Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit Hilfe von dreidimensionalem Fast Force Mapping

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung von dreidimensionalem Fast Force Mapping - einer Rasterkraftmikroskopietechnik - zur Visualisierung der Lösungsstruktur an Fest-Flüssig-Grenzflächen mit einer Auflösung im Subnanometerbereich vor, indem die Tip-Sample-Wechselwirkungen innerhalb des Grenzflächenbereichs abgebildet werden.

Zusammenfassung

Zu den Herausforderungen für eine Vielzahl von Forschungsbereichen gehört die Visualisierung von Fest-Flüssig-Grenzflächen und das Verständnis, wie sie von den Lösungsbedingungen wie Ionenkonzentrationen, pH-Wert, Liganden und Spurenadditiven sowie der zugrunde liegenden Kristallographie und Chemie beeinflusst werden. In diesem Zusammenhang hat sich das dreidimensionale Fast Force Mapping (3D FFM) als vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung der Lösungsstruktur an Grenzflächen herauskristallisiert. Diese Fähigkeit basiert auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) und ermöglicht die direkte Visualisierung von Grenzflächenbereichen in drei räumlichen Dimensionen mit einer Auflösung von unter Nanometern. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Protokolls zur Erfassung von 3D-FFM-Daten. Es werden die wichtigsten Überlegungen zur Optimierung der Betriebsparameter in Abhängigkeit von der Probe und Anwendung diskutiert. Darüber hinaus werden die grundlegenden Methoden zur Datenverarbeitung und -analyse diskutiert, einschließlich der Umwandlung der gemessenen Instrumentenobservablen in Spitzen-Stichproben-Kraftkarten, die mit der lokalen Lösungsstruktur verknüpft werden können. Schließlich beleuchten wir einige der offenen Fragen im Zusammenhang mit der 3D-FFM-Dateninterpretation und wie diese Technik zu einem zentralen Werkzeug im Repertoire der Oberflächenwissenschaften werden kann.

Einleitung

Viele interessante Phänomene treten innerhalb weniger Nanometer um eine Fest-Flüssig-Grenzfläche auf, an der klassische Theorien für kolloidale Wechselwirkungen zusammenbrechen¹. Lösungsmittelmoleküle und -ionen organisieren sich in unerwarteten Mustern² und verschiedenen Prozessen, wie z. B. Katalyse³, Ionenadsorption ^4,5, Elektronentransfer ^6,7, biomolekulare Anordnung⁸, Partikelaggregation⁹, Bindung^10,11 und Anordnung^12,13, kann auftreten. Allerdings können nur wenige Techniken die Lösungsstruktur an der Grenzfläche charakterisieren, insbesondere mit einer 3D-Auflösung im Sub-Nanometer-Bereich. In diesem Zusammenhang hat sich das dreidimensionale schnelle Kraft-Mapping (3D-FFM), eine auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierende Technik, als nützliches Werkzeug zur Bestimmung der Grenzflächenlösungsstruktur^14,15 und zum Verständnis ihrer Auswirkungen auf solche Phänomene erwiesen.

Im Allgemeinen wird bei AFM-Techniken ein Cantilever-Element mit einer nanoskaligen Spitze verwendet, um Oberflächen anhand von zwei Hauptklassen von Messungen zu charakterisieren: topographische Bildgebung, die die Höhe eines Substrats an jedem xy-Pixel misst, oder Kraftmessungen, die mechanische Eigenschaften, kolloidale Wechselwirkungen^{16, 17} oder Adhäsionskräfte zwischen einer funktionalisierten Spitze und dem Substrat quantifizieren. Heute gehen die Fähigkeiten dieses vielseitigen Instruments weit über diese traditionellen Anwendungen hinaus. Fachkundige Anwender, die moderne Instrumente bedienen, können elektrische, magnetische und chemische Oberflächeneigenschaften messen, indem sie die Kraftmikroskopie mit der Spektroskopie und anderen Methoden koppeln¹⁸. Die vielleicht faszinierendsten Fortschritte waren die Möglichkeit, Materialien und Prozesse in ihren nativen Lösungen mit nanoskaliger räumlicher Auflösung in Echtzeit abzubilden 19,20,21. Diese letztgenannte Fähigkeit erleichterte die Entwicklung von 3D-FFM, das AFM-Messungen durch die Kombination von 1D-Kraftkurven mit topographischer Bildgebung in die dritte räumliche Dimension erweitert¹⁴. Konkret erfasst die Spitze aufeinanderfolgende Kraftkurven an jeder xy-Koordinate, um eine 3D-Karte der Kräfte zu erstellen, die von der Spitze an der Fest-Flüssig-Grenzfläche erfasst werden. Das Neue dabei ist, dass eine ausreichend schnelle und empfindliche Spitze kleinere Kraftgradienten detektieren kann, die der lokalen Verteilung von Molekülen entsprechen, um die Grenzflächenlösungsstruktur abzubilden.

Bisher wurde 3D FFM von nur wenigen Forschungsgruppen entwickelt, was unserer Meinung nach nicht auf seine technischen Einschränkungen zurückzuführen ist, sondern vielmehr auf die Notwendigkeit, Instrumente für die Durchführung dieser Messungen im eigenen Haus anzupassen. Vor kurzem wurde 3D FFM jedoch kommerzialisiert und ist nun für Forscher aller relevanten Disziplinen zugänglich. Aus wissenschaftlicher Sicht hat diese Technik eine breite und multidisziplinäre Anziehungskraft. Zum Beispiel wurden die ersten 3D-FFM-Experimente an Mineral-Lösungs-Systemen 15,22,23,24 durchgeführt, bei denen wichtige Fragen das Verständnis der Mechanismen des Kristallwachstums und der Kristallauflösung, der Adsorption von Ionen und Molekülen und der Rolle von Hydratationsschichten bei der Partikelaggregation und -bindung umfassten. Erfolgreiche Experimente haben Calcium- und Magnesiumatome in einem Dolomitkristallgitter²⁵ identifiziert, die Lösungsstruktur um Calcitpunktdefekte²⁶ visualisiert und die Ionenadsorption an Glimmer- ^27,28- und Fluoritoberflächen^24,29 abgebildet.

Neben der Visualisierung von Grenzflächen zwischen Mineralien und Lösungen kann 3D FFM Einblicke in grundlegende Fragen der Oberflächen- und Kolloidphysik liefern, wie z. B. die Skalierung von kolloidalen Wechselwirkungen mit kurzer Reichweite, die Struktur elektrischer Doppelschichten auf molekularer Ebene sowie die Art und den Ursprung von Solvatationskräften. Diese Messungen haben wichtige Auswirkungen auf die Elektrochemie und die Batterieforschung, da 3D-FFM Elektroden-Elektrolyt-Grenzflächen abbilden und deren Reaktion auf elektrische Felder untersuchen^{kann 3}. Weitere Anwendungen in der Materialwissenschaft sind das Verständnis von Phänomenen, die an den Oberflächen von Trennmembranen, heterogenen Katalysatoren und Polymerbeschichtungen auftreten. Wir gehen davon aus, dass diese Fähigkeit im Zuge der Weiterentwicklung auch eine wichtige Rolle bei der Abbildung von Biomolekülen und der Abgrenzung der Rolle von Wechselwirkungen, Ionen und Lösungsmittelmolekülen bei ihrer Selbstorganisation spielen wird.

Einer der Schlüsselaspekte für die Weiterentwicklung der Dateninterpretation in 3D-FFM ist das Benchmarking mit anderen experimentellen und Simulationswerkzeugen, die bisher zur Untersuchung von Fest-Flüssig-Grenzflächen verwendet wurden. Beispielsweise messen Techniken, die auf Röntgenreflektivität oder Beugung basieren, Elektronendichteprofile, die in Abhängigkeit von der Grenzfläche 30,31,32,33 auf die Verteilung von Ionen und Lösungsmittelmolekülen abgebildet werden können. Dieser Ansatz hat sich für eine Reihe von mineralischen Lösungssystemen als erfolgreich erwiesen, ist aber nach wie vor auf große atomar glatte Oberflächen beschränkt und oft nicht in der Lage, lateral aufgelöste Daten zu erzeugen. Andere Techniken, wie z. B. die Spektroskopie zur Erzeugung von Summenfrequenzen, liefern Hinweise auf bestimmte Aspekte der Lösungsmittelstrukturierung an mineralischen Oberflächen, wie z. B. die Ausrichtung von Lösungsmittelmolekülen an der Oberfläche, aber keine direkte Visualisierung der Struktur^34,35. Darüber hinaus haben sich die Molekulardynamik-Simulationen erheblich weiterentwickelt und können nun routinemäßig Lösungsmittelverteilungsprofile an den Kristalloberflächen^untersuchen 4,36,37,38,39. Obwohl jede dieser Techniken ihre eigenen Herausforderungen und Einschränkungen hat, bilden sie eine komplementäre Suite von Werkzeugen zur Untersuchung der Grenzflächenlösungsstruktur. 3D FFM ist bereit, einen wesentlichen Beitrag dazu zu leisten und das Spektrum der zu untersuchenden Fest-Flüssig-Systeme sowie die Forschungsfragen, die beantwortet werden können, zu erweitern.

Eine Voraussetzung für die Implementierung von 3D-FFM auf einer bestimmten Probe ist die Fähigkeit, topografische Bilder mit der gewünschten räumlichen Auflösung zu erhalten. Für ein detailliertes experimentelles Protokoll zur hochauflösenden AFM-Bildgebung wird auf ein kürzlich erschienenes Manuskript von Miller et ^al.20 verwiesen. Für einen optimalen Betrieb von 3D FFM ist es dringend zu empfehlen, zunächst die dort beschriebene hochauflösende Bildgebungstechnik zu beherrschen. Die meisten der Empfehlungen in diesem Protokoll sind für 3D-FFM anwendbar und notwendig. Im folgenden Protokoll werden die wichtigsten Schritte für die hochauflösende Bildgebung kurz beleuchtet, wobei wir uns auf spezifische Überlegungen für 3D-FFM konzentrieren.

Protokoll

1. Laden und Kalibrieren der AFM-Spitze

1. Reinigen Sie die Cantilever-Spitze, indem Sie sie mehrere Minuten lang nacheinander in Wasser und Isopropanol-Lösungsmittel tauchen, um Verunreinigungen und organische Adsorbate zu entfernen. Andere gängige Methoden zur Reinigung sind die Oberflächenbehandlung mit Argonplasma oder ultraviolettem Ozon.
   HINWEIS: Seien Sie bei der Vorbereitung von Proben und Auslegern konsistent, wenn Sie verschiedene Datensätze vergleichen. Änderungen im Reinigungsprozess können die Spitzeneigenschaften, wie z. B. die Oberflächenchemie, die Hydrophilie oder sogar die Form, beeinflussen und somit die gemessenen Kräfte⁴⁰ beeinflussen.
2. Reinigen Sie den Auslegerhalter ebenfalls mit Wasser und Isopropanol-Lösungsmitteln.
3. Laden Sie den Ausleger mit der Halterklemme oder Schraube in die Halterung, wie für das verwendete AFM-Instrument typisch. Verbinden Sie den Auslegerhalter mit dem AFM.
4. Richten Sie den Laserpunkt mit der AFM-Software auf der Spitze aus, um das Ansprechsignal zu maximieren, und stellen Sie dann das Ablenkungssignal auf Null.
5. Messen Sie die Cantilever-Federkonstante in der Luft. Dieser Schritt wird bei den meisten modernen Mikroskopen automatisiert, indem die thermischen Fluktuationen des Cantilevers aufgezeichnet und die erste Resonanzspitze an ein einfaches harmonisches Oszillatormodell angepasst wird, das nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wird.
   HINWEIS: Die Messung der Federkonstante wird in einigen AFM-Anwendungen oft übersehen, ist aber entscheidend für die korrekte Interpretation von 3D-FFM-Daten, insbesondere für die Umwandlung von Daten aus Instrumentenobservablen in gemessene Kräfte, wie in einem späteren Abschnitt beschrieben.

2. Laden des Substrats und der Lösung

1. Trennen und entfernen Sie den Cantilever-Halter vom AFM-Tisch und geben Sie ~60 μl der Bildgebungslösung auf die Cantilever-Spitze. Stellen Sie sicher, dass die Spitze vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Achten Sie darauf, dass während dieses Prozesses keine Luftblasen entstehen.
   HINWEIS: Bei der Bildgebungslösung kann es sich um alles handeln, was mit der wissenschaftlichen Untersuchung zu tun hat. Als Testlösung verwenden Sie [KCl] = 10 mM oder sogar reines Wasser.
2. Spalten Sie die Probe (z. B. Glimmer) unmittelbar vor den Messungen, um eine glatte und saubere Oberfläche zu erhalten. Spülen Sie die Probe mit der Bildgebungslösung ab und geben Sie dann ~100 μl derselben Bildgebungslösung auf die Probenoberfläche.
   1. Legen Sie das gereinigte Substrat auf den Probentisch. Die Substratgröße variiert je nach Experiment; Er kann so groß wie ein 1 x 1 cm² großer Wafer oder so klein wie Nanopartikel sein, die auf einer Oberfläche abgeschieden werden.
      HINWEIS: Wie bei jeder anderen AFM-Messung ist eine saubere Oberfläche sehr wichtig, um zuverlässige 3D-Daten zu erhalten, da die Grenzfläche besonders empfindlich auf Verunreinigungen durch organische Stoffe und andere Rückstände reagiert²⁷.
3. Setzen Sie den Kragarmhalter zurück und befestigen Sie ihn in seiner Position auf der Bühne. Senken Sie die Cantilever-Position vorsichtig ab, bis die Lösung auf die Spitze tropft und die Probe in Kontakt kommt. Der Probentisch wird entweder über die Gerätesoftware oder über einen physischen Knopf am Instrumentenkörper gesteuert.
4. Lassen Sie die Probenoberfläche etwa 10 Minuten lang chemisch äquilibrieren und Ionen mit der Bildgebungslösung austauschen.
   1. Als optionaler Schritt entfernen Sie die Cantilever-Spitze, ersetzen Sie die Bildgebungslösung durch ein frisches Aliquot, setzen Sie den Cantilever-Halter wieder ein und nähern Sie sich der Probe, bis die Spitze wieder in die Lösung eingetaucht ist.

3. Einstellen von Geräteparametern für amplitudenmodulierte AFM-Messungen

1. Nehmen Sie ein weiteres Wärmebild auf, während die Spitze in die Lösung eingetaucht ist. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass die Federkonstante auf dem in Schritt 1.5 berechneten Wert festgelegt ist, während ein Geräteparameter (z. B. AmpInVOLS-Parameter) verwendet wird, um die thermische Spitze anzupassen. Auch dieser Schritt wird bei den meisten modernen Mikroskopen mit wenigen Klicks unter dem Abschnitt "Thermisches Diagramm" in der Gerätesoftware automatisiert.
   HINWEIS: Dieser Parameter kalibriert die Umwandlung des vom Gerät erfassten elektronischen Signals in den Spitzen-Proben-Abstand in Nanometern, so dass der Experimentator zuverlässige Daten über die Spitzenposition und -ablenkung erhalten kann.
2. Stimmen Sie die Cantilever-Spitze ab, indem Sie die Antriebsfrequenz (ν_exc) auf die Resonanzfrequenz (ν_e) einstellen und anschließend die Phasenverschiebung um 90° nahe der Resonanzfrequenz zentrieren. Dabei handelt es sich um Geräteparameter, die der Benutzer mit dem Protokoll des Herstellers steuern kann, wenn er das Gerät im amplitudenmodulierten Modus betreibt.
   HINWEIS: Einige AFM-Geräte verwenden photothermische Anregung, bei der die Resonanzfrequenz dem in Schritt 3.1 ermittelten Wert entspricht. Diese Methode der Spitzenanregung ist für das 3D-Kraftmapping von großem Vorteil, da sie auch bei sehr niedrigen Antriebsamplituden stabile Abbildungsbedingungen ermöglicht.
3. Ermitteln Sie die ungefähre Höhe der Probenoberfläche und nähern Sie sich vorsichtig der Spitze, bis sie in die Oberfläche eingreift. Ändern Sie dazu die Sollwertamplitude auf ca. ~70 % der freien Amplitude mit dem Parameter "Sollwert " in der Gerätesoftware. Wenn sich die Spitze der Oberfläche nähert, sinkt die Amplitude, bis sie den Sollwert erreicht und somit bestimmt wird, an der Oberfläche eingerastet zu sein.
4. Erhalten Sie eine einzelne Kraftkurve ab einem Abstand von ~200 nm von der Oberfläche. In der Regel erfolgt dies im Bereich "Kraft" der Gerätesoftware. Bevor Sie die Spitze zurückziehen, stimmen Sie die Phasenverschiebung erneut ab und zentrieren Sie sie um 90° wie in Schritt 3.2. Die Resonanzfrequenz nimmt aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Spitze und Oberfläche leicht ab.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass bei den nachfolgenden 3D-FFM-Messungen die Phasenverschiebung in der Position der eingefahrenen Spitze etwa 90 Grad beträgt.
5. Ändern Sie die eingestellte Amplitude auf ~70% der freien Amplitude. Verwenden Sie keine sehr niedrigen Sollwerte (große, aufgewendete Kraft), da dies die Spitze vorzeitig beschädigen kann.
6. Erfassen Sie ein topografisches Bild. Beginnen Sie für glatte Oberflächen wie Glimmer mit einem Bild von ~20 x 20 nm² . Bei raueren Oberflächen beginnen Sie mit der Abbildung größerer Bereiche, bevor Sie schnell einen atomar glatten Bereich von 20 x 20 nm² für die Abbildung lokalisieren. Untersuchen Sie die aufgenommenen Bilder sorgfältig. Zu diesem Zeitpunkt sollte die 2D-Bildauflösung mindestens der gewünschten 3D-Force-Mapping-Auflösung entsprechen.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass der Schaden an der Spitze so gering wie möglich gehalten wird. Nehmen Sie z. B. nicht mehr Bilder als nötig auf und verwenden Sie sanfte Sollwerte, große Bildverstärkungen und niedrige Abtastraten, wenn Sie große und raue Bereiche abbilden.
7. Reduzieren Sie mit der Gerätesoftware die Antriebsamplitude auf ca. 0,25 nm und wenn möglich sogar darunter. Reduzieren Sie den Sollwert entsprechend, so dass er immer kleiner als die Antriebsamplitude ist, und nehmen Sie Testbilder auf . Bei richtiger Auswahl der Spitze und der Bildgebungsbedingungen kann die Antriebsamplitude auf ~0,1 nm reduziert werden. Seien Sie jedoch sehr vorsichtig, wenn die Bildgebung mit einer so kleinen Amplitude über einer rauen Oberflächentopographie die Spitze beschädigen könnte.
   HINWEIS: Für eine bessere vertikale Auflösung sollte die Treiberamplitude kleiner sein als die Lösungsmerkmale, die aufgelöst werden sollen. Die kleinste freie Amplitude, die realistisch erreicht werden kann, wird durch das thermische Rauschen begrenzt, das mit dem Cantilever- und Instrumental-Setup verbunden ist. Man kann das Signal-Rausch-Verhältnis beim Stimmen des Cantilevers qualitativ bewerten, indem man die Spitzenamplitude im Vergleich zum Basisrauschen analysiert.
8. Erfassen Sie einzelne Kraftkurven ab einem Tip-Sample-Abstand von 200 nm. Reduzieren Sie anschließend den Tip-Sample-Abstand für die Kraftkurven auf 50 nm, 10 nm und schließlich 5 nm.
   HINWEIS: Optimieren Sie die Messbedingungen so, dass die Amplitude in der Position der eingefahrenen Spitze so gering wie möglich ist (< 0,25 nm); Die Phasenverschiebung in der Position der eingefahrenen Spitze beträgt ~90°; Die Anregungsfrequenz (ν_exc) ist gleich oder sehr nahe an der Resonanzfrequenz (ν_e), was die Umrechnung von Instrumentenobservablen in gemessene Kräfte in den späteren Schritten vereinfacht; Und der Sollwert ist niedrig genug, so dass die Phasenverschiebung (und die Amplitude) innerhalb der letzten Nanometer der Kraftmessung deutlich abfällt (um ~40-50%). Die aufgebrachte Kraft kann weiter erhöht (Sollwert verringert) werden. Der Nachteil ist, dass die Spitze bei diesem Prozess schneller beschädigt wird.
9. Stellen Sie sicher, dass Sie die Spitze zurückziehen, nachdem die Kraftkurvenerfassung gestoppt wurde. Wenn die Spitze eingerastet und nahe an der Oberfläche bleibt, kann sie auf die Oberfläche zudriften und auf die Oberfläche prallen.
   HINWEIS: Abbildung 1 zeigt eine 1D-Kraftkurve für das Muskovit-Wasser-System, das in [NaCl] = 10 mM Lösung erfasst wurde, insbesondere die Reaktionen auf Phase (φ), Amplitude (A) und Ablenkung (δ). In diesem Stadium sollten diese Profile Hinweise auf die Merkmale zeigen, die in den 3D-Karten angestrebt werden und sich als oszillierende Merkmale manifestieren, die in der Phasenkurve am deutlichsten sind. Beachten Sie, dass die Höhenkoordinate für diese Rohdaten beliebig ist. Weitere Details zur Datenverarbeitung und -analyse finden Sie in einem späteren Abschnitt.

4. Erwerb von 3D-Kraftkarten

HINWEIS: Die Ermittlung der optimalen Parameter für 3D-FFM-Messungen hängt von der Probenoberfläche, der Cantilever-Spitze und der Bildgebungslösung ab. Als Ausgangspunkt werden allgemeine Richtlinien bereitgestellt, aber die entsprechenden Parameter für jede Probe erfordern die Gewinnung und Analyse von Datensätzen mit verschiedenen Messbedingungen. Die folgenden Schritte zeigen, wie Sie die 3D-Kraftkarten für das Mineralwassersystem erfassen. Alle in Schritt 4.2 beschriebenen Parameter werden mit der Gerätesoftware eingestellt.

1. Führen Sie alle Schritte aus, wie in Abschnitt 2 und 3 beschrieben.
2. Stellen Sie den Tip-Sample-Abstand (z) auf 2-5 nm ein. Dieser Abstand ist ausreichend, um die Merkmale der Grenzflächenlösung aufzulösen, da sich die Spitze nahe an der Oberfläche befindet, und ermöglicht es der Spitze auch, sich mit der Schüttlösung auszugleichen, wenn sie in die am weitesten entfernte Position zurückgezogen wird.4.3.
3. Stellen Sie den Scanbereich auf 3 x 3 nm² oder 10 x 10 nm² mit einer Auflösung von 64 x 64 Pixeln² -128 x 128 Pixel² ein.
   HINWEIS: Andere Anwendungen, wie z. B. die Bildgebung von Biomolekülen, erfordern möglicherweise größere Scangrößen in allen drei räumlichen Dimensionen.
4. Legen Sie die Rate der Kraftkurvenerfassung auf 200-800 Hz fest, was 15-120 s pro 3D-Datensatz entspricht. Im Idealfall verringern Sie diese Zahl so weit wie möglich, um Bildverzerrungen und thermische Drift der Spitze zu minimieren und gleichzeitig eine anständige Auflösung in z-Richtung beizubehalten. Für diese Abtastraten und Abmessungen werden nach der Verarbeitung der Daten 50-100 pix/nm in z-Richtung erhalten, was in der Regel ausreicht, um die Grenzflächenlösungsstruktur aufzulösen.
5. Wählen Sie als Ausgangspunkt einen Wert für den Sollwert , so dass die Phasenverschiebung in jeder Kraftkurve routinemäßig auf ~50-60° abfällt. Der Sollwert konnte bis zu 50 % der freien Amplitude definiert werden. Dies hängt jedoch insbesondere von der Art der zu messenden Probe ab und erfordert Versuch und Irrtum. So kann beispielsweise die Verwendung eines niedrigen Sollwerts (hoher Druck) die Spitze beschädigen oder die Oberfläche bei weichen Molekülen verformen. Andererseits reicht ein hoher Sollwert (niedriger Druck) möglicherweise nicht aus, um die Hydratationsschichten zu durchdringen und zu sondieren.
6. Stellen Sie sicher, dass die Software vier wichtige Observablen aufzeichnet, die zur Analyse der amplitudenmodulierten AFM-Daten erforderlich sind: Spitzenhöhe, Amplitude, Phase und Auslenkung. Beachten Sie, dass je nach Gerät und Software mehrere Datenkanäle für die Verfolgung der Spitzenhöhe vorhanden sein können. Da 3D FFM eine sehr hohe Auflösung erfordert, ist es wichtig, die glattesten Spitzenhöhenprofile mit dem geringsten überlagerten elektronischen Rauschen des Instruments zu verwenden. Zusätzlich zur Aufzeichnung dieser Schlüsselvariablen sind weitere Betriebsparameter und Metadaten erforderlich, um die auf die Spitze ausgeübten Kräfte zu analysieren und zu rekonstruieren (die in der Regel standardmäßig in Ihrer Datendatei gespeichert werden), wie in einem späteren Abschnitt erläutert wird.
   HINWEIS: 3D FFM wurde sowohl im amplitudenmodulierten als auch im frequenzmodulierten AFM-Modus demonstriert. Hinsichtlich der Datenqualität und -analyse sind beide Methoden gleichwertig. Dementsprechend bleibt die bevorzugte Betriebsart dem Ermessen und der Erfahrung des Experimentators überlassen. Ein möglicher Vorteil des amplitudenmodulierten Modus ist die Stabilität der Spitze über größere z-Entfernungen , die es dem Benutzer ermöglicht, 3D-Daten zu erhalten, die sich über >10 nm in die Lösung erstrecken. Im Vergleich dazu besteht ein Nachteil dieses Modus darin, weiche Moleküle mit Relaxationszeitskalen abzubilden, die langsamer sind als die Cantilever-Bewegung. Letzteres bietet FFM die Möglichkeit, die Grenzflächenrelaxation in weichem Material und viskosen Flüssigkeiten zu untersuchen. In diesen Fällen können die gemessenen Amplitudenprofile eine Hysterese in den Anfahr- und Rückzugszyklen aufweisen, was zu Unsicherheiten über die tatsächliche Spitzenhöhe führt.

5. Verarbeitung von 3D-Kraftkartendaten

HINWEIS: Die folgenden Schritte können in der bevorzugten Datenanalysesoftware unter Verwendung von intern generierten Codes oder alternativ unter Verwendung der in den unterstützenden Informationen bereitgestellten Datenverarbeitungsdateien durchgeführt werden.

1. Laden Sie die Rohdaten in eine bevorzugte Analysesoftware für Berechnungen und Visualisierungen.
   HINWEIS: Die für die Analyse erforderlichen Observablen sind die Amplitude (A), die Phasenverschiebung (φ) und die Spitzenauslenkung (δ) in Abhängigkeit von der Höhenverschiebung (z) sowie Spitzeneigenschaften wie die Resonanzfrequenz (ν_e), die Federkonstante (k) und der Qualitätsfaktor (Q). Zu den weiteren Betriebsparametern gehören die Scanabmessungen, die Scanrate, die Spitzenanregungsfrequenz (ν_exc) und die Treiberamplitude (A₀). Der letztere Wert wird in der Regel in Spannungseinheiten aufgezeichnet, kann aber auf der Grundlage des in Schritt 3.1 erhaltenen Kalibrierwerts leicht in Nanometer umgerechnet werden.
2. Extrahieren Sie das entsprechende topografische Bild aus dem 3D-Datensatz, indem Sie die weiteste Höhenverschiebung der Spitze an jeder xy-Koordinate aufzeichnen. Berechnen Sie anhand dieser Daten die Probenneigung, indem Sie gerade Linien an die durchschnittlichen Höhenprofile sowohl in x - als auch in y-Scanrichtung anpassen. Selbst wenn die Oberfläche atomar glatt ist, wie z. B. Glimmer, ist eine Probenneigung von mehreren Grad zu erwarten, und die entsprechende Höhenneigung sollte vor der Datenanalyse berücksichtigt werden.
   HINWEIS: Bei den meisten modernen Instrumenten ist dieser Schritt für die reguläre topografische Bildgebung automatisiert, sollte jedoch für 3D-FFM-Daten manuell durchgeführt werden. Natürlich sollte diese Methode leicht angepasst werden, wenn der Benutzer komplexere Oberflächen wie Kristalle mit mehrstufigen Kanten misst.
3. Linearisieren Sie die Höhenverschiebungsprofile. Denken Sie daran, dass die Spitze in 3D FFM bei jedem Annäherungs- und Rückzugszyklus ähnlichen sinusförmigen Trajektorien folgt. Die am weitesten entfernte Ausdehnung der Spitze variiert jedoch, je nachdem, auf welcher kristallographischen Stelle sie landet, und die aufgezeichneten Spitzenhöhen sind offensichtlich nicht identisch mit der letzten signifikanten Zahl. Dementsprechend werden die in allen Spitzentrajektorien gemessenen Höhenwerte diskretisiert, um ein einziges, lineares Z-Profil für alle Kraftkurven zu erhalten.
   HINWEIS: Die Bin-Größe hängt von den Messparametern und der Längenskala der interessierenden Features ab. Für die meisten Anwendungen ist 0,2 Å eine ausreichende Höhenauflösung. Dieser Wert ist mehr als zehnmal kleiner als die Größe eines Wassermoleküls; Die Verwendung kleinerer Behältergrößen bietet keine Vorteile und liegt tatsächlich im mechanischen und elektronischen Rauschen des Instruments.
4. Berechnen Sie die durchschnittlichen beobachtbaren Werte, die den Höhenklassen für jeden einzelnen Kraftverlauf entsprechen. Diese Methode erzeugt ein 3D-Volumen der Phasen-/Amplitudendaten, das einfach in jede Richtung geschnitten und visualisiert werden kann.
   HINWEIS: Prinzipiell sollten die Kraftprofile aus dem An- und Zurückziehen der Spitze ähnlich sein. Man könnte testen, ob es angemessener ist, je nach Stichprobe Daten von einem oder beiden zu verwenden. Insbesondere Biomoleküle und weichere größere Moleküle könnten Hystereseeffekte in den Annäherungs-/Rückzugszyklen zeigen. In diesem Fall wird dem Benutzer empfohlen, die Bildgebungsbedingungen wie oben beschrieben zu ändern.
5. Passen Sie die Höhenprofile an, indem Sie die Auslenkung der Spitze berücksichtigen. Dieser Schritt ist optional und liegt im Ermessen des Benutzers. Bei Auslegern mit großen Federkonstanten (>200 N/m) beträgt die Auslenkung der Spitze in der verdünnten Salzlösung typischerweise weniger als <0,08 Å., was die Daten nicht wesentlich beeinflusst.
   HINWEIS: Basierend auf der spezifischen Stichprobe kann der Benutzer entweder 1) die Spitzenauslenkung für sehr steife Ausleger vernachlässigen, nachdem er überprüft hat, dass ihre Wirkung vernachlässigbar ist, 2) die Spitzenhöhe anhand des aus dem gesamten Datensatz gemittelten Ablenkprofils korrigieren, 3) die Spitzenhöhe für jede einzelne Kraftkurve unter Verwendung der entsprechenden Spitzenauslenkungsdaten aus dieser Kraftkurve korrigieren. Die letztere Option ist intuitiv die "korrekteste" und sollte nach Möglichkeit ausgeübt werden, aber dieser Ansatz führt oft zu mehr Rauschen in den Daten, das den Wert dieser Korrektur überwiegt.
6. Glätten Sie das Dataset mit einem 3D-Medianfilter. In den meisten Fällen reduziert dieser optionale Schritt das Rauschen, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen. Es ist sinnvoll, auch eine Version der ungefilterten Daten für die Konsistenzprüfung bei späteren Analyseschritten aufzubewahren. Darüber hinaus kann der Benutzer fortschrittlichere Filtermethoden erkunden, wie z. B. auf der Hauptkomponentenanalyse basierende Methoden, die mit den meisten Datenverarbeitungsprogrammen leicht verfügbar sind.
7. Speichern Sie die verarbeiteten Ergebnisse sowie die nützlichen Metadaten (Messparameter, die für die Umwandlung von AFM-Observablen in die Spitzenabtastkraft wichtig sind) in einer Datendatei, die für die spätere Analyse verwendet werden kann.
   HINWEIS: Die drei Datenverarbeitungsdateien, die in den unterstützenden Informationen bereitgestellt werden, können verwendet werden, um die in diesem Abschnitt aufgeführten Funktionen auszuführen. Die erste Datei lädt die 3D-FFM-Rohdaten und erstellt eine hdf5-Datei, die die relevanten Daten und Metadaten enthält. Dabei handelt es sich lediglich um eine Übertragung der Daten in eine benutzerfreundlichere Datei, auf die für die Verarbeitung leichter zugegriffen werden kann. Die zweite Datei verarbeitet die Rohdaten gemäß den oben beschriebenen Schritten, indem sie das äquivalente Höhenbild extrahiert, die Höhenverschiebungsprofile linearisiert, die Datenwerte in die entsprechenden Höhenklassen sortiert, den Datensatz mit einem Filter glättet und die verarbeiteten Ergebnisse in einer Ausgabedatendatei speichert. Der Benutzer kann auch einige Funktionen aktivieren, um Beispielkraftkurven (roh und verarbeitet), xz/xy-Schichten und die Korrektur der Substratneigung zu plotten sowie andere Konsistenzprüfungen nach der Verarbeitung durchzuführen. Diese Datenverarbeitungsskripte sind benutzerfreundlich und mit Anmerkungen versehen und zeigen die genauen Schritte für den Benutzer, um Parameter zu optimieren und Daten aus den Rohdateien des Instruments zu extrahieren.

Ergebnisse

Abbildung 2A zeigt ein Schema der 3D-Kraftkartierung. Ähnlich wie bei anderen AFM-Techniken, die im amplitudenmodulierten Modus arbeiten, wird ein oszillierender Cantilevers über die Oberfläche abgetastet. Zusätzlich zur Spitzenhöhe an jeder Koordinate werden Beobachtbarkeiten des Instruments wie Phasenverschiebung und Amplitude erfasst, wenn sich die Spitze der Oberfläche nähert und sich von ihr zurückzieht. Das Ergebnis ist ein 3D-Datensatz von Obs...

Diskussion

Auswahl der AFM-Spitze
Wie bei jeder AFM-Anwendung sind die wichtigsten Merkmale der Sondenspitze die Resonanzfrequenz, die Cantilever-Größe, der Spitzenradius, das Spitzenmaterial und die Federkonstante. Fast die gesamte bisherige 3D-FFM-Literatur hat über die Verwendung von steifen, hochfrequenten Spitzen berichtet. Die gebräuchlichsten Beispiele sind Spitzen auf Silikonbasis (z. B. AC55TS, PPP-NCH, Tap300-G usw.), die in ihren höheren Resonanzmodi verwendet we...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC55TS AFM tip	Olympus
Cypher VRS Atomic Force Microscope	Asylum Research
PPP-NCH AFM tip	Nanosensors
Tap300-G AFM tip	Budget Sensors
USC-F5-k30-10 AFM tip	Nanoworld
(Note only one of the AFM tip options is required)