Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Zusammenfassung

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Zusammenfassung

Die Netzhaut von Küken ist seit langem ein wichtiges Modellsystem in der Entwicklungsneurobiologie, mit Vorteilen wie ihrer Größe, ihrer schnellen Entwicklung und ihrer Zugänglichkeit für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen. Seine größte technische Einschränkung war jedoch das Fehlen robuster Loss-of-Function-Ansätze für Genfunktionsanalysen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Gen-Silencings in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken, die die transgene Expression künstlicher microRNAs (miRNAs) unter Verwendung des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Bei diesem Ansatz wird ein Tol2-Transposon-Plasmid, das eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche prä-miRNA-Sequenzen gegen ein Zielgen enthält, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass die Expression von Nel, einem Glykoprotein, das mehrere Funktionen in der neuronalen Entwicklung ausübt, durch diese Technik in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken signifikant unterdrückt werden kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methodik eine stabile und robuste Unterdrückung der Genexpression induziert und somit einen effizienten Loss-of-Function-Ansatz für Studien zur Netzhautentwicklung bietet.

Einleitung

Die Netzhaut von Wirbeltieren ist ein wichtiges Modellsystem für die Erforschung der neuronalen Entwicklung. Trotz ihrer peripheren Lage ist die Netzhaut anatomisch und entwicklungsbedingt eine Erweiterung des zentralen Nervensystems, und der Sehnerv, der aus Axonen retinaler Ganglienzellen besteht, stellt einen Trakt innerhalb des zentralen Nervensystems dar. Die Netzhaut von Küken hat als Modellsystem zur Untersuchung des molekularen Mechanismus der neuronalen Entwicklung erhebliche Vorteile: Sie ist groß und entwickelt sich schnell; Es hat strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit der menschlichen Netzhaut; Es ist für Visualisierungen und experimentelle Manipulationen leicht zugänglich. Molekulare Mechanismen der Zellproliferation und -differenzierung, der Morphogenese und der Axonführung während der neuronalen Entwicklung wurden mit Hilfe der Hühnerretina umfassend untersucht.

Die In-ovo-Elektroporation wurde in den letzten zwei Jahrzehnten erfolgreich eingesetzt, um ektopische Gene in Zellen des sich entwickelnden Kükenembryos einzuschleusen. Diese Technik ermöglicht die Markierung von sich entwickelnden Zellen, die Verfolgung des Zellschicksals und die Rückverfolgung von Zellmigration und Axonbahnen sowie die ektopische Genexpression für die In-vivo-Analyse der Genfunktion. Die Bedingungen der in ovo Elektroporation für eine effiziente ektopische Genexpression in Kükenembryonen sind gut etabliert ^1,2,3.

Trotz dieser Vorteile war das Fehlen einer stabilen Loss-of-Function-Technik für die Untersuchung der Genfunktion eine wesentliche technische Einschränkung des Kükenembryos. Während Kükenembryonen, die mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)4 oder Expressionsvektoren für kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs⁾⁵ elektroporiert wurden, einen Knockdown des Zielgens zeigen, ist die Gensuppression bei diesen Ansätzen vorübergehend^, da die Effekte verschwinden, sobald die Zellen die eingeführten RNAs oder DNAs verlieren. Eine stabilere Gensuppression kann durch die Verabreichung von siRNAs in Kükenembryonen durch ein RCAS-Retrovirussystem (R eplication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a S pliceacceptor) erreicht werden⁶. Der virale Vektor integriert sich in das Wirtsgenom und die ektopischen Gene werden stabil exprimiert. Das Retrovirus kann sich jedoch nur während der mitotischen (M)-Phase des Zellzyklus in das Genom sich teilender Zellen integrieren, was die Entwicklungsstadien und/oder Zelltypen, für die dieser Loss-of-Function-Ansatz angewendet werden kann, einschränken kann. Darüber hinaus scheint die Expression von Transgenen durch RCAS langsamer und weniger robust zu sein als diejenige, die durch In-ovo-Elektroporation induziert wird⁷.

Transposons sind genetische Elemente, die sich von einer Stelle im Genom zu einer anderen bewegen. Das Tol2-Element ist ein Mitglied der Familie der hAT-transponierbaren Elemente und enthält ein internes Gen, das für eine Transposase kodiert, die die Transposon-Reaktion des Tol2-Elements⁸ katalysiert. Wenn ein Plasmidvektor, der eine Genexpressionskassette trägt, die von den Sequenzen des linken und rechten Endes der Tol2-Elemente (200 bp bzw. 150 bp) flankiert wird, mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt in Wirbeltierzellen eingeführt wird, wird die Expressionskassette aus dem Plasmid herausgeschnitten und in das Wirtsgenom integriert, das eine stabile Expression des ektopischen Gens unterstützt (Abbildung 1). Es wurde gezeigt, dass das transponierbare Element Tol2 die Gentransposition in verschiedenen Wirbeltierarten, einschließlich Zebrafisch 9,10, Frösche 11, Küken¹² und Mäuse^13, sehr effizient induzieren kann und somit eine nützliche Methode der Transgenese und Insertionsmutagenese ist. Das Tol2-Transposon-System wurde erfolgreich für den konditionalen Knockdown eines Zielgens durch genomische Integration von siRNA eingesetzt, die aus langer doppelsträngiger RNA¹⁴ prozessiert wird.

Dieses Protokoll beschreibt einen Loss-of-Function-Ansatz im Kükenembryo, bei dem künstliche microRNAs (miRNAs) durch das Tol2-Transposon-System eingeführt werden^15,16. Bei diesem Ansatz wird eine Expressionskassette für den EmGFP-Marker (smaragdgrün fluoreszierendes Protein) und künstliche miRNAs gegen ein Zielgen in einen Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Das Tol2-Transposon-Konstrukt wird dann mit einem Tol2-Transposase-Expressionskonstrukt durch In-ovo-Elektroporation in die embryonale Kükennetzhaut eingeführt. In den transfizierten Netzhautzellen katalysiert die Transposase die Exzision der Expressionskassette aus dem Transposon-Vektor und deren Integration in die Wirtschromosomen, was zu einer stabilen Expression von miRNAs und des EmGFP-Proteins führt. In unseren früheren Studien ist es uns gelungen, die Expression von Nel, einem extrazellulären Glykoprotein, das hauptsächlich im Nervensystem exprimiert wird, in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken zu reduzieren (siehe Repräsentative Ergebnisse). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit dieser Technik eine stabile und effiziente Gensuppression in ovo erreicht werden kann.

Protokoll

1. Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren

ANMERKUNG: Die Verfahren zur Konstruktion von miRNA-Expressionsvektoren (Schritte 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sind für das miRNA-Expressionskit Block-iT Pol II miR RNA-Expressionskit mit EmGFP optimiert, wie zuvor^{beschrieben 15,16}. Das Kit enthält den Expressionsvektor, der die miRNA-Expression ermöglicht (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), einen Kontrollvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatives Kontrollplasmid), akzessorische Reagenzien und Anweisungen zur Herstellung von miRNA-Expressionsvektoren (siehe Materialtabelle⁾¹⁷.

1. Design von einzelsträngigen DNA-Oligos, die für prä-miRNAs gegen das Zielgen kodieren: Entwerfen Sie einzelsträngige DNA-Oligos ("Top-Strand"-Oligos (Ziel-Prä-miRNAs) und "Bottom-Strand"-Oligos (Komplemente von Top-Strang-Oligos)) mit dem Online-Tool RNAi Designer (siehe Materialtabelle). Abbildung 2 zeigt die erforderlichen Eigenschaften der einzelsträngigen Oligos (Abbildung 2A) und Beispiele für Zielsequenzen (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 5-10 prä-miRNA-Sequenzen für ein bestimmtes Zielgen zu generieren und in vitro auf Knockdown-Aktivitäten zu untersuchen (Schritt 1.4).
2. Tempern der Ober- und Unterstrangoligos zur Erzeugung eines doppelsträngigen Oligos
   1. Stellen Sie die folgende Glühreaktion (Tabelle 1) in einem sterilen 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein.
   2. Das Reaktionsgemisch wird bei 95 °C für 4 min inkubiert. Glühen Sie die Ober- und Unterstrangoligos, um ein doppelsträngiges Oligo zu erzeugen, indem Sie das Reaktionsgemisch 5-10 Minuten lang auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen. Die Probe kurz zentrifugieren (~5 s).
      HINWEIS: Die geglühten Oligos können bei -20 °C ohne Degradation mindestens ein Jahr lang gelagert werden.
3. Klonierung der doppelsträngigen Oligos in den miRNA-Expressionsvektor (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (im miRNA-Expressionskit enthalten)): Klonieren einzelner doppelsträngiger Oligos in den linearisierten miRNA-Expressionsvektor gemäß dem Herstellerhandbuch¹⁷.
4. Bewertung von Knockdown-Effekten
   HINWEIS: Es wird empfohlen, einzelne miRNA-Sequenzen in vitro auf ihre Gensuppressionseffizienz zu testen, bevor sie in ovo angewendet werden. Die Knockdown-Effizienz kann getestet werden, indem miRNA-Expressionsplasmide in eine Zelllinie transfiziert werden, die das Zielgen exprimiert. Alternativ können einzelne miRNA-Expressionsplasmide in Zelllinien mit einem Expressionskonstrukt für das Zielgen co-transfiziert werden. Für Zielgene, die Proteine kodieren, die in ihrem nativen Zustand nicht membranverankert sind (z. B. lösliche Proteine), kann ein alkalisches Phosphatase (AP)-Fusionsprotein zur Überwachung der Expression des Zielproteins verwendet werden. Eine cDNA-Sequenz, die für das Zielprotein kodiert, kann in AP-Tag-Vektoren (APtag-1- APtag-5; siehe Materialtabelle) mit der humanen plazentaren alkalischen Phosphatase fusioniert und in Zellen eingebracht^{werden 18}. Bei der Expression in Kulturzellen (z. B. HEK293T Zellen) wird das AP-markierte Zielprotein in hohen Mengen in Kulturmedien sezerniert, so dass Knockdown-Effekte von miRNA-Sequenzen durch Messung der Abnahme der AP-Aktivität in den Kulturmedien von miRNA-transfizierten Zellen (Unterschritte 1.4.1-1.4.4) bewertet werden können.
   1. Kultur HEK293T Zellen in einer 24-Well-Platte (8 x 10⁴ Zellen/Well) über Nacht. Transient werden die Zellen mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten mit einem Expressionsplasmid eines AP-markierten Zielproteins transfektiert. Verwenden Sie das pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative Kontrollplasmid (im miRNA-Expressionskit enthalten) als Kontrolle. (Wenn Zelllinien verwendet werden, die stabil ein AP-markiertes Zielprotein exprimieren, transfektieren Sie die Zellen nur mit individuellen miRNA-Expressionskonstrukten.)
      HINWEIS: Für die Transfektion wird ein herkömmliches Lipofektionsreagenz (siehe Materialtabelle) verwendet.
   2. Das konditionierte Medium 48-72 h nach der Transfektion auffangen und die endogene AP-Aktivität in einem 65 °C warmen Wasserbad für 5 min inaktivieren. Schleudern von Schmutz in einer Desktop-Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten.
   3. Puffern Sie den Überstand mit 10 mM HEPES, pH 7,0 und leiten Sie ihn durch einen 0,45 μm-Filter.
   4. Nehmen Sie 100 μl (für die Messung in einem Plattenlesegerät) oder 500 μl (für ein Spektralphotometer) des Überstandes und fügen Sie eine gleiche Menge 2x AP-Substratpuffer hinzu (Tabelle 2). Überprüfen Sie die AP-Aktivität, indem Sie OD₄₀₅ in einem Plattenlesegerät oder einem Spektralphotometer messen.
      HINWEIS: Wenn die AP-Aktivität des konditionierten Mediums für eine genaue Messung zu hoch ist, verdünnen Sie es mit HBAH-Puffer (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mg/ml Rinderserumalbumin, 20 mM HEPES (pH 7,0)) oder einem anderen Puffer, der ein Trägerprotein enthält. Verwenden Sie keine phosphathaltigen Puffer (z. B. PBS), da anorganisches Phosphat als kompetitiver Inhibitor von AP wirkt.
5. Verkettung der miRNA-Sequenz
   HINWEIS: Knockdown-Effekte können verstärkt werden, indem verschiedene miRNAs gegen dasselbe Zielgen verkettet oder dieselbe miRNA wiederholt werden. Der miRNA-Expressionsvektor unterstützt die Verkettung mehrerer prä-miRNA-Sequenzen und deren co-cistronische Expression¹⁷.
   1. Verketten Sie zwei verschiedene prä-miRNA-Sequenzen (gegen dasselbe Zielgen), die in In-vitro-Assays die höchsten Knockdown-Aktivitäten aufweisen (Schritt 1.4), gemäß den Anweisungen des Herstellers¹⁷.
   2. Bewerten Sie die Gensuppressionseffizienz der verketteten Konstrukte mit Hilfe von In-vitro-Assays , wie in Schritt 1.4 beschrieben. Wenn drei oder mehr prä-miRNA-Sequenzen ähnlich hohe Knockdown-Aktivitäten aufweisen, testen Sie verschiedene Kombinationen von zwei Sequenzen und verwenden Sie die Kombinationen, die die höchste Knockdown-Aktivität aufweisen (siehe Repräsentative Ergebnisse).
6. Übertragung der EmGFP-pre-miRNA-Expressionskassette auf den Tol2-Transposon-Vektor
   HINWEIS: Die Expressionskassette mit EmGFP-cDNA und zwei prä-miRNA-Sequenzen wird in den Tol2-Transposon-Vektor (pT2K-CAGGS-Vektor, siehe Materialtabelle) überführt. Zu diesem Zweck wird die Expressionskassette (die vom 3'-Ende des CMV-Promotors bis zur miRNA-Reverse-Sequencing-Primerstelle des miRNA-Expressionsvektors reicht) unter Verwendung von Primern mit einer künstlichen Restriktionsenzymstelle PCR-amplifiziert, und das PCR-Produkt wird in den Tol2-Transposon-Vektor kloniert. Der Tol2-Transposon-Vektor enthält den ubiquitären CAGGS-Promotor, der die Expression der eingefügten Expressionskassette steuert. Der CAGGS-Promotor und die Expressionskassette werden von den Tol2-Sequenzen flankiert (Abbildung 1).
   1. PCR-Amplifikation der EmGFP-prä-miRNA-Expressionskassette: Befolgen Sie den Reaktionsaufbau und die in Tabelle 3 beschriebenen Thermozyklenbedingungen.
   2. Ligatieren Sie das gelgereinigte PCR-Produkt (ca. 1,3 kb) in den Restriktionsenzym-verdauten Tol2-Transposon-Vektor. Elektropolieren Sie das Plasmid in kompetente E. coli-Zellen (siehe Materialtabelle) und wählen Sie die Rekombinanten (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA-Konstrukte) aus.
   3. Bereiten Sie das Plasmid mit einem herkömmlichen Maxiprep-Kit vor (siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Struktur und Sequenz des Plasmids durch Restriktionskartierung bzw. durch Verwendung der für die PCR verwendeten Primer.

2. Lagerung und Bebrütung der Eier

1. Kaufen Sie befruchtete Eier des Weißen Leghorns (Gallus gallus) von lokalen Bauernhöfen oder kommerziellen Anbietern.
   HINWEIS: Eier können bis zu 1 Woche vor der Inkubation bei 12-16 °C oder bei 4 °C aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit oder einer Verzögerung der Entwicklung während der Inkubation kommt.
2. Beschriften Sie die Eier mit dem Startdatum der Inkubation und markieren Sie die Oberseite der Eizelle (wo der Embryo positioniert wird). Befruchtete Eizellen werden in horizontaler Position bei 38 °C bebrütet, bis die Embryonen die Stadien 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)¹⁹ erreicht haben.

3. In-ovo-Elektroporation

1. Vorbereitung für die In-ovo-Elektroporation
   1. Herstellung einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung: 25 mg Fast Green FCF in 10 ml PBS auflösen. Die Lösung wird mit einem 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter filtriert. Die Lösung kann bei RT gespeichert werden.
   2. DNA-Cocktail: Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie die einzelnen pT2K-CAGGS-EmGFP-2x-miRNA-Plasmide (Unterschritt 1.6.3) mit dem Tol2-Transposase-Expressionsplasmid (pCAGGS-T2TP-Vektor; siehe Materialtabelle) (je 5 μg/μl) im Verhältnis 2:1 mischen. Fügen Sie 1/10 Volumen einer 0,25%igen schnellen grünen Lösung hinzu, um den injizierten Bereich zu visualisieren.
      HINWEIS: Die optimale DNA-Konzentration kann je nach Konstrukt variieren.
   3. Aufbau des Mikroinjektionsgeräts (Abbildung 3A,B): Das Mikroinjektionsgerät besteht aus Folgendem (siehe Materialtabelle): Hamilton-Spritze, 18-G-Nadel (Nadellänge = 2"), PVC-Schlauch (Polyvinylchlorid) (2 cm Länge), Mikropipettennadel (Kann durch Ziehen von Kapillarröhrchen mit Omega-Punktfaser (1 mm Außendurchmesser x 0,75 mm Innendurchmesser) mit einem Mikropipettenzieher hergestellt werden).
      1. Füllen Sie eine Hamilton-Spritze mit schwerem Mineralöl. Befestigen Sie eine 18-G-Nadel an der Spritze und füllen Sie den Innenraum der Nadel mit Öl, indem Sie den Spritzenkolben drücken.
      2. Befestigen Sie ein Stück 2 cm langen PVC-Schlauch am Ende der Nadel und füllen Sie den Schlauch mit dem Öl.
      3. Befestigen Sie eine gezogene Mikropipettennadel am Schlauch. Brechen Sie die Spitze der Mikropipettennadel mit einer feinen Pinzette auf einen Durchmesser von 10-20 μm ab, um eine kleine Öffnung zu machen. Füllen Sie die gesamte Nadel mit Öl.
         HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen im System eingeschlossen werden, da diese den Fluss der DNA-Lösung behindern würden.
   4. 5 μl des farbigen DNA-Cocktails (Unterschritt 3.1.2) auf eine sterile Petrischale geben. Stecken Sie unter dem Präpariermikroskop die Spitze der Mikropipettennadel in die DNA-Lösung auf der sterilen Petrischale und ziehen Sie die Lösung langsam in die Nadel.
   5. Warten Sie, bis sich der Druck innerhalb und außerhalb der Nadel ausgleicht (um zu vermeiden, dass Luft in die Nadel gelangt) und nehmen Sie die Spitze der Nadel aus der DNA-Lösung. Halten Sie die Spitze der Nadel bis zur Injektion in steriles PBS in einem kleinen Becherglas.
   6. Aufbau der Elektroporationsapparatur (Abbildung 3A,C):
      1. Setzen Sie ein Paar Platinelektroden mit einem Elektrodenhalter auf einen Mikromanipulator. Stellen Sie den Abstand zwischen den Spitzen der Elektroden auf 2 mm ein (Abbildung 3C,E).
      2. Verbinden Sie die Elektroden mit Kabeln mit einem Rechteckimpulsgenerator (siehe Materialtabelle).
2. Mikroinjektion von DNA-Lösung (Abbildung 3D)
   1. Nehmen Sie ein Hühnerei aus dem Inkubator und wischen Sie die Oberfläche des Eis mit einem in 70%igem Ethanol getränkten Seidenpapier ab.
   2. Befestigen Sie eine 18-g-Nadel an einer 10-ml-Spritze. Stechen Sie die Nadel schräg nach unten (45°) durch das stumpfe Ende des Eies, um das Eigelb nicht zu beschädigen.
   3. Entnehmen Sie 2-3 ml Albumin aus dem Ei. Verschließe das Loch mit einem Stück Tesafilm. Vergewissern Sie sich, dass sich der Embryo und die Vitellinmembran von der Schale lösen, indem Sie die Eizelle mit Licht "benetzen".
   4. Entfernen Sie ein Stück Eierschale (Kreis mit einem Durchmesser von 2-3 cm) mit einer Schere und einer Pinzette von der Oberseite des Eies, um den Embryo freizulegen. Nicht mehr als fünf Eizellen gleichzeitig öffnen, um das Austrocknen der Embryonen während der Elektroporation zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn es schwierig ist, ein Fenster zu öffnen, ohne das Ei zu zerbrechen, kann die gesamte Oberseite des Eies mit Klebeband oder Tesafilm abgedeckt werden, bevor ein Stück Eierschale entfernt wird.
   5. Führen Sie die Spitze der Nadel von ihrer proximalen Seite in einem Winkel von 45° in das optische Vesikel ein und injizieren Sie den DNA-Cocktail, indem Sie den Kolben langsam drücken (oder darauf klopfen), bis die blau gefärbte Lösung das Lumen ausfüllt (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Alternativ kann für die Injektion von DNA-Lösungen ein Druck-Mikroinjektionssystem (siehe Materialtabelle) verwendet werden.
   6. Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie ihre Spitze wieder in PBS ein.
3. Elektroporation (Abbildung 3E)
   1. Stellen Sie die Impulsparameter des Elektroporators wie folgt ein: Spannung: 15 V, Impulslänge: 50 ms, Impulsintervall: 950 ms, Impulszahl: 5
   2. Geben Sie ein paar Tropfen HBSS auf die Vitellinmembran über dem Embryo. Senken Sie die Elektroden mit dem Mikromanipulator senkrecht zur vorderen und hinteren Achse des Embryos in das HBSS ab.
      HINWEIS: Alternativ kann dieses Verfahren ohne Zugabe von HBSS durchgeführt werden, da Albumin ein guter elektrischer Leiter ist, der eine effiziente Elektroporation ermöglicht.
   3. Platzieren Sie die Elektroden auf beiden Seiten (vordere (nasale) und hintere (temporale) Seite) des Sehblasens (Abbildung 3E). Achten Sie darauf, dass die Elektroden den Embryo oder die Blutgefäße nicht berühren. Wenden Sie gepulste elektrische Felder an.
   4. Entfernen Sie die Elektroden und reinigen Sie die Elektroden vorsichtig mit einem wassergetränkten, sterilen Wattestäbchen, um die Ansammlung von Albumin zu vermeiden.
   5. Versiegeln Sie das Fenster mit Tesafilm und inkubieren Sie den Embryo bis zum gewünschten Entwicklungsstadium.

Ergebnisse

Aufbau von Tol2-Transposon-Konstrukten zur Expression künstlicher miRNAs gegen Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; auch bekannt als Nell2) ist ein extrazelluläres Glykoprotein. Es weist strukturelle Ähnlichkeiten mit Thrombospondin-1 auf und wird überwiegend im Nervensystem exprimiert^20,21. Wir haben bereits gezeigt, dass Nel die Differenzierung und das Überleben von retinalen Ganglienzellen

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Leitfaden für das Gen-Silencing in der sich entwickelnden Netzhaut von Küken durch transgene Expression künstlicher miRNAs unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems.

Die folgenden Faktoren sind für die erfolgreiche Durchführung dieser Technik von entscheidender Bedeutung. Erstens ist es wichtig, miRNA-Sequenzen zu verwenden, von denen bestätigt wurde, dass sie robuste Knockdown-Effekte ausüben. Bevor ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needle, 2"	VWR	89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B	GenHunter Corp	Q201 and Q202	Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg	Sigma-Aldrich	A2153
C115CB cables	Sonidel	C115CB	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables	Sonidel	C117	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)	FHC	30-30-1	1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator	Nepa Gene	CUY21
Diethanolamine (pH 9.8)	Sigma-Aldrich	D8885
Dissecting microscope
Egg incubator	Kurl	B-Lab-600-110	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder	Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF	Sigma-Aldrich	F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)	Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent	Promega	E2691
Hamilton syringe (50 μL)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6648
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-Homoarginine	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
Micromanipulator	Narishige (Japan)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller	Shutter Instrument	P97
p-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich	20-106
PBS	Sigma-Aldrich	D8662
pCAGGS-T2TP vector			Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (Optional)	Parker		Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit	Qiagen	12163	Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector			Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing	VWR (UK)	228-3830
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP	Invitrogen	K493600	Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler