Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Résumé

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Résumé

La rétine du poussin est depuis longtemps un système modèle important en neurobiologie du développement, avec des avantages tels que sa grande taille, son développement rapide et son accessibilité pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Cependant, sa principale limite technique était l’absence d’approches robustes de perte de fonction pour les analyses de la fonction des gènes. Ce protocole décrit une méthodologie de silençage génique dans la rétine du poussin en développement qui implique l’expression transgénique de microARN artificiels (miARN) à l’aide du système de transposon Tol2. Dans cette approche, un plasmide transposon Tol2 contenant une cassette d’expression pour le marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des séquences artificielles de pré-miARN contre un gène cible est introduit dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo . Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans notre étude précédente, nous avons démontré que l’expression de Nel, une glycoprotéine qui exerce de multiples fonctions dans le développement neuronal, peut être supprimée de manière significative dans la rétine du poussin en développement en utilisant cette technique. Nos résultats indiquent que cette méthodologie induit une suppression stable et robuste de l’expression des gènes et fournit ainsi une approche efficace de la perte de fonction pour les études du développement rétinien.

Introduction

La rétine des vertébrés est un système modèle important pour l’étude du développement neuronal. Malgré son emplacement périphérique, la rétine est anatomiquement et développementalement une extension du système nerveux central, et le nerf optique, qui se compose d’axones de cellules ganglionnaires rétiniennes, représente un tractus dans le système nerveux central. La rétine du poussin présente des avantages significatifs en tant que système modèle pour étudier le mécanisme moléculaire du développement neuronal : elle est grande et se développe rapidement ; il présente des similitudes structurelles et fonctionnelles avec la rétine humaine ; Il est très accessible pour la visualisation et les manipulations expérimentales. Les mécanismes moléculaires de la prolifération et de la différenciation cellulaires, de la morphogenèse et du guidage axonale au cours du développement neuronal ont été largement étudiés à l’aide de la rétine de poulet.

L’électroporation in ovo a été utilisée avec succès au cours des deux dernières décennies pour introduire des gènes ectopiques dans les cellules de l’embryon de poussin en développement. Cette technique permet de marquer les cellules en développement, de tracer le destin cellulaire et de tracer la migration cellulaire et les voies axonales, ainsi que l’expression ectopique des gènes pour l’analyse in vivo de la fonction des gènes. Les conditions de l’électroporation in ovo pour une expression ectopique efficace des gènes chez les embryons de poussins ont été bien établies ^1,2,3.

Malgré ces avantages, l’absence d’une technique stable de perte de fonction pour l’étude de la fonction des gènes a été une limitation technique majeure de l’embryon de poussin. Alors que les embryons de poussins électroporés avec de petits ARN interférents (siRNAs)⁴ ou des vecteurs d’expression pour les ARN courts en épingle à cheveux (shRNAs)⁵ montrent l’inactivation du gène ciblé, la suppression des gènes dans ces approches est transitoire car les effets disparaissent une fois que les cellules perdent les ARN ou les ADN introduits. Une suppression génique plus stable peut être obtenue en délivrant des siRNA dans des embryons de poussin par un système rétrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor)⁶. Le vecteur viral s’intègre dans le génome de l’hôte et les gènes ectopiques sont exprimés de manière stable. Cependant, le rétrovirus ne peut s’intégrer dans le génome des cellules en division que pendant la phase mitotique (M) du cycle cellulaire, ce qui peut imposer une limitation sur les stades de développement et/ou les types de cellules pour lesquels cette approche de perte de fonction peut être appliquée. De plus, l’expression des transgènes par RCAS apparaît plus lente et moins robuste que celle induite par l’électroporation in ovo ⁷.

Les transposons sont des éléments génétiques qui se déplacent d’un endroit à un autre du génome. L’élément Tol2 fait partie de la famille des éléments transposables hAT et contient un gène interne codant pour une transposase qui catalyse la réaction de transposon de^{l’élément 8} de Tol2. Lorsqu’un vecteur plasmidique porteur d’une cassette d’expression génique flanquée des séquences des extrémités gauche et droite des éléments Tol2 (200 pb et 150 pb, respectivement) est introduit dans des cellules de vertébrés avec une construction d’expression de la transposase Tol2, la cassette d’expression est excisée du plasmide et intégrée dans le génome de l’hôte, ce qui favorise une expression stable du gène ectopique (Figure 1). Il a été démontré que l’élément transposable Tol2 peut induire la transposition de gènes de manière très efficace chez différentes espèces de vertébrés, y compris le poisson-zèbre^9,10, les grenouilles 11, les poussins 12 et les souris ^13, et constitue donc une méthode utile de transgénèse et de mutagenèse insertionnelle. Le système de transposons Tol2 a été utilisé avec succès pour l’inactivation conditionnelle d’un gène cible par intégration génomique de siRNA qui est traité à partir d’un long ARN double brin¹⁴.

Ce protocole décrit une approche de perte de fonction dans l’embryon de poussin qui implique l’introduction de microARN artificiels (miARN) par le système de transposons Tol2^15,16. Dans cette approche, une cassette d’expression du marqueur EmGFP (emerald green fluorescent protein) et des miARN artificiels contre un gène cible est clonée dans un vecteur transposon Tol2. La construction du transposon Tol2 est ensuite introduite dans la rétine embryonnaire du poussin avec une construction d’expression de la transposase Tol2 par électroporation in ovo. Dans les cellules rétiniennes transfectées, la transposase catalyse l’excision de la cassette d’expression du vecteur transposon et son intégration dans les chromosomes de l’hôte, conduisant à l’expression stable des miARN et de la protéine EmGFP. Dans nos études précédentes, nous avons réussi à inhiber l’expression de Nel, une glycoprotéine extracellulaire principalement exprimée dans le système nerveux, dans la rétine du poussin en développement (voir Résultats représentatifs). Nos résultats indiquent qu’une suppression génique stable et efficace peut être obtenue in ovo par cette technique.

Protocole

1. Construction de vecteurs d’expression de miARN

REMARQUE : Les procédures de construction de vecteurs d’expression de miARN (étapes 1.1-1.3, 1.5-1.6.) sont optimisées pour le kit d’expression de miARN, kit d’expression d’ARN miR Block-iT Pol II avec EmGFP, comme décrit précédemment^15,16. Le kit fournit le vecteur d’expression conçu pour permettre l’expression des miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), un vecteur de contrôle (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-plasmide de contrôle négatif), des réactifs accessoires et des instructions pour produire des vecteurs d’expression des miARN (voir le tableau des matériaux)¹⁷.

1. Conception d’oligos d’ADN simple brin codant pour des pré-miARN contre le gène cible : Concevoir des oligos d’ADN simple brin (oligos « brin supérieur » (pré-miARN cible) et oligos « brin inférieur » (compléments des oligos brin supérieur)) à l’aide de l’outil en ligne RNAi Designer (voir Tableau des matériaux). Voir la figure 2 pour les caractéristiques requises des oligos monocaténaires (figure 2A) et des exemples de séquences cibles (figure 2B).
   REMARQUE : Il est recommandé de générer 5 à 10 séquences de pré-miARN pour un gène cible donné et de les cribler in vitro pour les activités de knockdown (étape 1.4).
2. Recuit des oligos des brins supérieur et inférieur pour générer un oligo double brin
   1. Mettre en place la réaction de recuit suivante (tableau 1) dans un tube de microcentrifugation stérile de 0,5 ml.
   2. Incuber le mélange réactionnel à 95 °C pendant 4 min. Recuire les oligos des brins supérieur et inférieur pour générer un oligo double brin en laissant le mélange réactionnel refroidir à température ambiante (RT) pendant 5 à 10 minutes. Centrifuger brièvement l’échantillon (~5 s).
      REMARQUE : Les oligos recuits peuvent être stockés à -20 °C sans dégradation pendant au moins un an.
3. Clonage des oligos double brin dans le vecteur d’expression des miARN (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (fourni dans le kit d’expression des miARN)) : Cloner des oligos double brin individuels dans le vecteur d’expression des miARN linéarisé, selon le manuel du fabricant¹⁷.
4. Évaluation des effets de knockdown
   REMARQUE : Il est recommandé de tester l’efficacité de la suppression génique in vitro des séquences de miARN individuelles avant de les appliquer in ovo. L’efficacité du knockdown peut être testée en transfectant des plasmides d’expression de miARN dans une lignée cellulaire qui exprime le gène cible. Alternativement, les plasmides d’expression de miARN individuels peuvent être co-transfectés dans des lignées cellulaires avec une construction d’expression pour le gène cible. Pour les gènes cibles codant pour des protéines qui ne sont pas ancrées dans leur membrane à l’état natif (par exemple, les protéines solubles), une protéine de fusion de phosphatase alcaline (AP) peut être utilisée pour surveiller l’expression de la protéine cible. Une séquence d’ADNc codant pour la protéine cible peut être fusionnée dans le cadre à la phosphatase alcaline placentaire humaine dans des vecteurs AP-tag (APtag-1- APtag-5 ; voir Tableau des matériaux) et introduite dans les cellules¹⁸. Lorsqu’elle est exprimée dans des cellules de culture (par exemple, des cellules HEK293T), la protéine cible marquée par AP est sécrétée à des niveaux élevés dans les milieux de culture, et les effets de knockdown des séquences de miARN peuvent donc être évalués en mesurant la diminution de l’activité AP dans les milieux de culture des cellules transfectées par des miARN (sous-étapes 1.4.1-1.4.4).
   1. Cultivez HEK293T cellules dans une plaque à 24 puits (8 x 10,⁴ cellules/puits) pendant la nuit. Transfecter transitoirement les cellules avec des constructions individuelles d’expression de miARN avec un plasmide d’expression d’une protéine cible marquée AP. Utilisez le plasmide de contrôle négatif pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (fourni dans le kit d’expression des miARN) comme témoin. (Si des lignées cellulaires exprimant de manière stable une protéine cible marquée AP sont utilisées, transfectez les cellules uniquement avec des constructions d’expression de miARN individuelles.)
      REMARQUE : Un réactif de lipofection conventionnel (voir le tableau des matériaux) est utilisé pour la transfection.
   2. Recueillir le milieu conditionné 48 à 72 h après la transfection et inactiver l’activité endogène de l’AP dans un bain-marie à 65 °C pendant 5 min. Éjectez les débris dans une microcentrifugeuse de bureau à vitesse maximale pendant 5 min.
   3. Tamponnez le surnageant avec 10 mM HEPES, pH 7,0 et passez-le à travers un filtre de 0,45 μm.
   4. Prélever 100 μL (pour la mesure dans un lecteur de plaques) ou 500 μL (pour un spectrophotomètre) du surnageant et ajouter une quantité égale de tampon de substrat AP 2x (Tableau 2). Vérifiez l’activité de l’AP en mesurant OD₄₀₅ dans un lecteur de plaques ou un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Si l’activité AP du milieu conditionné est trop élevée pour une mesure précise, diluez-le avec un tampon HBAH (solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), 0,5 mg/mL d’albumine sérique bovine, 20 mM HEPES (pH 7,0)) ou un autre tampon contenant une protéine porteuse. N’utilisez pas de tampons contenant du phosphate (p. ex., PBS) car le phosphate inorganique agit comme un inhibiteur compétitif de la PA.
5. Chaînage de séquences de miARN
   REMARQUE : Les effets de knockdown peuvent être améliorés en chaînant différents miARN contre le même gène cible ou en répétant le même miARN. Le vecteur d’expression des miARN prend en charge le chaînage de plusieurs séquences de pré-miARN et leur expression co-cistronique¹⁷.
   1. Enchaîner deux séquences de pré-miARN différentes (contre le même gène cible) qui montrent les activités de knockdown les plus élevées dans les essais in vitro (étape 1.4), selon les instructions du fabricant¹⁷.
   2. Évaluer l’efficacité de la suppression génique des constructions chaînées à l’aide d’essais in vitro , comme décrit à l’étape 1.4. Si trois séquences pré-miARN ou plus montrent des activités de knockdown élevées similaires, testez différentes combinaisons de deux séquences et utilisez les combinaisons qui montrent l’activité de knockdown la plus élevée (voir Résultats représentatifs).
6. Transfert de la cassette d’expression EmGFP-pre-miRNA vers le vecteur transposon Tol2
   NOTE : La cassette d’expression contenant l’ADNc EmGFP et deux séquences de pré-miARN est transférée dans le vecteur transposon Tol2 (vecteur pT2K-CAGGS, voir le tableau des matériaux). À cette fin, la cassette d’expression (englobant l’extrémité 3' du promoteur CMV jusqu’au site d’amorce de séquençage inverse des miARN du vecteur d’expression des miARN) est amplifiée par PCR à l’aide d’amorces avec un site enzymatique de restriction artificiel, et le produit de PCR est cloné dans le vecteur transposon Tol2. Le vecteur transposon Tol2 contient le promoteur CAGGS omniprésent, qui pilote l’expression de la cassette d’expression insérée. Le promoteur CAGGS et la cassette d’expression sont flanqués des séquences Tol2 (Figure 1).
   1. Amplification par PCR de la cassette d’expression EmGFP-pre-miRNA : Suivre la configuration de la réaction et les conditions de thermocyclage décrites dans le tableau 3.
   2. Lier le produit PCR purifié par gel (environ 1,3 kb) dans le vecteur transposon Tol2 digéré par l’enzyme de restriction. Électroporer le plasmide dans des cellules E. coli compétentes (voir le tableau des matériaux) et sélectionner les recombinants (constructions de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
   3. Préparez le plasmide à l’aide d’un kit maxiprep conventionnel (voir le tableau des matériaux). Vérifier la structure et la séquence du plasmide par cartographie de restriction et en utilisant les amorces utilisées pour la PCR, respectivement.

2. Stockage et incubation des œufs

1. Achetez des œufs fécondés de Leghorn blanche (Gallus gallus) auprès de fermes locales ou de vendeurs commerciaux.
   REMARQUE : Les œufs peuvent être conservés à une température de 12 à 16 °C ou à 4 °C jusqu’à 1 semaine avant l’incubation sans perte importante de viabilité ni retard de développement pendant l’incubation.
2. Étiquetez les œufs avec la date de début de l’incubation et marquez la face supérieure de l’œuf (où l’embryon sera positionné). Incuber les œufs fécondés en position horizontale à 38 °C jusqu’à ce que les embryons aient atteint les stades Hamburger et Hamilton (HH) 10 (33-38 h) -11 (40-45 h)¹⁹.

3. Électroporation in ovo

1. Préparation à l’électroporation in ovo
   1. Préparation de la solution Fast Green à 0,25 % : Dissoudre 25 mg de Fast Green FCF dans 10 mL de PBS. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre pour seringue de 0,2 μm. La solution peut être stockée chez RT.
   2. Cocktail d’ADN : Préparer la solution injectable en mélangeant les plasmides de miARN pT2K-CAGGS-EmGFP-2x individuels (sous-étape 1.6.3) avec le plasmide d’expression de la transposase Tol2 (vecteur pCAGGS-T2TP ; voir le tableau des matériaux) (5 μg/μL chacun) dans un rapport de 2 :1. Ajouter 1/10 de volume de solution verte rapide à 0,25 % pour visualiser la zone injectée.
      REMARQUE : La concentration optimale d’ADN peut varier en fonction des constructions.
   3. Mise en place de l’appareil de micro-injection (Figure 3A,B) : L’appareil de micro-injection se compose des éléments suivants (voir le tableau des matériaux) : seringue Hamilton, aiguille de 18 G (longueur de l’aiguille = 2 »), tube en PVC (polychlorure de vinyle) (longueur de 2 cm), aiguille de micropipette (peut être fabriqué en tirant des tubes capillaires avec une fibre de point oméga (1 mm de diamètre extérieur X 0,75 mm de diamètre intérieur) avec un extracteur de micropipette).
      1. Remplissez une seringue Hamilton d’huile minérale lourde. Fixez une aiguille de 18 G à la seringue et remplissez l’espace intérieur de l’aiguille avec de l’huile en appuyant sur le piston de la seringue.
      2. Fixez un morceau de tube en PVC de 2 cm de long à l’extrémité de l’aiguille et remplissez le tube avec l’huile.
      3. Fixez une aiguille de micropipette tirée sur le tube. Cassez la pointe de l’aiguille de la micropipette à un diamètre de 10 à 20 μm à l’aide d’une pince fine pour faire une petite ouverture. Remplissez toute l’aiguille d’huile.
         REMARQUE : Il faut veiller à ne pas piéger de bulles d’air dans le système, car elles inhiberaient l’écoulement de la solution d’ADN.
   4. Déposer 5 μL du cocktail d’ADN coloré (sous-étape 3.1.2) dans une boîte de Pétri stérile. Sous le microscope à dissection, placez la pointe de l’aiguille de la micropipette dans la solution d’ADN sur la boîte de Pétri stérile et aspirez lentement la solution dans l’aiguille.
   5. Attendez que la pression s’équilibre à l’intérieur et à l’extérieur de l’aiguille (pour éviter que l’air ne pénètre dans l’aiguille) et retirez la pointe de l’aiguille de la solution d’ADN. Garder la pointe de l’aiguille immergée dans du PBS stérile dans un petit bécher jusqu’à l’injection.
   6. Mise en place de l’appareil d’électroporation (Figure 3A,C) :
      1. Placez une paire d’électrodes en platine avec un porte-électrode sur un micromanipulateur. Ajustez l’espacement entre la pointe des électrodes à 2 mm (Figure 3C,E).
      2. Connectez les électrodes à un générateur d’impulsions d’onde carrée à l’aide de câbles (voir le tableau des matériaux).
2. Micro-injection d’une solution d’ADN (Figure 3D)
   1. Retirez un œuf de poule de l’incubateur et essuyez la surface de l’œuf avec un papier de soie imbibé d’éthanol à 70 %.
   2. Fixez une aiguille de 18 G à une seringue de 10 ml. Insérez l’aiguille dans l’extrémité émoussée de l’œuf, inclinée vers le bas (45°) pour éviter d’endommager le jaune.
   3. Prélever 2 à 3 mL d’albumine de l’œuf. Scellez le trou avec un morceau de ruban adhésif. Confirmez que l’embryon et la membrane vitelline sont détachés de la coquille en « mirant » l’œuf avec de la lumière.
   4. Retirez un morceau de coquille d’œuf (cercle de 2 à 3 cm de diamètre) du haut de l’œuf à l’aide de ciseaux et d’une pince pour exposer l’embryon. Ne fendez pas plus de cinq ovules à la fois pour éviter le dessèchement des embryons pendant l’électroporation.
      REMARQUE : S’il est difficile d’ouvrir une fenêtre sans casser l’œuf, tout le dessus de l’œuf peut être recouvert de ruban adhésif ou de ruban adhésif avant de retirer un morceau de coquille d’œuf.
   5. Insérez la pointe de l’aiguille dans la vésicule optique à partir de son côté proximal à un angle de 45° et injectez le cocktail d’ADN en appuyant lentement (ou en tapotant sur) le piston jusqu’à ce que la solution de couleur bleue remplisse la lumière (Figure 3D).
      REMARQUE : Il est également possible d’utiliser un système de micro-injection sous pression (voir le tableau des matériaux) pour l’injection de solutions d’ADN.
   6. Retirez l’aiguille et replacez sa pointe dans le PBS.
3. Électroporation (Figure 3E)
   1. Réglez les paramètres d’impulsion de l’électroporateur comme suit : Tension : 15 V, Longueur d’impulsion : 50 ms, Intervalle d’impulsion : 950 ms, Nombre d’impulsions : 5
   2. Ajouter quelques gouttes de HBSS sur la membrane vitelline sur l’embryon. Abaissez les électrodes dans le HBSS à l’aide du micromanipulateur, perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur de l’embryon.
      REMARQUE : Alternativement, cette procédure peut être effectuée sans ajouter HBSS, car l’albumine est un bon conducteur électrique qui permet une électroporation efficace.
   3. Placez les électrodes de chaque côté (côté antérieur (nasal) et côté postérieur (temporal)) de la vésicule optique (Figure 3E). Assurez-vous que les électrodes ne touchent pas l’embryon ou les vaisseaux sanguins. Appliquer des champs électriques pulsés.
   4. Retirez les électrodes et nettoyez-les délicatement avec un coton-tige stérile imbibé d’eau pour éviter l’accumulation d’albumine.
   5. Scellez la fenêtre avec du ruban adhésif et réincubez l’embryon jusqu’au stade de développement souhaité.

Résultats

Construction de constructions de transposons Tol2 pour l’expression de miARN artificiels contre Nel
Le nel (facteurde croissance pidermique (EGF)-Like (N eural E) est une glycoprotéine extracellulaire. Il présente des similitudes structurelles avec la thrombospondine-1 et est principalement exprimé dans le système nerveux^20,21. Nous avons précédemment démontré que Nel régule la différenciation et la survie des ...

Discussion

Ce protocole fournit un guide détaillé sur le silençage génique dans la rétine du poussin en développement par l’expression transgénique de miARN artificiels à l’aide de l’électroporation in ovo et du système de transposon Tol2.

Les facteurs suivants sont d’une importance cruciale pour l’exécution réussie de cette technique. Tout d’abord, il est essentiel d’utiliser des séquences de miARN dont il est confirmé qu’elles exercent des effets de knockdown robu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 G needle, 2"	VWR	89219-320
AP-TAG kit A and AP-TAG kit B	GenHunter Corp	Q201 and Q202	Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mg	Sigma-Aldrich	A2153
C115CB cables	Sonidel	C115CB	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 cables	Sonidel	C117	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles)	FHC	30-30-1	1 mm O.D. 0.75 mm I.D
CUY21 square wave electroporator	Nepa Gene	CUY21
Diethanolamine (pH 9.8)	Sigma-Aldrich	D8885
Dissecting microscope
Egg incubator	Kurl	B-Lab-600-110	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Electrode holder	Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
Electrodes	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	Electrocompetent E. coli cells
Fast green FCF	Sigma-Aldrich	F7258
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)	Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers
Gooseneck fiber light source
FuGene 6 transfection reagent	Promega	E2691
Hamilton syringe (50 μL)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No  80901
Hanks' balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6648
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-Homoarginine	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
Micromanipulator	Narishige (Japan)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Micropipette puller	Shutter Instrument	P97
p-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich	20-106
PBS	Sigma-Aldrich	D8662
pCAGGS-T2TP vector			Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (Optional)	Parker		Pressure microinjection system
Plasmid maxi kit	Qiagen	12163	Plasmid maxiprep kit
pT2K-CAGGS vector			Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)
PVC tubing	VWR (UK)	228-3830
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP	Invitrogen	K493600	Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Thermal cycler