3次元高速フォースマッピングを用いた固液界面における溶液構造の可視化

要約

ここでは、界面領域内の先端とサンプルの相互作用をマッピングすることにより、サブナノメートルの分解能で固液界面の溶液構造を視覚化するための3次元高速フォースマッピング(原子間力顕微鏡技術)を使用するためのプロトコルを紹介します。

要約

さまざまな研究分野での課題の中には、固液界面の可視化と、イオン濃度、pH、配位子、微量添加物などの溶液条件、および基礎となる結晶学と化学によってそれらがどのように影響を受けるかを理解することがあります。これに関連して、3次元高速フォースマッピング(3D FFM)は、界面での解構造を調査するための有望なツールとして浮上しています。この機能は原子間力顕微鏡(AFM)に基づいており、サブナノメートルの分解能で3空間次元の界面領域を直接視覚化することができます。ここでは、3D FFMデータを取得するための実験プロトコルについて詳しく説明します。サンプルとアプリケーションに応じて動作パラメータを最適化するための主な考慮事項について説明します。さらに、測定された機器の観測量を局所解構造にリンクできるチップサンプル力マップに変換するなど、データ処理と分析の基本的な方法について説明します。最後に、3D FFMデータの解釈に関連するいくつかの未解決の問題と、この手法が表面科学のレパートリーの中心的なツールになる方法に光を当てます。

概要

多くの興味深い現象は、コロイド相互作用の古典的な理論が破綻する固液界面の数ナノメートル内で発生します¹。溶媒分子とイオンは、触媒³、イオン吸着^4,5、電子移動^6,7、生体分子集合^体8、粒子凝集⁹、付着^物10,11、集合^体12,13など、予想外のパターン2と多様なプロセスに組織化されますが発生する可能性があります。しかし、界面での溶液構造を特徴付けることができる手法は、特にサブナノメートルの3D解像度ではほとんどありません。この文脈で、原子間力顕微鏡(AFM)に基づく技術である3次元高速フォースマッピング(3D FFM)は、界面溶液構造を決定し、そのような現象への影響を理解するための有用なツールとして浮上しています^14,15。

一般に、AFM技術は、ナノサイズの先端を持つカンチレバーを使用して、2つの主要な測定クラスを使用して表面を特徴付けます:各xyピクセルで基板の高さを測定するトポグラフィーイメージング、または機械的特性、コロイド相互作用^16,17、または機能化されたチップと基板との間の接着力を定量化する力測定。今日、この汎用性の高い機器の機能は、これらの従来のアプリケーションをはるかに超えています。最新の機器を操作する熟練したユーザーは、力顕微鏡を分光法やその他の方法に結合することにより、電気的、磁気的、および化学的な表面特性を測定できます¹⁸。おそらく最も興味深い進歩は、ナノスケールの空間分解能で、材料とプロセスをネイティブソリューションでリアルタイムにイメージングする能力でした19,20,21。この後者の能力は、1D力曲線と地形イメージング¹⁴を組み合わせることにより、AFM測定を3次元空間に拡張する3D FFMの開発を容易にした。具体的には、先端は各xy座標で連続した力曲線を取得し、固液界面で先端が検出した力の3Dマップを生成します。ここでの新規性は、十分に高速で感度の高いチップが、分子の局所分布に対応する小さな力勾配を検出して、界面溶液構造をマッピングできることです。

今日まで、3D FFMは少数の研究グループによってのみ開発されてきましたが、これは技術的な制限によるものではなく、これらの測定を実行するために社内で機器をカスタマイズする必要があるためであると考えています。しかし、3D FFMは最近商用化され、現在ではすべての関連分野の研究者が利用できるようになりました。科学的な観点から、この手法は幅広く学際的な魅力を持っています。例えば、最初の3次元FFM実験は鉱物溶液系15,22,23,24で行われ、結晶の成長と溶解のメカニズムの理解、イオンと分子の吸着、粒子の凝集と付着における水和層の役割などが重要な問題となった。成功した実験により、ドロマイト結晶格子²⁵中のカルシウム原子とマグネシウム原子が同定され、方解石点欠陥²⁶の周りの溶液構造が可視化され、雲母^27,28および蛍石^24,29表面でのイオン吸着が画像化されました。

3D FFMは、鉱物と溶液の界面を視覚化するだけでなく、短距離コロイド相互作用のスケーリング、分子レベルでの電気二重層の構造、溶媒和力の性質と起源など、表面およびコロイド物理学の基本的な問題に対する洞察を提供することができます。これらの測定は、3D FFMが電極-電解質界面をマッピングし、電界に対する応答を調査できるため、電気化学および電池研究に重要な意味を持ちます³。材料科学における他の応用には、分離膜、不均一系触媒、およびポリマーコーティングの表面で発生する現象の理解が含まれます。この能力がさらに発展するにつれて、生体分子のイメージングや、相互作用、イオン、溶媒分子の自己組織化における役割の解明にも重要な役割を果たすことが期待されます。

3D FFMでデータ解釈を進めるための重要な側面の1つは、これまで固液界面の研究に使用されてきた他の実験ツールやシミュレーションツールに対するベンチマークです。例えば、X線反射率または回折に基づく技術は、界面^30,31,32,33からの高さの関数としてイオンおよび溶媒分子の分布にマッピングできる電子密度プロファイルを測定する。このアプローチは、さまざまな鉱物溶液系で成功していますが、原子的に滑らかな大きな表面に限定されており、多くの場合、横方向に分解されたデータを生成することができません。和周波発生分光法などの他の技術は、表面での溶媒分子の配向など、鉱物表面での溶媒構造化の特定の側面の証拠を提供しますが、構造^34,35の直接的な視覚化は提供しません。さらに、分子動力学シミュレーションは大幅に進歩し、結晶表面4,36,37,38,39の溶媒分布プロファイルを日常的に調査できるようになりました。これらの手法にはそれぞれ独自の課題と制限がありますが、界面ソリューションの構造を調査するための補完的なツールスイートを形成します。3D FFMは、この点に大きく貢献し、研究可能な固液系の範囲を拡大し、答えを出せる研究課題を拡大する態勢を整えています。

特定のサンプルに3D FFMを実装するための前提条件は、目的の空間分解能で地形画像を取得できることです。高解像度AFMイメージングに関する詳細な実験プロトコルについては、Millerらによる最近の論文²⁰を参照してください。3D FFMを最適に動作させるためには、まずそこに記載されている高解像度イメージング技術を習得することを強くお勧めします。そのプロトコルの推奨事項のほとんどは、3D FFMに適用でき、必要です。次のプロトコルでは、高解像度イメージングの主な手順を簡単に説明しますが、3D FFMの特定の考慮事項に焦点を当てています。

プロトコル

1. AFMチップの装填とキャリブレーション

1. カンチレバーチップを水とイソプロパノール溶剤に数分間連続して浸して清掃し、汚染物質や有機吸着物を除去します。その他の一般的な洗浄方法には、アルゴンプラズマまたは紫外線オゾン表面処理が含まれます。
   注:異なるデータセットを比較するときは、サンプルとカンチレバーの準備に一貫性を持たせてください。洗浄プロセスの変更は、表面化学、親水性、さらには形状などの先端特性に影響を与える可能性があり、したがって、測定された力⁴⁰に影響を与える可能性がある。
2. カンチレバーホルダーも水とイソプロパノール溶剤で清掃します。
3. 使用中のAFM機器に典型的であるように、ホルダークランプまたはネジを使用してカンチレバーをホルダーにロードします。カンチレバーホルダーをAFMに接続します。
4. AFMソフトウェアを使用して応答信号を最大化するように先端のレーザースポットを位置合わせし、偏向信号をゼロにします。
5. 空気中のカンチレバースプリング定数を測定します。このステップは、カンチレバーの熱変動を記録し、最初の共振ピークをメーカーのプロトコルに従って実行される単純な調和振動子モデルに適合させることにより、最新のほとんどの顕微鏡で自動化されています。
   注:ばね定数の測定は、一部のAFMアプリケーションでは見落とされがちですが、3D FFMデータを正しく解釈するために、特に後のセクションで説明するように、機器の観測量からのデータを測定された力に変換するために重要です。

2. 基質と溶液の装填

1. カンチレバーホルダーをAFMステージから取り外し、カンチレバーチップに~60μLのイメージング溶液を加えます。チップが溶液に完全に浸されていることを確認してください。このプロセス中に気泡が発生しないように注意してください。
   注:イメージングソリューションは、科学的調査に関連するものなら何でもかまいません。試験液として、[KCl] = 10 mMまたは純水を使用してください。
2. 測定の直前にサンプル(マイカなど)を劈開して、滑らかできれいな表面を得ます。イメージング溶液でサンプルをすすぎ、同じイメージング溶液を~100 μLサンプル表面に加えます。
   1. 洗浄した基板をサンプルステージに置きます。基質のサイズは実験によって異なります。それは、1 x 1 cm² ウェーハと同じくらいの大きさでも、表面に堆積したナノ粒子と同じくらい小さいものでもかまいません。
      注:他のAFM測定と同様に、界面は有機物や他の残留物による汚染に特に敏感であるため、信頼性の高い3Dデータを得るためには、表面がきれいであることが非常に重要です²⁷。
3. カンチレバーホルダーをステージ上の位置に戻し、固定します。溶液が先端に滴下し、サンプルが接触するまで、カンチレバーの位置を慎重に下げます。サンプルステージは、インストゥルメントソフトウェアまたはインストゥルメント本体の物理的なノブによって制御されます。
4. サンプル表面を化学的に平衡化させ、イメージング溶液とイオンを約10分間交換します。
   1. オプションのステップとして、カンチレバーチップを取り外し、イメージング溶液を新しいアリコートと交換し、カンチレバーホルダーを戻し、チップが再び溶液に浸るまでサンプルに近づきます。

3. 振幅変調AFM測定の装置パラメータの設定

1. チップを溶液に浸している間に、別のサーマルグラフを取得します。この時点で、スプリング定数がステップ1.5で計算した値に固定されていることを確認し、計器パラメータ(AmpInVOLSパラメータなど)を使用してサーマルピークを適合させます。繰り返しになりますが、このステップは、装置ソフトウェアのサーマルグラフセクションを数回クリックするだけで、ほとんどの最新の顕微鏡で自動化されています。
   注:このパラメータは、装置によって検出された電子信号のナノメートル値単位のチップ-サンプル距離への変換を較正し、実験者がチップの位置とたわみの信頼性の高いデータを取得できるようにします。
2. 駆動周波数(ν_exc)を共振周波数(ν_e)に設定し、続いて位相シフトを共振周波数に近い90°にセンタリングして、カンチレバーの先端を調整します。これらは、振幅変調モードで機器を操作するときに、ユーザーがメーカーのプロトコルを使用して制御できる機器パラメータです。
   注:一部のAFM機器は光熱励起を使用しており、共振周波数はステップ3.1で取得した値と同じです。この先端励起方法は、非常に低い駆動振幅でも安定したイメージング条件を可能にするため、3Dフォースマッピングに非常に有利です。
3. サンプル表面のおおよその高さを特定し、チップが表面にかみ合うまで慎重に先端に近づきます。これを行うには、装置ソフトウェアの Set Point パラメータを使用して、セットポイント振幅を自由振幅の約~70%に変更します。先端が表面に近づくと、振幅は設定値に達するまで低下し、したがって表面に噛み合っていると判断されます。
4. サーフェスから~200 nmの距離から始まる単一の力曲線を取得します。通常、これは機器ソフトウェアの Force パネルで行います。チップを引き出す前に、手順3.2のように位相シフトを90°に再調整して中央に配置します。共振周波数は、先端と表面の相互作用によりわずかに減少します。
   注:この手順により、その後の3D FFM測定中に、引っ込められた先端位置で位相シフトが約90度になります。
5. 設定振幅を自由振幅の~70%に変更します。非常に低い設定値(大きな、加えられた力)は、先端が早期に損傷する可能性があるため、使用しないでください。
6. 地形画像を取得します。雲母などの滑らかな表面の場合は、~20 x 20 nm² の画像から始めます。表面が粗い場合は、まず大きな領域をイメージングしてから、原子的に滑らかな 20 x 20 nm² の領域をすばやく見つけてイメージングします。取得した画像を注意深く調べます。この時点で、2Dイメージングの解像度は、少なくとも目的の3Dフォースマッピングの解像度と同等である必要があります。
   注意: チップによる損傷を最小限に抑えるように注意する必要があります。たとえば、必要以上に多くの画像を撮影せず、大きくて粗い領域をイメージングする場合は、緩やかな設定値、大きなイメージングゲイン、および低いスキャンレートを使用します。
7. 装置ソフトウェアを使用して、 ドライブ振幅 を約0.25nmに減らし、可能な場合はさらに小さくします。それに応じて 設定点 を小さくし、常にドライブ振幅より小さくし、テスト画像 を取得します 。チップとイメージング条件を適切に選択することで、駆動振幅を~0.1nmに低減できます。ただし、粗い表面のトポグラフィー上でこのような小さな振幅でイメージングすると、先端が損傷する可能性がある場合は、十分に注意してください。
   メモ: 垂直方向の分解能を向上させるには、ドライブの振幅を、解決しようとしているソリューションの特徴よりも小さくする必要があります。現実的に到達できる最小の自由振幅は、カンチレバーと計器のセットアップに関連する熱ノイズによって制限されます。ベースラインノイズと比較したピーク振幅を分析することにより、カンチレバーを調整しながら、信号対雑音比を定性的に評価できます。
8. 200 nm のチップ-サンプル距離から始まる 1 つの力曲線を取得します。その後、力曲線の先端-サンプル距離を 50 nm、10 nm、最後に 5 nm に減らします。
   注意: 引っ込められた先端位置の振幅ができるだけ小さくなるように測定条件を最適化します(<0.25 nm)。引っ込められた先端位置の位相シフトは~90°です。励起周波数(ν_Exc)は共振周波数(ν_E)と等しいか非常に近いため、後のステップで機器の観測量を測定された力に変換するのが簡単になります。また、セットポイントが十分に低いため、力測定の最後の数ナノメートル以内で位相シフト(および振幅)が大幅に(~40〜50%)低下します。加えられる力をさらに増やすことができます(設定値を減少させます)。トレードオフは、このプロセスで先端がより早く損傷することです。
9. フォースカーブの取得を停止した後は、必ず先端を引っ込んでください。先端がかみ合ったままで表面に近づいたままの場合、先端は表面に向かってドリフトして衝突する可能性があります。
   注: 図1 は、[NaCl] = 10 mM溶液で取得した白雲母-水系、特に位相(φ)、振幅(A)、およびたわみ(δ)応答の1D力曲線をプロットしたものです。この段階では、これらのプロファイルは、3D マップで目指され、位相曲線でほとんど明らかな振動フィーチャとして現れるフィーチャの証拠を示す必要があります。この生データの高さ座標は任意であることに注意してください。データ処理と分析の詳細については、後のセクションで説明します。

4. 3Dフォースマップの取得

注:3D FFM測定に最適なパラメータを見つけるには、サンプル表面、カンチレバーチップ、およびイメージングソリューションによって異なります。一般的なガイドラインは出発点として提供されていますが、各サンプルの適切なパラメータには、さまざまな測定条件でデータセットを取得して分析する必要があります。次の手順は、ミネラルウォーターシステムの3Dフォースマップを取得する方法を示しています。手順4.2で説明したすべてのパラメータは、機器ソフトウェアを使用して設定します。

1. セクション 2 と 3 で説明されているすべての手順を実行します。
2. チップ-サンプル距離(z)を2-5nmに設定します。この距離は、先端が表面に近いため、界面溶液の特徴を解決するのに十分であり、また、先端が最も遠い位置に引っ込むときにバルク溶液と平衡化することもできます4.3。
3. スキャン領域を3 x 3 nm²または10 x 10 nm²に設定し、解像度を64 x 64ピクセル² -128 x 128ピクセル²に設定します。
   注:生体分子イメージングなどの他のアプリケーションでは、3つの空間次元すべてでより大きなスキャンサイズが必要になる場合があります。
4. [Rate of Force Curve Acquisition] を 200-800 Hz (3D データセットあたり 15-120 秒に相当) に設定します。理想的には、この数値をできるだけ小さくして、画像の歪みとチップの熱ドリフトを最小限に抑えながら、z方向の適切な解像度を維持します。これらのスキャン速度と寸法では、データを処理した後、z方向に50〜100 pix/nmが得られ、これは通常、界面溶液構造を解像するのに十分です。
5. 開始点として、各力曲線で位相シフトが定期的に ~50 ~ 60° に低下するように Set Point の値を選択します。設定値は、自由振幅の50%まで低く定義できます。ただし、これは特に測定するサンプルの種類によって異なり、試行錯誤が必要になります。例えば、低い設定値(高圧)を使用すると、柔らかい分子の場合、先端が損傷したり、表面が変形したりする可能性があります。一方、高い設定値(低圧)では、ハイドレーション層を貫通してプローブするのに十分ではない場合があります。
6. ソフトウェアが、振幅変調されたAFMデータの解析に必要な4つの主要な観測量(チップの高さ、振幅、位相、偏向)を記録していることを確認します。機器やソフトウェアによっては、先端の高さを追跡するために複数のデータチャネルが存在する可能性があることに注意してください。3D FFMは非常に高い解像度を必要とするため、機器からの電子ノイズのオーバーレイを最小限に抑えた最も滑らかな先端高さプロファイルを使用することが重要です。これらの主要な変数を記録するだけでなく、後のセクションで説明するように、先端に加えられる力を分析および再構築するために、他の操作パラメータとメタデータが必要です(通常はデフォルトでデータファイルに保存されます)。
   注:3D FFMは、振幅変調AFMモードと周波数変調AFMモードの両方で実証されています。データ品質と分析に関しては、2つの方法は同等です。したがって、好ましい動作モードは、実験者の裁量と経験に委ねられます。振幅変調モードの利点の1つは、より大きな z 距離にわたってチップが安定しているため、ユーザーは溶液内に>10nmの3Dデータを取得できることです。それに比べて、このモードの欠点の1つは、カンチレバー運動よりも遅い緩和時間スケールで軟分子をイメージングすることに関係しています。後者のアプリケーションは、FFMが軟質材料と粘性液体の界面緩和を調査する機会を提供します。このような場合、測定された振幅プロファイルは、アプローチサイクルとリトラクションサイクルでヒステリシスを示す可能性があり、実際の先端高さについて不確実性が生じます。

5. 3Dフォースマップデータの処理

注:次の手順は、社内で生成されたコードを使用するか、 またはサポート情報に記載されているデータ処理ファイルを使用して、優先データ分析ソフトウェアで実行できます。

1. 生データを好みの分析ソフトウェアにロードして、計算と視覚化を行います。
   注:解析に必要な観測量は、高さ変位(z)の関数としての振幅(A)、位相シフト(φ)、先端のたわみ(δ)、および共振周波数(ν_e)、ばね定数(k)、品質係数(Q)などの先端特性です。その他の動作パラメータには、スキャン寸法、スキャンレート、チップ励起周波数(ν_exc)、および駆動振幅(A₀)が含まれます。後者の値は通常、電圧単位で記録されますが、ステップ3.1で取得したキャリブレーション値に基づいてナノメートルに簡単に変換できます。
2. 3D データセットから等価な地形画像を抽出し、各 XY 座標における先端の最も遠い高さの変位を記録します。このデータを使用して、 x スキャン方向と y スキャン方向の両方の平均高さプロファイルに直線を合わせることにより、サンプルの傾きを計算します。表面が雲母のように原子的に滑らかな場合でも、数度のサンプル傾斜が予想され、データ分析の前に対応する高さの傾きを考慮する必要があります。
   注:最近のほとんどの機器では、この手順は通常のトポグラフィーイメージングでは自動化されていますが、3D FFMデータでは手動で実行する必要があります。明らかに、ユーザーが複数ステップのエッジを持つ結晶などのより複雑な表面を測定する場合は、この方法を少し調整する必要があります。
3. 高さ変位プロファイルを線形化します。3D FFMの先端は、すべてのアプローチサイクルとリトラクトサイクルで同様の正弦波軌道をたどることを思い出してください。ただし、先端の最も遠い範囲は、着地する結晶学的場所によって異なり、記録された先端の高さは明らかに最後の有効数値と同じではありません。したがって、すべての先端軌道で測定された高さ値は離散化され、すべての力曲線に対して単一の線形 z プロファイルが得られます。
   注:ビンのサイズは、測定パラメータと対象フィーチャの長さスケールによって異なります。ほとんどのアプリケーションでは、0.2 Å で十分な高さ分解能です。この値は、水分子のサイズの 10 倍以上小さくなります。より小さなビンサイズを使用しても利点はなく、実際には機器の機械的および電子的ノイズの範囲内です。
4. 個々の力曲線の高さビンに対応する観測可能な平均値を計算します。この方法では、位相/振幅データの3Dボリュームが生成され、任意の方向で簡単にスライスして視覚化できます。
   注意: 原則として、先端のアプローチとリトラクションによる力のプロファイルは類似している必要があります。特定のサンプルに応じて、どちらか一方または両方のデータを使用する方が適切かどうかをテストできます。特に、生体分子やより柔らかい大きな分子は、接近/収縮サイクルでヒステリシス効果を示す可能性があります。この場合、ユーザーは上記のようにイメージング条件を変更することをお勧めします。
5. 先端のたわみを考慮して高さプロファイルを調整します。この手順はオプションであり、ユーザーの裁量に委ねられています。たとえば、カンチレバーのばね定数が大きい(>200 N/m)場合、希塩溶液中の先端のたわみは通常<0.08 Å未満であり、データに大きな影響を与えません。
   注:特定のサンプルに基づいて、ユーザーは、1)非常に硬いカンチレバーの先端のたわみを無視し、その影響が無視できることを再確認した後、2)データセット全体から平均化されたたわみプロファイルを使用して先端の高さを補正する、3)その力曲線からの対応する先端たわみデータを使用して、個々の力曲線の先端高さを補正することができます。後者のオプションは直感的に最も「正しい」ため、可能な限り実行する必要がありますが、このアプローチでは、この修正のメリットを上回るノイズがデータに多く発生することがよくあります。
6. 3D 中央値フィルターを使用してデータセットをスムージングします。ほとんどの場合、このオプションのステップにより、解像度を損なうことなくノイズが低減されます。フィルタリングされていないデータのバージョンを保持しておくと、後の分析ステップでの一貫性チェックにも役立ちます。さらに、ユーザーは、ほとんどのデータ処理ソフトウェアで容易に利用できる主成分分析ベースの方法など、より高度なフィルタリング方法を探索できます。
7. 処理された結果と有用なメタデータ(AFM観測量をチップサンプル力に変換するために重要な測定パラメータ)をデータファイルに保存し、その後の分析に使用できます。
   注: サポート情報 に記載されている3つのデータ処理ファイルを使用して、このセクションに記載されている機能を実行できます。最初のファイルは、生の 3D FFM データを読み込み、関連するデータとメタデータを含む hdf5 ファイルを作成します。これは単に、データをよりユーザーフレンドリーなファイルに転送することであり、処理のためにより簡単にアクセスできるようになります。2 番目のファイルは、上記の手順に従って、同等の高さ画像を抽出し、高さ変位プロファイルを線形化し、データ値を対応する高さビンに並べ替え、フィルタを使用してデータセットを平滑化し、処理結果を出力データ ファイルに保存することにより、生データを処理します。また、一部の機能を起動して、サンプルの力曲線(未加工および処理済み)、 xz/xy スライス、基板傾斜の補正をプロットしたり、その他の後処理の一貫性チェックを実行したりすることもできます。これらのデータ処理スクリプトはユーザーフレンドリーで注釈が付けられており、ユーザーがパラメータを微調整し、生の機器ファイルからデータを抽出するための正確な手順を示しています。

結果

図2A は、3Dフォースマッピングの概略図を示しています。振幅変調モードで動作する他のAFM技術と同様に、振動するカンチレバーが表面を横切ってスキャンされます。各座標での先端高さに加えて、先端が表面に近づいたり、表面から後退したりするときに、位相シフトや振幅などの機器の観測量が収集されます。その結果、観測可能なデータ(...

ディスカッション

AFMチップの選択
他のAFMアプリケーションと同様に、プローブチップの主な特性は、共振周波数、カンチレバーサイズ、チップ半径、チップの材質、およびスプリング定数です。これまでのほぼすべての3D FFM文献で、硬い高周波チップの使用が報告されています。最も一般的な例は、シリコンベースのチップ(AC55TS、PPP-NCH、Tap300-Gなど)であり、これらは?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC55TS AFM tip	Olympus
Cypher VRS Atomic Force Microscope	Asylum Research
PPP-NCH AFM tip	Nanosensors
Tap300-G AFM tip	Budget Sensors
USC-F5-k30-10 AFM tip	Nanoworld
(Note only one of the AFM tip options is required)