реакцию отжига (табл. 1) в стерильной пробирке для микроцентрифуги объемом 0,5 мл.
    2. Инкубируют реакционную смесь при 95 °C в течение 4 мин. Отожгите верхне- и нижнецепочечные олигопласты для получения двухцепочечного олиго, дав реакционной смеси остыть до комнатной температуры (RT) в течение 5-10 минут. Кратковременно центрифугируют образец (~5 с).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отожженные олигопласты можно хранить при температуре -20 °C без разложения не менее года.
  3. Клонирование двухцепочечных олигов в вектор экспрессии микроРНК (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (входит в набор для экспрессии микроРНК)): клонирование отдельных двухцепочечных олигов в линеаризованный вектор экспрессии микроРНК в соответствии с руководством производителя17.
  4. Оценка нокдаун-эффектов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тестировать отдельные последовательности микроРНК на эффективность подавления генов in vitro перед их применением in ovo. Эффективность нокдауна может быть проверена путем трансфекции плазмид экспрессии микроРНК в клеточную линию, которая экспрессирует ген-мишень. В качестве альтернативы, отдельные плазмиды экспрессии микроРНК могут быть котрансфицированы в клеточные линии с конструкцией экспрессии для гена-мишени. Для генов-мишеней, кодирующих белки, которые не привязаны к мембране в их нативном состоянии (например, растворимые белки), для мониторинга экспрессии белка-мишени можно использовать белок слияния щелочной фосфатазы (АР). Последовательность кДНК, кодирующая белок-мишень, может быть слита в рамке с плацентарной щелочной фосфатазой человека в векторах AP-tag (APtag-1-APtag-5; см. таблицу материалов) и введена в клетки18. При экспрессии в культуральных клетках (например, HEK293T клетках) меченый AP белок-мишень секретируется на высоких уровнях в питательные среды, и, таким образом, нокдаунные эффекты последовательностей микроРНК могут быть оценены путем измерения снижения активности AP в питательных средах клеток, трансфицированных микроРНК (подшаги 1.4.1-1.4.4).
    1. Культивирование HEK293T клеток в 24-луночном планшете (8 x 10,4 клетки/лунка) в течение ночи. Транзиторная трансфектация клеток с индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК плазмидой экспрессии белка-мишени, меченного AP. В качестве контроля используют контрольную плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (входит в набор для экспрессии микроРНК). (Если используются клеточные линии, которые стабильно экспрессируют белок-мишень, помеченный AP, трансфицируйте клетки только индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК.)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции используется обычный реагент для липофектирования (см. Таблицу материалов).
    2. Кондиционированную среду собирают через 48-72 ч после трансфекции и тепло инактивируют эндогенную активность ЩФ на водяной бане с 65 °С в течение 5 мин. Отжим мусор в настольной микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 5 мин.
    3. Буферизуйте надосадочную жидкость 10 мМ HEPES, pH 7,0 и пропустите через фильтр 0,45 мкм.
    4. Возьмите 100 мкл (для измерения в планшетном ридере) или 500 мкл (для спектрофотометра) надосадочной жидкости и добавьте равное количество 2-кратного буфера подложки AP (Таблица 2). Проверьте активность AP, измерив OD405 в планшетном ридере или спектрофотометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если активность AP кондиционированной среды слишком высока для точного измерения, разбавьте ее буфером HBAH (сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 20 мМ HEPES (pH 7,0)) или другим буфером, содержащим белок-носитель. Не используйте фосфатсодержащие буферы (например, PBS), поскольку неорганический фосфат действует как конкурентный ингибитор AP.
  5. Сцепление последовательностей микроРНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нокдаун-эффекты могут быть усилены путем сцепления различных микроРНК с одним и тем же геном-мишенью или повторения одной и той же микроРНК. Вектор экспрессии микроРНК поддерживает сцепление нескольких последовательностей пре-микроРНК и их коцистронную экспрессию17.
    1. В соответствии с инструкциями производителя 17 в цепочке две различные последовательности пре-микроРНК (против одного и того же гена-мишени), которые демонстрируют наибольшую нокдаунную активность в анализах in vitro (шаг1.4).
    2. Оцените эффективность подавления генов цепных конструкций с помощью анализов in vitro , как описано в шаге 1.4. Если три или более последовательностей пре-микроРНК демонстрируют одинаково высокую нокдаунную активность, протестируйте различные комбинации двух последовательностей и используйте комбинации, которые показывают наибольшую нокдаунную активность (см. Репрезентативные результаты).
  6. Перенос экспрессионной кассеты EmGFP-pre-miRNA на транспозонный вектор Tol2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессионная кассета, содержащая кДНК EmGFP и две последовательности пре-микроРНК, переносится в транспозонный вектор Tol2 (вектор pT2K-CAGGS, см. таблицу материалов). С этой целью экспрессионную кассету (охватывающую от 3'-конца промотора ЦМВ до праймерного сайта обратного секвенирования микроРНК вектора экспрессии микроРНК) амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров с искусственным сайтом фермента рестрикции, а продукт ПЦР клонируют в транспозонный вектор Tol2. Транспозонный вектор Tol2 содержит вездесущий промотор CAGGS, который управляет экспрессией вставленной кассеты экспрессии. Промотор CAGGS и кассета экспрессии окружены последовательностями Tol2 (рис. 1).
    1. ПЦР-амплификация кассеты экспрессии EmGFP-pre-miRNA: Соблюдайте схему реакции и условия термоциклирования, описанные в таблице 3.
    2. Лигируют очищенный гелем продукт ПЦР (около 1,3 kb) в транспозонный вектор Tol2, перевариваемый ферментом рестрикции. Электропоируют плазмиду в компетентные клетки E. coli (см. таблицу материалов) и отбирают рекомбинанты (конструкции микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
    3. Подготовьте плазмиду с помощью обычного набора maxiprep (см. таблицу материалов). Проверяют структуру и последовательность плазмиды с помощью рестрикционного картирования и с помощью праймеров, используемых для ПЦР, соответственно.

2. Хранение и инкубация яиц

  1. Покупайте оплодотворенные яйца белого леггорна (Gallus gallus) на местных фермах или у коммерческих продавцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить при температуре 12-16 °C или 4 °C в течение 1 недели до инкубации без существенной потери жизнеспособности или задержки развития во время инкубации.
  2. Пометьте яйца датой начала инкубации и отметьте верхнюю сторону яйца (где будет располагаться эмбрион). Инкубируйте оплодотворенные яйца в горизонтальном положении при температуре 38 °C до тех пор, пока эмбрионы не достигнут стадий Гамбургера и Гамильтона (HH) 10 (33-38 ч) -11 (40-45 ч)19.

3. Электропорация in ovo

  1. Подготовка к электропорации in ovo
    1. Приготовление 0,25% раствора Fast Green: Растворите 25 мг Fast Green FCF в 10 мл PBS. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Решение может храниться в RT.
    2. Коктейль ДНК: Приготовьте раствор для инъекций, смешав отдельные плазмиды микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (подэтап 1.6.3) с плазмидой экспрессии транспозазы Tol2 (вектор pCAGGS-T2TP; см. таблицу материалов) (5 мкг/мкл каждая) в соотношении 2:1. Добавьте 1/10 объема 0,25% раствора быстрого зеленого цвета, чтобы визуализировать область инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация ДНК может варьироваться в зависимости от конструктов.
    3. Настройка аппарата для микроинъекций (Рисунок 3A, B): Аппарат для микроинъекций состоит из следующих компонентов (см. Таблицу материалов): шприц Гамильтона, игла 18 G (длина иглы = 2 дюйма), трубка из ПВХ (поливинилхлорида) (длина 2 см), игла для микропипетки (может быть изготовлена путем вытягивания капиллярных трубок с омега-точечным волокном (внутренний диаметр 1 мм X 0,75 мм) с помощью съемника микропипетки).
      1. Наполните шприц Hamilton тяжелым минеральным маслом. Присоедините иглу 18 G к шприцу и заполните внутреннее пространство иглы маслом, нажав на поршень шприца.
      2. Прикрепите к концу иглы кусок трубки из ПВХ длиной 2 см и наполните трубку маслом.
      3. Прикрепите к трубке вытянутую иглу для микропипетки. Отломите кончик иглы микропипетки до диаметра 10-20 мкм тонкими щипцами, чтобы сделать небольшое отверстие. Залейте всю иглу маслом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует следить за тем, чтобы в системе не попадали пузырьки воздуха, так как они будут препятствовать потоку раствора ДНК.
    4. Поместите 5 мкл цветного коктейля ДНК (подшаг 3.1.2) в стерильную чашку Петри. Под препарирующим микроскопом поместите кончик иглы микропипетки в раствор ДНК на стерильной чашке Петри и медленно втяните раствор в иглу.
    5. Подождите, пока давление внутри и снаружи иглы не уравновесится (чтобы избежать попадания воздуха в иглу), и выньте кончик иглы из раствора ДНК. Держите кончик иглы погруженным в стерильный PBS в небольшом стакане до инъекции.
    6. Настройка электропорационного аппарата (рис. 3А,В):
      1. Установите пару платиновых электродов с электрододержателем на микроманипулятор. Отрегулируйте расстояние между кончиками электродов до 2 мм (рис. 3C, E).
      2. Подключите электроды к генератору импульсов прямоугольной формы с помощью кабелей (см. Таблицу материалов).
  2. Микроинъекция раствора ДНК (рис. 3D)
    1. Достаньте куриное яйцо из инкубатора и протрите поверхность яйца папиросной бумагой, смоченной в 70% этаноле.
    2. Прикрепите иглу 18 G к шприцу объемом 10 мл. Введите иглу через тупой конец яйца под углом вниз (45°), чтобы не повредить желток.
    3. Из яйца вывести 2-3 мл альбумина. Заклейте отверстие куском скотча. Убедитесь, что эмбрион и вителлиновая оболочка отделены от скорлупы, «просвечивая» яйцо светом.
    4. Удалите кусочек яичной скорлупы (круг диаметром 2-3 см) с верхней части яйца с помощью ножниц и щипцов, чтобы обнажить эмбрион. Не выбрасывайте более пяти яйцеклеток одновременно, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов во время электропорации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно открыть окно, не разбив яйцо, всю верхнюю часть яйца можно закрыть скотчем или скотчем, прежде чем удалять кусочек яичной скорлупы.
    5. Введите кончик иглы в пузырь зрительного нерва с его проксимальной стороны под углом 45° и введите коктейль ДНК, медленно нажимая (или постукивая) на поршень до тех порций, пока раствор синего цвета не заполнит просвет (рис. 3D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для инъекции растворов ДНК можно использовать систему микровпрыска под давлением (см. Таблицу материалов).
    6. Извлеките иглу и поместите ее кончик обратно в PBS.
  3. Электропорация (Рисунок 3E)
    1. Установите параметры импульсов электропоратора следующим образом: Напряжение: 15 В, Длительность импульса: 50 мс, Интервал импульсов: 950 мс, Число импульсов: 5
    2. Добавьте несколько капель HBSS на вителлиновую мембрану над эмбрионом. Опустите электроды в HBSS с помощью микроманипулятора, перпендикулярно передне-задней оси эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы эту процедуру можно выполнить без добавления HBSS, так как альбумин является хорошим электрическим проводником, обеспечивающим эффективную электропорацию.
    3. Расположите электроды по обе стороны (передняя (носовая) и задняя (височная) сторона) от пузырька зрительного нерва (рисунок 3E). Следите за тем, чтобы электроды не касались эмбриона или кровеносных сосудов. Воздействуют на импульсные электрические поля.
    4. Снимите электроды и аккуратно очистите их смоченной в воде стерильной ватной палочкой, чтобы избежать скопления альбумина.
    5. Заклейте окно скотчем и повторно инкубируйте эмбрион до желаемой стадии развития.

Результаты

Построение транспозонных конструкций Tol2 для экспрессии искусственных микроРНК против Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; также известен как Nell2) представляет собой внеклеточный гликопротеин. Он имеет структурное сходство с тромбоспондином-1 и преимущественно экспресс?...

Обсуждение

Этот протокол представляет собой подробное руководство по подавлению экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка путем трансгенной экспрессии искусственных микроРНК с использованием овоэлектропорации и системы транспозонов Tol2.

Следующие факторы имеют р?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Векторы pT2K-CAGGS и pCAGGS-T2TP были любезно предоставлены Йошико Такахаси (Киотский университет, Киото, Япония) и Коити Каваками (Национальный институт генетики, Мисима, Япония) соответственно. Мы благодарим Михаэля Бербероглу за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами Королевского общества и Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BBSRC) (Великобритания).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
18 G needle, 2"VWR89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit BGenHunter CorpQ201 and Q202Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi DesignerInvitrogenAn online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mgSigma-AldrichA2153
C115CB cablesSonidelC115CBhttps://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cablesSonidelC117https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)FHC30-30-11 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporatorNepa GeneCUY21
Diethanolamine (pH 9.8)Sigma-AldrichD8885
Dissecting microscope
Egg incubatorKurlB-Lab-600-110https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holderSonidelCUY580https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
ElectrodesNepa GeneCUY611P3-1https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10BInvitrogen18290-015Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCFSigma-AldrichF7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagentPromegaE2691
Hamilton syringe (50 μL)Sigma-Aldrich20715Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solutionSigma-AldrichH6648
Heavy mineral oilSigma-Aldrich330760
HEPESGIBCO15630080
L-HomoarginineSigma-AldrichH10007
MgCl2Sigma-Aldrich13112
MicromanipulatorNarishige (Japan)MM3http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette pullerShutter InstrumentP97
p-NitrophenylphosphateSigma-Aldrich20-106
PBSSigma-AldrichD8662
pCAGGS-T2TP vectorTol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
PfuThermoFisherF566S
Picospritzer (Optional)ParkerPressure microinjection system
Plasmid maxi kitQiagen12163Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vectorTol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubingVWR (UK)228-3830
SpectinomycinSigma-AldrichS9007-5
T4 DNA ligasePromegaM1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFPInvitrogenK493600Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler

Ссылки

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
  2. Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
  3. Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
  4. Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
  5. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
  6. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
  7. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  8. Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
  9. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  10. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  11. Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
  12. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
  13. Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
  14. Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
  15. Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
  16. Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
  17. BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
  18. Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  20. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
  21. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
  22. Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
  23. Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
  24. Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
  25. Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183in ovo electroporationTol2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены