Visualizzazione della struttura della soluzione su interfacce solido-liquido utilizzando la mappatura tridimensionale della forza rapida

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'utilizzo della mappatura tridimensionale della forza veloce - una tecnica di microscopia a forza atomica - per visualizzare la struttura della soluzione su interfacce solido-liquido con la risoluzione subnanometrica mappando le interazioni punta-campione all'interno della regione interfacciale.

Abstract

Tra le sfide per una varietà di campi di ricerca vi sono la visualizzazione delle interfacce solido-liquido e la comprensione di come sono influenzate dalle condizioni della soluzione come le concentrazioni di ioni, il pH, i ligandi e gli additivi in tracce, nonché la cristallografia e la chimica sottostanti. In questo contesto, la mappatura tridimensionale della forza veloce (3D FFM) è emersa come uno strumento promettente per studiare la struttura della soluzione alle interfacce. Questa capacità si basa sulla microscopia a forza atomica (AFM) e consente la visualizzazione diretta di regioni interfacciali in tre dimensioni spaziali con risoluzione sub-nanometrica. Qui forniamo una descrizione dettagliata del protocollo sperimentale per l'acquisizione di dati FFM 3D. Vengono discusse le principali considerazioni per l'ottimizzazione dei parametri operativi a seconda del campione e dell'applicazione. Inoltre, vengono discussi i metodi di base per l'elaborazione e l'analisi dei dati, inclusa la trasformazione degli osservabili dello strumento misurato in mappe di forza a campione di punta che possono essere collegate alla struttura della soluzione locale. Infine, facciamo luce su alcune delle questioni in sospeso relative all'interpretazione dei dati FFM 3D e su come questa tecnica possa diventare uno strumento centrale nel repertorio della scienza delle superfici.

Introduzione

Molti fenomeni interessanti si verificano a pochi nanometri da un'interfaccia solido-liquido in cui le teorie classiche per le interazioni colloidali si rompono¹. Le molecole di solvente e gli ioni si organizzano in modelli inaspettati² e processi diversi, come la catalisi³, l'adsorbimento ionico ^4,5, il trasferimento di elettroni ^6,7, l'assemblaggio bio-molecolare⁸, l'aggregazione di particelle⁹, l'attacco^10,11 e l'assemblaggio^12,13, può verificarsi. Tuttavia, poche tecniche possono caratterizzare la struttura della soluzione all'interfaccia, in particolare con risoluzione 3D sub-nanometrica. In questo contesto, la mappatura tridimensionale della forza veloce (3D FFM) - una tecnica basata sulla microscopia a forza atomica (AFM) - è emersa come uno strumento utile per determinare la struttura della soluzione interfacciale^14,15 e comprendere il suo impatto su tali fenomeni.

In generale, le tecniche AFM impiegano un cantilever con una punta nanometrica per caratterizzare le superfici utilizzando due classi principali di misure: l'imaging topografico che misura l'altezza di un substrato ad ogni pixel xy o le misure di forza che quantificano le proprietà meccaniche, le interazioni colloidali^16,17 o le forze adesive tra una punta funzionalizzata e il substrato. Oggi, le capacità di questo versatile strumento si estendono ben oltre queste applicazioni tradizionali; Gli utenti esperti che utilizzano strumenti moderni possono misurare le proprietà elettriche, magnetiche e chimiche della superficie accoppiando la microscopia a forza alla spettroscopia e ad altri metodi¹⁸. Forse i progressi più affascinanti sono stati la capacità di visualizzare materiali e processi nelle loro soluzioni native, con risoluzione spaziale su scala nanometrica, in tempo reale 19,20,21. Quest'ultima capacità ha facilitato lo sviluppo della FFM 3D, che estende le misurazioni AFM nella terza dimensione spaziale combinando curve di forza 1D con l'imaging topografico¹⁴. In particolare, la punta acquisisce curve di forza consecutive in corrispondenza di ciascuna coordinata xy per produrre una mappa 3D delle forze rilevate dalla punta all'interfaccia solido-liquido. La novità qui è che una punta sufficientemente veloce e sensibile può rilevare gradienti di forza minori corrispondenti alla distribuzione locale delle molecole per mappare la struttura della soluzione interfacciale.

Ad oggi, la FFM 3D è stata sviluppata solo da pochi gruppi di ricerca, il che, a nostro avviso, non è dovuto ai suoi limiti tecnici, ma piuttosto alla necessità di personalizzare gli strumenti internamente per eseguire queste misurazioni. Tuttavia, la FFM 3D è stata recentemente commercializzata ed è ora accessibile ai ricercatori di tutte le discipline pertinenti. Da un punto di vista scientifico, questa tecnica ha un appeal ampio e multidisciplinare. Ad esempio, i primi esperimenti 3D di FFM sono stati eseguiti su sistemi in soluzione minerale 15,22,23,24, dove questioni importanti includevano la comprensione dei meccanismi di crescita e dissoluzione dei cristalli, l'adsorbimento di ioni e molecole e il ruolo degli strati di idratazione nell'aggregazione e nell'attaccamento delle particelle. Esperimenti di successo hanno identificato atomi di calcio e magnesio in un reticolo cristallino di dolomite²⁵, visualizzato la struttura della soluzione attorno ai difetti puntiformi di calcite²⁶ e ripreso l'adsorbimento ionico sulle superfici di mica^27,28 e fluorite^24,29.

Oltre a visualizzare le interfacce minerale-soluzione, la FFM 3D può fornire informazioni su questioni fondamentali nella fisica delle superfici e dei colloidali, come il ridimensionamento delle interazioni colloidali a corto raggio, la struttura dei doppi strati elettrici a livello molecolare e la natura e le origini delle forze di solvatazione. Queste misurazioni hanno importanti implicazioni per l'elettrochimica e la ricerca sulle batterie, poiché la FFM 3D può mappare le interfacce elettrodo-elettrolita e sondare la loro risposta ai campi elettrici³. Altre applicazioni nella scienza dei materiali includono la comprensione dei fenomeni che si verificano sulle superfici delle membrane di separazione, dei catalizzatori eterogenei e dei rivestimenti polimerici. Man mano che questa capacità si sviluppa ulteriormente, prevediamo che svolgerà anche un ruolo importante nell'imaging delle biomolecole e nella definizione del ruolo delle interazioni, degli ioni e delle molecole di solvente nel loro autoassemblaggio.

Uno degli aspetti chiave per far progredire l'interpretazione dei dati nella FFM 3D è il benchmarking con altri strumenti sperimentali e di simulazione che sono stati precedentemente utilizzati per studiare le interfacce solido-liquido. Ad esempio, le tecniche basate sulla riflettività o sulla diffrazione dei raggi X misurano i profili di densità elettronica che possono essere mappati sulla distribuzione di ioni e molecole di solvente in funzione dell'altezza dall'interfaccia 30,31,32,33. Questo approccio ha avuto successo per una serie di sistemi in soluzione minerale, ma rimane limitato a grandi superfici atomicamente lisce ed è spesso incapace di produrre dati risolti lateralmente. Altre tecniche, come la spettroscopia di generazione di frequenza di somma, forniscono prove di particolari aspetti della strutturazione del solvente sulle superfici minerali, come l'orientamento delle molecole di solvente sulla superficie, ma non la visualizzazione diretta della struttura^34,35. Inoltre, le simulazioni di dinamica molecolare sono progredite in modo significativo e ora possono sondare regolarmente i profili di distribuzione del solvente sulle superfici cristalline 4,36,37,38,39. Sebbene ognuna di queste tecniche abbia le sue sfide e i suoi limiti, formano una suite complementare di strumenti per studiare la struttura delle soluzioni interfacciali; 3D FFM è pronto a contribuire in modo significativo a questo senso e ad ampliare la gamma di sistemi solido-liquido che possono essere studiati, nonché le domande di ricerca a cui è possibile rispondere.

Un prerequisito per l'implementazione della FFM 3D su un particolare campione è la capacità di ottenere immagini topografiche con la risoluzione spaziale desiderata. Per un dettagliato protocollo sperimentale sull'imaging AFM ad alta risoluzione, si rimanda il lettore a un recente manoscritto di Miller et ^al.20. Per un funzionamento ottimale della FFM 3D, si consiglia vivamente di padroneggiare prima la tecnica di imaging ad alta risoluzione ivi descritta. La maggior parte delle raccomandazioni contenute in tale protocollo sono applicabili e necessarie per la FFM 3D. Nel seguente protocollo, evidenziamo brevemente i passaggi principali per l'imaging ad alta risoluzione, ma ci concentriamo su considerazioni specifiche per la FFM 3D.

Protocollo

1. Caricamento e calibrazione della punta AFM

1. Pulire la punta a sbalzo immergendola in acqua e solventi isopropanolo consecutivamente per diversi minuti per rimuovere contaminanti e adsorbati organici. Altri metodi comuni per la pulizia includono il trattamento superficiale con argon-plasma o ozono ultravioletto.
   NOTA: Essere coerenti nella preparazione del campione e del cantilever quando si confrontano diversi set di dati. Le modifiche nel processo di pulizia possono influenzare le proprietà della punta, come la chimica della superficie, l'idrofilia o persino la forma, e quindi influenzare le forze misurate⁴⁰.
2. Pulire il supporto a sbalzo con acqua e solventi isopropanolo.
3. Caricare il cantilever nel supporto utilizzando il morsetto o la vite del supporto, come tipico per lo strumento AFM in uso. Collegare il supporto a sbalzo all'AFM.
4. Allineare il punto laser sulla punta per massimizzare il segnale di risposta utilizzando il software AFM, quindi azzerare il segnale di deflessione.
5. Misurare la costante della molla a sbalzo nell'aria. Questo passaggio è automatizzato sulla maggior parte dei microscopi moderni registrando le fluttuazioni termiche del cantilever e adattando il primo picco di risonanza a un semplice modello di oscillatore armonico eseguito seguendo il protocollo del produttore.
   NOTA: La misurazione della costante elastica è spesso trascurata in alcune applicazioni AFM, ma è fondamentale per la corretta interpretazione dei dati FFM 3D, in particolare per la conversione dei dati da osservabili dello strumento in forze misurate, come descritto in una sezione successiva.

2. Caricamento del substrato e della soluzione

1. Scollegare e rimuovere il supporto a sbalzo dallo stadio AFM e aggiungere ~60 μL della soluzione di imaging sulla punta a sbalzo. Assicurarsi che la punta sia completamente immersa nella soluzione. Fare attenzione a non creare bolle d'aria durante questo processo.
   NOTA: La soluzione di imaging può essere qualsiasi cosa relativa all'indagine scientifica. Come soluzione di prova, utilizzare [KCl] = 10 mM o anche acqua pura.
2. Tagliare il campione (ad es. mica) immediatamente prima delle misurazioni per ottenere una superficie liscia e pulita. Sciacquare il campione con la soluzione di imaging e quindi aggiungere ~100 μl della stessa soluzione di imaging sulla superficie del campione.
   1. Posizionare il substrato pulito sul tavolino di filtraggio. La dimensione del substrato varia a seconda dell'esperimento; Potrebbe essere grande come un wafer di 1 x 1 cm² o piccolo come nanoparticelle depositate su una superficie.
      NOTA: Come per qualsiasi altra misurazione AFM, avere una superficie pulita è molto importante per ottenere dati 3D affidabili, poiché l'interfaccia è particolarmente sensibile alla contaminazione da sostanze organiche e altri residui²⁷.
3. Rimettere e fissare il supporto a sbalzo nella sua posizione sul tavolino. Abbassare con cautela la posizione a sbalzo fino a quando la soluzione non cade sulla punta e il campione entra in contatto. Lo stadio di campionamento è controllato dal software dello strumento o da una manopola fisica sul corpo dello strumento.
4. Lasciare che la superficie del campione si equilibri chimicamente e scambi ioni con la soluzione di imaging per circa 10 minuti.
   1. Come passaggio facoltativo, rimuovere la punta a sbalzo, sostituire la soluzione di imaging con un'aliquota nuova, rimettere il supporto a sbalzo e avvicinarsi al campione fino a quando la punta non è nuovamente immersa nella soluzione.

3. Impostazione dei parametri dello strumento per le misure AFM modulate in ampiezza

1. Acquisire un altro grafico termico mentre la punta è immersa nella soluzione. A questo punto, assicurarsi che la costante della molla sia fissata al valore calcolato al punto 1.5, mentre un parametro dello strumento (ad esempio, il parametro AmpInVOLS) viene utilizzato per adattare il picco termico. Anche in questo caso, questo passaggio è automatizzato sulla maggior parte dei microscopi moderni con pochi clic nella sezione del grafico termico nel software dello strumento.
   NOTA: Questo parametro calibra la conversione del segnale elettronico rilevato dallo strumento alla distanza punta-campione in valori nanometrici in modo che lo sperimentatore possa ottenere dati affidabili sulla posizione e la deflessione della punta.
2. Sintonizzare la punta del cantilever impostando la frequenza di azionamento (ν_exc) alla frequenza di risonanza (ν_e) e successivamente centrando lo sfasamento a 90° vicino alla frequenza di risonanza. Si tratta di parametri dello strumento che gli utenti possono controllare utilizzando il protocollo del produttore quando utilizzano lo strumento in modalità modulata in ampiezza.
   NOTA: Alcuni strumenti AFM utilizzano l'eccitazione fototermica, per la quale la frequenza di risonanza è lo stesso valore ottenuto al punto 3.1. Questo metodo di eccitazione della punta è molto vantaggioso per la mappatura della forza 3D in quanto consente condizioni di imaging stabili, anche a larghezze di azionamento molto basse.
3. Individuare l'altezza approssimativa della superficie del campione e avvicinarsi con cautela alla punta finché non si innesta nella superficie. A tale scopo, modificare l'ampiezza del setpoint a circa ~70% dell'ampiezza libera utilizzando il parametro Set Point nel software dello strumento. Quando la punta si avvicina alla superficie, l'ampiezza diminuisce fino a raggiungere il valore di setpoint e viene quindi determinata per essere innestata sulla superficie.
4. Ottenere una singola curva di forza a partire da una distanza di ~200 nm dalla superficie. In genere, questa operazione viene eseguita nel pannello Forza del software dello strumento. Prima di ritirare la punta, risintonizzare e centrare lo sfasamento a 90° come al punto 3.2. La frequenza di risonanza diminuirà leggermente a causa delle interazioni punta-superficie.
   NOTA: Questo passaggio garantisce che, durante le successive misurazioni FFM 3D, lo sfasamento sia di circa 90 gradi nella posizione della punta retratta.
5. Modificare l'ampiezza impostata a ~70% dell'ampiezza libera. Non utilizzare valori nominali molto bassi (forza applicata elevata) in quanto ciò potrebbe danneggiare prematuramente la punta.
6. Acquisire un'immagine topografica. Per superfici lisce come la mica, iniziare con un'immagine di ~20 x 20 nm² . Per le superfici più ruvide, iniziare con l'imaging di aree più grandi prima di individuare rapidamente un'area atomicamente liscia di 20 x 20 nm² da visualizzare. Esaminare attentamente le immagini acquisite. A questo punto, la risoluzione dell'imaging 2D dovrebbe essere almeno equivalente alla risoluzione di mappatura della forza 3D desiderata.
   NOTA: Prestare attenzione per ridurre al minimo i danni subiti dalla punta. Ad esempio, non scattare più immagini del necessario e utilizzare set point delicati, grandi guadagni di imaging e basse velocità di scansione quando si riproducono aree grandi e ruvide.
7. Utilizzando il software dello strumento, ridurre l'ampiezza dell'unità a circa 0,25 nm e anche più bassa quando possibile. Ridurre di conseguenza il Set Point in modo che sia sempre inferiore all'ampiezza dell'unità e acquisire le immagini di prova. Con una corretta selezione della punta e delle condizioni di imaging, l'ampiezza dell'unità può essere ridotta a ~0,1 nm. Tuttavia, prestare molta attenzione quando l'imaging con un'ampiezza così piccola su una superficie ruvida La topografia potrebbe danneggiare la punta.
   NOTA: Per una migliore risoluzione verticale, l'ampiezza dell'unità deve essere inferiore alle caratteristiche della soluzione che si sta tentando di risolvere. La più piccola ampiezza libera che può essere realisticamente raggiunta è limitata dal rumore termico associato al cantilever e alla configurazione strumentale. È possibile valutare qualitativamente il rapporto segnale/rumore durante la messa a punto del cantilever analizzando l'ampiezza di picco rispetto al rumore di base.
8. Acquisizione di curve di forza singole a partire da una distanza punta-campione di 200 nm. Successivamente, ridurre la distanza punta-campione per le curve di forza a 50 nm, 10 nm e infine 5 nm.
   NOTA: Ottimizzare le condizioni di misurazione in modo tale che l'ampiezza nella posizione della punta retratta sia la più bassa possibile (< 0,25 nm); lo sfasamento nella posizione della punta retratta è di ~90°; la frequenza di eccitazione (ν_ecc) è uguale o molto vicina alla frequenza di risonanza (ν_e), il che semplifica la conversione degli osservabili dello strumento in forze misurate nelle fasi successive; E il setpoint è sufficientemente basso da far sì che lo sfasamento (e l'ampiezza) diminuiscano significativamente (di ~40-50%) entro l'ultimo paio di nanometri dalla misurazione della forza. La forza applicata può essere ulteriormente aumentata (setpoint diminuito). Il compromesso è che la punta si danneggia più rapidamente in questo processo.
9. Assicurati di ritirare la punta dopo che l'acquisizione della curva di forza è stata interrotta. Se la punta rimane innestata e vicina alla superficie, potrebbe andare alla deriva e schiantarsi contro la superficie.
   NOTA: La Figura 1 traccia una curva di forza 1D per il sistema muscovite-acqua acquisita in soluzione [NaCl] = 10 mM, in particolare le risposte di fase (φ), ampiezza (A) e deflessione (δ). In questa fase, questi profili dovrebbero mostrare l'evidenza delle caratteristiche che si vogliono ottenere nelle mappe 3D e che si manifestano come caratteristiche oscillatorie che sono per lo più evidenti nella curva di fase. Si noti che la coordinata dell'altezza per questi dati grezzi è arbitraria. Ulteriori dettagli sull'elaborazione e l'analisi dei dati sono forniti in una sezione successiva.

4. Acquisizione di mappe di forza 3D

NOTA: La ricerca dei parametri ottimali per le misure FFM 3D dipenderà dalla superficie del campione, dalla punta a sbalzo e dalla soluzione di imaging. Le linee guida generali sono fornite come punto di partenza, ma i parametri appropriati per ciascun campione richiederanno l'ottenimento e l'analisi di set di dati con varie condizioni di misurazione. I passaggi seguenti mostrano come acquisire le mappe di forza 3D per il sistema di acqua minerale. Tutti i parametri descritti nei passaggi 4.2 - vengono impostati utilizzando il software dello strumento.

1. Eseguire tutti i passaggi come descritto nelle sezioni 2 e 3.
2. Impostare la distanza punta-campione (z) su 2-5 nm. Questa distanza è sufficiente per risolvere le caratteristiche della soluzione interfacciale poiché la punta è vicina alla superficie e consente anche alla punta di equilibrarsi con la soluzione sfusa quando si ritrae nella posizione più lontana.4.3.
3. Impostare l'area di scansione su 3 x 3 nm² o 10 x 10 nm², con una risoluzione di 64 x 64 pixel² -128 x 128 pixel².
   NOTA: Altre applicazioni, come l'imaging di biomolecole, potrebbero richiedere scansioni di dimensioni maggiori in tutte e tre le dimensioni spaziali.
4. Impostare la velocità di acquisizione della curva di forza su 200-800 Hz, che corrisponde a 15-120 s per set di dati 3D. Idealmente, diminuisci questo numero il più possibile per ridurre al minimo la distorsione dell'immagine e la deriva termica della punta, mantenendo una risoluzione decente nella direzione z . Per queste velocità e dimensioni di scansione, si ottengono 50-100 pix/nm nella direzione z dopo l'elaborazione dei dati, che di solito è sufficiente per risolvere la struttura della soluzione interfacciale.
5. Come punto di partenza, scegliere un valore per Set Point tale che lo sfasamento scenda regolarmente a ~50-60° in ogni curva di forza. Il set point può essere definito come il 50% dell'ampiezza libera. Tuttavia, questo dipende soprattutto dal tipo di campione da misurare e richiederà tentativi ed errori. Ad esempio, l'utilizzo di un set point basso (alta pressione) può danneggiare la punta o deformare la superficie nel caso di molecole morbide. D'altra parte, un set point elevato (bassa pressione) potrebbe non essere sufficiente per penetrare e sondare gli strati di idratazione.
6. Verificare che il software stia registrando quattro osservabili chiave necessari per analizzare i dati AFM modulati in ampiezza: altezza della punta, ampiezza, fase e deflessione. Si noti che potrebbero esistere più canali dati per tracciare l'altezza della punta a seconda dello strumento e del software. Poiché la FFM 3D richiede una risoluzione molto elevata, è importante utilizzare i profili di altezza della punta più uniformi con il minor rumore elettronico sovrapposto dallo strumento. Oltre a registrare queste variabili chiave, sono necessari altri parametri operativi e metadati per analizzare e ricostruire le forze esercitate sulla punta (in genere salvate nel file di dati per impostazione predefinita), come discusso in una sezione successiva.
   NOTA: La FFM 3D è stata dimostrata sia in modalità AFM modulata in ampiezza che in frequenza. Per quanto riguarda la qualità e l'analisi dei dati, i due metodi sono equivalenti. Di conseguenza, la modalità di funzionamento preferita è lasciata alla discrezione e all'esperienza dello sperimentatore. Un possibile vantaggio per la modalità modulata in ampiezza è la stabilità della punta su distanze z maggiori che consente all'utente di ottenere dati 3D che si estendono fino a >10 nm nella soluzione. In confronto, uno svantaggio di questa modalità riguarda l'imaging di molecole morbide con tempi di rilassamento più lenti rispetto al movimento a sbalzo. Quest'ultima applicazione rappresenta un'opportunità per FFM di studiare il rilassamento interfacciale in materiali morbidi e liquidi viscosi. In questi casi, i profili di ampiezza misurati potrebbero mostrare isteresi nei cicli di avvicinamento e retrazione, il che crea incertezza sull'altezza effettiva della punta.

5. Elaborazione dei dati della mappa di forza 3D

NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti nel software di analisi dei dati preferito utilizzando i codici generati internamente o, in alternativa, utilizzando i file di elaborazione dei dati forniti nelle Informazioni di supporto.

1. Carica i dati grezzi in un software di analisi preferito per i calcoli e la visualizzazione.
   NOTA: Gli osservabili richiesti per l'analisi sono l'ampiezza (A), lo sfasamento (φ) e la deflessione della punta (δ) in funzione dello spostamento in altezza (z), nonché le proprietà della punta come la frequenza di risonanza (ν_e), la costante elastica (k) e il fattore di qualità (Q). Altri parametri operativi includono le dimensioni di scansione, la velocità di scansione, la frequenza di eccitazione della punta (ν_exc) e l'ampiezza dell'azionamento (A₀). Quest'ultimo valore è tipicamente registrato in unità di tensione, ma può essere facilmente convertito in nanometri in base al valore di calibrazione ottenuto al punto 3.1.
2. Estrai l'immagine topografica equivalente dal set di dati 3D registrando lo spostamento di altezza più lontano della punta in corrispondenza di ciascuna coordinata xy . Utilizzando questi dati, calcolare l'inclinazione del campione adattando le linee rette ai profili di altezza media in entrambe le direzioni di scansione x e y . Anche se la superficie è atomicamente liscia come la mica, è prevista un'inclinazione del campione di diversi gradi e la corrispondente pendenza dell'altezza dovrebbe essere presa in considerazione prima dell'analisi dei dati.
   NOTA: Sulla maggior parte degli strumenti moderni, questo passaggio è automatizzato per l'imaging topografico regolare, ma deve essere eseguito manualmente per i dati FFM 3D. Ovviamente, questo metodo dovrebbe essere leggermente modificato se l'utente misura superfici più complesse come cristalli con bordi a più fasi.
3. Linearizzare i profili di spostamento in altezza. Ricordiamo che la punta in 3D FFM segue traiettorie sinusoidali simili in ogni ciclo di avvicinamento e ritrazione. Tuttavia, l'estensione più lontana della punta varia a seconda del sito cristallografico su cui sta atterrando, e le altezze della punta registrate non sono ovviamente identiche all'ultima cifra significativa. Di conseguenza, i valori di altezza misurati in tutte le traiettorie di punta vengono discretizzati per ottenere un unico profilo z lineare per tutte le curve di forza.
   NOTA: La dimensione del contenitore dipende dai parametri di misurazione e dalla scala di lunghezza delle caratteristiche di interesse. Per la maggior parte delle applicazioni, 0,2 Å è una risoluzione di altezza sufficiente. Questo valore è più di dieci volte più piccolo della dimensione di una molecola d'acqua; L'utilizzo di contenitori di dimensioni più piccole non offre vantaggi ed è infatti all'interno del rumore meccanico ed elettronico dello strumento.
4. Calcola i valori medi osservabili corrispondenti ai contenitori di altezza per ogni singola curva di forza. Questo metodo produce un volume 3D dei dati di fase/ampiezza che può essere facilmente suddiviso e visualizzato in qualsiasi direzione.
   NOTA: In linea di principio, i profili di forza dall'approccio della punta e dalla retrazione dovrebbero essere simili. Si potrebbe verificare se sia più appropriato utilizzare i dati di uno o di entrambi a seconda del campione specifico. In particolare, le biomolecole e le molecole più grandi e morbide potrebbero mostrare effetti di isteresi nei cicli di avvicinamento/retrazione. In questo caso, si consiglia all'utente di modificare le condizioni di imaging come descritto sopra.
5. Regolare i profili di altezza tenendo conto della deflessione della punta. Questo passaggio è facoltativo e lasciato alla discrezione dell'utente. Ad esempio, con cantilever con costanti elastiche grandi (>200 N/m), la deflessione della punta nella soluzione salina diluita è tipicamente inferiore a <0,08 Å, il che non influenza significativamente i dati.
   NOTA: Sulla base del campione specifico, l'utente può 1) trascurare la deflessione della punta per cantilever molto rigidi dopo aver ricontrollato che il loro effetto sia trascurabile, 2) correggere l'altezza della punta utilizzando il profilo di deflessione mediato dall'intero set di dati, 3) correggere l'altezza della punta per ogni singola curva di forza utilizzando i dati di deflessione della punta corrispondenti da quella curva di forza. Quest'ultima opzione è intuitivamente la più "corretta" e dovrebbe essere esercitata quando possibile, ma questo approccio spesso introduce più rumore nei dati che supera il merito di questa correzione.
6. Uniforma il set di dati utilizzando un filtro mediano 3D. Nella maggior parte dei casi, questo passaggio opzionale riduce il rumore senza compromettere la risoluzione. È utile mantenere una versione dei dati non filtrati anche per i controlli di coerenza durante le fasi successive dell'analisi. Inoltre, l'utente può esplorare metodi di filtraggio più avanzati come i metodi basati sull'analisi dei componenti principali, che sono prontamente disponibili con la maggior parte dei software di elaborazione dati.
7. Salva i risultati elaborati, così come i metadati utili (parametri di misurazione importanti per trasformare gli osservabili AFM in forza di punta-campione) in un file di dati che può essere utilizzato per analisi successive.
   NOTA: I tre file di elaborazione dati forniti nelle Informazioni di supporto possono essere utilizzati per eseguire le funzioni elencate in questa sezione. Il primo file carica i dati FFM 3D grezzi e crea un file hdf5 che include i dati e i metadati pertinenti; Si tratta semplicemente di un trasferimento dei dati in un file più facile da usare a cui è possibile accedere più facilmente per l'elaborazione. Il secondo file elabora i dati grezzi, secondo i passaggi descritti sopra, estraendo l'immagine dell'altezza equivalente, linearizzando i profili di spostamento dell'altezza, ordinando i valori dei dati nei corrispondenti contenitori di altezza, livellando il set di dati utilizzando un filtro e salvando i risultati elaborati in un file di dati di output. L'utente può anche attivare alcune funzioni per tracciare esempi di curve di forza (grezze ed elaborate), fette xz/xy e la correzione per l'inclinazione del substrato, oltre a eseguire altri controlli di coerenza post-elaborazione. Questi script di elaborazione dei dati sono facili da usare e annotati e mostrano i passaggi esatti per consentire agli utenti di modificare i parametri ed estrarre i dati dai file grezzi dello strumento.

Risultati

La Figura 2A presenta uno schema della mappatura delle forze 3D. Analogamente ad altre tecniche AFM che operano in modalità modulata in ampiezza, un cantilever oscillante viene scansionato su tutta la superficie. Oltre all'altezza della punta a ciascuna coordinata, vengono raccolti elementi osservabili dello strumento, come lo sfasamento e l'ampiezza, man mano che la punta si avvicina e si ritrae dalla superficie. Il risultato è un set di dati 3D di elemen...

Discussione

Selezione della punta AFM
Come con qualsiasi applicazione AFM, le caratteristiche chiave della punta della sonda sono la frequenza di risonanza, la dimensione del cantilever, il raggio della punta, il materiale della punta e la costante della molla. Quasi tutta la letteratura sulla FFM 3D fino ad oggi ha riportato l'uso di punte rigide ad alta frequenza. Gli esempi più comuni sono le punte a base di silicio (ad esempio, AC55TS, PPP-NCH, Tap300-G, ecc.) che possono es...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC55TS AFM tip	Olympus
Cypher VRS Atomic Force Microscope	Asylum Research
PPP-NCH AFM tip	Nanosensors
Tap300-G AFM tip	Budget Sensors
USC-F5-k30-10 AFM tip	Nanoworld
(Note only one of the AFM tip options is required)