フローサイトメトリーによる分析のための子宮内生リンパ球細胞の分離

要約

これは、妊娠中および非妊娠マウスの両方から子宮リンパ球細胞を単離する方法である。この方法は、FACSの表現型、細胞分類、機能アッセイ、RNA-seq、プロテオミクスなどの複数の下流アプリケーションに使用できます。ここでのプロトコルは、フローサイトメトリーによる細胞性の細胞の1個の子宮型を表示しています。

要約

ここで説明する簡単な方法は、フローサイトメトリーによって個々の妊娠子宮から1個の子宮内生性リンパ球細胞(g1 uIC)を単離し、表現型マウス群である。このプロトコルは、複数の同期ダムを得るために時間交配を設定する方法、妊娠中の子宮の機械的および酵素的消化、単細胞懸濁液の染色、およびg1 uILCを表現および識別するためのFACS戦略を記述する。この方法は必然的に組織内の細胞分布の空間的情報を失うが、プロトコルはuILC異質性、妊娠に影響を与える母親および胎児因子に対するそれらの応答、それらの遺伝子発現プロファイル、およびそれらの機能を決定するために正常に適用されている。

概要

ここで説明する、個々の妊娠子宮から子宮内在性リンパ球の高収率を得るための簡単な方法がある。この方法は、子宮内生リンパ球のタンパク質表面発現および機能性を維持し、FACSフェノタイピング、RNAseq、プロテオミクスまたは機能的アッセイなどのその後の用途に適しています。ここで、フローサイトメトリーによるグループ1 uICのフェノタイピングに焦点を当てています。

子宮は、子宮内膜、ミオメトリウム、およびペリメトリウムの3つの層で構成されています(図1)。子宮内膜は粘膜であり、子宮の内腔を覆う。黄体によって産生されるプロゲステロンは、子宮内膜をデシドゥアに変換する。子宮筋膜は、子宮壁を構成する平滑筋の2層で構成されています。ペリメトリウムは、子宮を包み込み、メソムトリウムと呼ばれる広い靭帯を通して腹膜に接続するセロサである。子宮の断面では、内腔の反対側の部分はメソメ面側と呼ばれ、内腔に近い部分は抗心膜側と呼ばれます。様々な母体白血球が子宮内膜とデシドゥアに生息し、数種類の細胞を含み、自然免疫細胞が大多数の細胞を占める。自然性リンパ球細胞(INC)、マクロファージ、樹状細胞(DC)、CD4⁺およびCD8⁺Tリンパ球、調節性T細胞(Tregs)、および稀なB細胞は、すべて妊娠全体を通して子宮環境の調節において重要な役割を果たし得^る1,2。子宮内のICは、粘膜だけでなく、マウスのミオメトリウムにも見られる。IRCの3つのグループすべてを含め、子宮は確かにグループ1 ILCによって最も密度の高い器官である。子宮組織の構造転換により、子宮白血球の数と割合も変化する(グループ1 uILCサブセットの割合の変動の例については図2Aを参照)。^3,4。

本論文でマウスを紹介する場合、近親交配の実験用マウスのC57BL/6株を意味する。繁殖マウス(例えば、NMRIマウス)は、生殖率が高いため、生殖研究でよく使用されます。しかし、近交系株の使用は一貫した結果を生成するために必要であり、免疫学者の好きな遺伝的背景はB6としても知られているC57BL / 6である。

妊娠中期のB6ダムの子宮白血球の約30%はg1 uILCであり、これは生き生きとしたCD45^{+CD3-CD19-NK1.1+}NKp46⁺細胞(図2B):前血管新生組織居住NK(trNK)、IFN-g産生従来型NK(cNK)、および^5LCと定義される。uNK細胞の割合はヒトにおいてさらに高く、最初の三半期では約70%に達^する。ヒトとマウスuNKとuILC7,8の違いよりも類似点が^多い。違いを念頭に置いておくのは重要ですが、2つの種に関する情報を統合することは有用です。ヒトと実験室のげっ歯類のuILCを調べ得た情報を組み合わせると、NK細胞が動脈完全性⁹およびスパイラル動脈リモデリング10の維持、ならびにトロホブラストの浸潤^11,12を含む子宮の生物学に不可欠なホメティック静動態変化を助けることは明らか^である。彼らはまた、病原体^13,14に対する防御において特定の役割を果たしています。マウスおよびラットでは、移植部位の周りのデシドゥアを充填する以外に、NK細胞は、過去に心房腺としても知られている一過性構造のダムの筋膜の2つの筋肉層の間に蓄積する(MLAp)¹⁵(図1B)、その機能はまだ発見されていない。

ここで説明する方法の詳細なプロトコルは、機械的分解と酵素消化の組み合わせを使用して、妊娠中のマウスの子宮からリンパ球を分離するために実験室で使用される方法の詳細なプロトコルです。子宮全体がこの方法で使用されるので、妊娠中に子宮から分離されたリンパ球は、デシデュアル細胞と筋膜細胞の混合物である。子宮壁およびそのMLApからのデシドゥアのさらなる解剖が可能であり、前¹⁶に記載されている。ここで説明する方法は、タンパク質表面の発現、細胞機能、および生存率を維持しながら子宮リンパ球を得るために開発されました。結果は、最小の残存細胞の破片を有する単一細胞懸濁液であり、一般的に妊娠中の子宮の妊娠中(10.5日)に1〜500万個の細胞の範囲の収量である。この方法の用途は、フローサイトメトリーによる表現型、その後の転写またはプロテオミクス研究のための細胞選別、細胞内サイトカイン産生、脱顆粒、ELISPOTまたは細胞傷害アッセイなどの機能研究を包含する。ここで紹介するプロトコルは、グループ1のICを特定することに焦点を当てていますが、FACS分析に使用される抗体パネルのわずかな変更を伴う他のILC、T細胞、B細胞、DC、またはマクロファージなどの他の細胞タイプに適応することができます。このプロトコルは、他の組織から細胞を分離し、プールされた非妊娠子宮のためにも使用することができる。

プロトコル

本論文に記載されているすべての動物実験は、英国内務省が発行したPP2363781に基づき、1986年の動物(科学的手順)法に従って実施された。以下のプロトコルは、マウスの畜産から始まり、FACS分析のための染色で仕上げのいくつかのセクションで構成されています。 図 3 は、プロトコルの主な手順を示しています。プロトコルで使用されるマテリアルは、 材料表にリストされています。

1. 一般的なマウスの夫,交配,解剖

1. 7-14週齢の雌マウスを特定の病原体フリー(SPF)状態下に保ち、グループ収容(ケージサイズと動物の体重に応じて通常4〜6匹の女性)を10〜14日間保ち、イブート効果を引き起こし、それが発^情同期化を引き起こす。
2. SPF状態でスタッドの男性を保ち、一戸舎で、交配(精子再生のための時間)の間に少なくとも48時間休んでください。彼らは通常、若いものよりもパフォーマンスが高いので、経験豊富な実績のある3〜4ヶ月の古いスタッド男性を使用することが好ましいです。
3. 女性が妊娠する可能性を高めるために、交配の3日前に女性のケージに男性のケージから汚れた寝具を導入する。これは、男性の尿フェロモンへの暴露によってウィッテン効果¹⁸ を引き起こし、同期した発情および交配のための強化された受容性をもたらす。
4. 0日目(D0)に、雌2匹につき1匹のスタッド雄を使用して交配用のマウスを設定します。プラグレートは約20%~25%と考えてください。
   注:マウスは夜行性の動物であるため、交配は夜間に発生する可能性が高いです。
5. 交尾後の朝(D0.5)に、交尾の指標である膣プラグの有無を確認します(図4)。膣プラグは、男性の射精の集合体であり、通常、交配後8〜24時間まで持続する。早朝にプラグを確認してください。
6. 差し込んだ女性を新しいケージに入れ、それらをイヤマークします。男性をケージに戻して休みます。
7. 交配後D9.5または10.5で、組織の採取のために1 mL無菌HBSS 1x(^Mg2+ および^Ca2+)で5 mLチューブを調製し、氷の上に置きます。
8. 子宮頸部脱臼で動物安楽死に進み、続いて死亡を確認するために排泄する。
9. 下流のアプリケーションが必要な場合は、無菌環境で作業します。安楽死後直ぐに、70%エタノールでマウス本体を拭き取り、滅菌器具を用いた層状フラックスキャビネットの下で解剖を進める。
10. 妊娠中の子宮に心間脂肪を含まない切断(図5)、準備された適切に5mLのチューブに子宮全体を入れる。チューブを氷の上に置いておきなさい。

2. 子宮の機械的および酵素的消化

1. 酵素消化液を調製するには、生殖不能HBSS 1xの子宮当たり3mLを30μg/mLのDNAseと0.1ヴュンシュユニット(WU)/mLのリベレーターDHまたはリベレーターTMの0.52 WU/mLと混合します。水浴に37°Cの溶液を入れる。
   注:リベラーTMとリベラーDHの両方を使用することができます。一方の選択は、その後のフローサイトメトリー分析に使用される抗体によって認識されるエピトープに対する潜在的な効果によって導かれなければならない。
   注意:凍結乾燥酵素を使用する場合は、フードの下で動作します。
2. PBSで5 mM EDTAの20 mLを準備します(^Ca2+/^Mg2+なし)。水浴に37°Cの溶液の半分を置き、氷の上に残りの半分を置きます。
3. 層フラックスキャビネットの下で、妊娠中の子宮を取り巻く脂肪を滅菌ペトリ皿の無菌器具でそっと取り除きます。組織を乾燥させないでください。
4. 胎児(タツノオトシゴ形の半明体構造、長さ約1mm)を除去するために、各注入部位を無菌の器具で解剖する(図6A)。胎児を捨てる。
5. 子宮を元のコレクション5 mLチューブに戻し、5mLチューブと回収媒体に直接はさみを使用して組織をミンチします。手順の間に常に氷の上にチューブを保ちます。
6. 37°Cの水浴に、ひき肉を含む5mLチューブを水浴中に入れます。
7. 各サンプルに3mLの温かい酵素消化ミックスを加えて、チューブ内の液体の総体積が4mL(ひき子宮を用いた1mLの収集媒体、酵素消化溶液3 mL)になるようにします。37°Cで30分間、酵素消化活性を高める5 mLチューブをインキュベートします。
8. 5 mLのチューブをボルテックスし、氷の上に置いて酵素の作用を阻害します。次いで、その後、適切にラベル付けされた15 mL遠心管に内容物を移す。
9. 氷冷5 mM EDTA PBS溶液の10 mLを使用して、5 mLチューブから15 mL遠心管にすべてを洗い流します。
10. 消化した組織を含む15 mL遠心分離管を400 x gで10分間遠心分離する。
11. 上清を捨て、ペレットを軽くフリックし、10 mLの温かい(37°C)5 mM EDTA PBS溶液に再懸濁します。
12. 37 mL遠心分離管のサンプルを15分間撹拌して15分間インキュベートし、残った消化媒体を取り除き、細胞の凝集を減らします。
13. さらに組織解離を促進するために10sの高い上のサンプルを渦。

3. 子宮を単一細胞懸濁液に加工

1. 滅菌1 mLシリンジのプランジャーを使用して、消化した組織を70μmのストレーナーを通して適切に標識された無菌50 mL遠心分離管に押し付け、細胞塊および解剖されていない組織を除去する。
2. すべての細胞を収集するために冷たいPBSの合計10 mLでストレーナーを数回洗浄します。
3. 50 mL 遠心管を400 x gで10分間回転 させます。
   注:オプションAまたはオプションBを使用してさらなる手順を実行し、オプションBよりも少ない破片および間質細胞汚染でリンパ球のより良い濃縮を可能にします。しかし、オプションBは、細胞損失が少なく、サンプル間の細胞収量の変動性が低いため、より高い免疫細胞収量を与えます。オプション B も技術的に実行しやすくなります。したがって、設定に応じて、オプション A またはオプション B に進みます。
   1. オプション A の手順は次のとおりです。
      1. PBSで希釈した80%(v/v)等張性パーコールの5 mLを含むサンプルごとに1つの無菌15 mL遠心分離管にラベルを付けます。
      2. スピン後、50 mL遠心チューブから上清を捨てます。ピペットの少年を使用して、PBSの40%(v/v)等張性パーコルの8 mLで各ペレットを再懸濁させます。
      3. ピペットの少年を遅い速度で使用して、40%Percoll溶液に再懸濁されたペレットを80%Percoll溶液に慎重にオーバーレイします。ピペットはゆっくりと、継続的に;15 mLチューブを45°の角度で保持します(図6B)。
      4. オーバーレイを邪魔することなく、室温(中加速度と最小ブレーク)で850 x gで20分間15 mL遠心管を遠心分離します。
      5. パーコル層を乱さずに遠心分離機からチューブを慎重に取り外します(図6C)。
      6. 2つのパーコール溶液の界面で白血球のリングを乱すことなく、無菌パスツールピペットを使用して、上部パーコール層の約0.5〜1mLを除くすべての廃棄を行います。
      7. 最小量のPercoll溶液(合計4〜5 mLまで)を吸おうとしている間、白血球のリングを慎重に採取し、細胞を新しいラベル付けされた15 mL遠心分離管に移します。
      8. 各サンプルに10 mLの無菌RMPI-1640培地を加え、熱不活化FBSの10%を補充します。
      9. 4°Cで500× g で5分間の遠心分離機。
      10. 上清を捨ててRBCライシスに進みます。
   2. オプション B の手順は次のとおりです。
      1. サンプルごとに1つの無菌15 mL遠心分離チューブにラベルを付けます。
      2. スピン後、50 mL遠心チューブから上清を捨てます。ピペットの少年を使用して、RPMI-1640培地で8mLの35%(v/v)等張性パーコールを再懸濁させます。
      3. サンプルを15 mL遠心チューブに移します。
      4. 中加速度と最小ブレークで室温で10分間、940 x g でサンプルを遠心します。
      5. 吸上器やピペットの少年を使用して慎重に上清を吸引する(チューブを反転させることではない)。
      6. 10%の熱不活性化FBSを補充したRPMI-1640培地の14mLでペレットを再懸濁し、4°Cで5分間500 x g でサンプルを遠心分離します。
      7. 吸引によって上清を捨て、RBCライシスに進みます。

4.RBC ライシス

1. RBCを溶解するには、サンプルを1x RBC溶解溶液の3 mLで再懸濁し、室温で3分間インキュベートする。
2. 10 mLのPBSをサンプルに加え、反応を止めます。
3. チューブを400xgで5分間遠心し、上清を捨てます。
4. PBSを10 mL追加し、ステップ4.3を繰り返します。
5. 各ペレットを1mLのRPMI-1640培地に再懸濁し、熱不活性化FBSの10%を補充します。
6. 滅菌70 μmの細胞のストレーナーを通してサンプルを渡す。
7. メーカーの指示に従って、トリパンブルーとノイバウアーチャンバーを使用してセルカウントを実行します。
8. 細胞懸濁液の濃度を、PBSまたは培地の100μLで100μLの1〜200万個の細胞に調整します。

5. パネル設計戦略と制御

注意:この論文で説明したパネルはuILC1、trNK、およびcNK細胞の識別に適しており、5レーザーBD LSRFortessaで使用されるように設計されています。異なる細胞集団を研究し、代替蛍光色素を使用するためにマイナーな変更を行うことができます。最適な分離のために滴定された抗体を使用して、メーカーの明るさ指数を調べ、NKp46のような低発現抗原のための最も明るい染料を使用し、一般的なガイドラインに従って、機器の構成を確認することをお勧めします¹⁹。NKp46の蛍光マイナス1(FMO)コントロールを含めるのが推奨されます。

6. FACSのフェノタイピングのための自然なリンパ球の細胞染色

1. 丸底96ウェルプレートにウェルあたり1〜200万個の細胞を移します。
2. プレートを4°Cで3分間回転させ、上清をシンクにフリックして捨てます。
3. マルチチャネルピペットを使用して、細胞ペレットを100 μLのPBS(タンパク質およびアジドフリー)に再懸濁します。
   注: PBS に、後のステップでアジドナトリウム、トリス、またはタンパク質が含まれていることを確認します。
4. ステップ 6.2 を繰り返します。
5. 細胞を50μLの固定性生き生き色素で再懸濁し、PBS(タンパク質およびアジドフリー)(1:1,000)で希釈した。暗闇の中で30分間室温で細胞をインキュベートします。
   注: PBS にアジドナトリウム、トリス、FBS や BSA などのタンパク質が含まれないようにすると、死んだ細胞の染色強度が低下したり、生きている細胞のバックグラウンド染色が増加したりする可能性があります。
   注意:生菌性染料が粉末化されている場合は、ボンネットの下で使用してください。
6. PBSを150μL加え、マルチチャンネルピペットで細胞を再中断し、ステップ6.2を繰り返します。
7. Fc受容体遮断試薬を含むFACSバッファ(PBSは1%BSAまたは2%FBSを補充)の25 μLで細胞を再懸濁する。4°Cで5分間細胞をインキュベートする。
8. 表面抗体カクテルを25 μL加えます。
   注:常に抗体を活性化し、実験の前に抗体パネルを最適化してください。
9. 暗い中で20分間室温でサンプルをインキュベートします。
10. 各ウェルに150 μLのFACSバッファを加え、十分に混ぜ合わせ、ステップ6.2を繰り返します。
11. ステップ 6.10 を繰り返します。
    注: オプション A またはオプション B を使用してさらに手順を実行し、オプション A を使用してセルをサーフェス マーカーで染色します。オプションBを使用して、フローサイトメトリーによる細胞内マーカーを調べてください。
    1. オプション A の手順は次のとおりです。
       1. 1ウェルあたり4%パラホルムアルデヒド(PFA)の100 μLでサンプルを再懸濁し、室温で20分間インキュベートします。
          注意: ボンネットの下に PFA を使用してください。PFAに接触したPFA廃棄物/物品(ピペットなど)を安全に廃棄するための安全シートをご参照ください。
       2. ステップ 6.2 を 2 回繰り返します。
          注意: PFA が含まれているため、ここでシンクにフリックして破棄しないでください。ピペットで吸気し、安全シートに従って廃棄物を廃棄します。
       3. サンプルを200 μLのPBSで再中断します。
       4. サンプルをラベル付きFACSチューブに移し、100 μLのPBSを上に上げろ。FACS分析で処理するまで、チューブを氷の上または冷蔵庫に保管してください。フローサイトメーター上のサンプルを24時間以内に取得します。
    2. オプション B の手順は次のとおりです。
       1. 1ウェルあたり100μLの固定/透過液化溶液(パラホルムアルデヒドを含む)でサンプルを再懸濁し、4°Cで20分間インキュベートします。
          注意: ボンネットの下に PFA を使用してください。PFAに接触したPFA廃棄物/物品(ピペットなど)を安全に廃棄するための安全シートをご参照ください。
       2. ステップ 6.2 を繰り返します。
          注意: PFA が含まれているため、ここでシンクにフリックして破棄しないでください。ピペットで吸気し、安全シートに従って廃棄物を廃棄します。
       3. 1xパーメアビライゼーション/洗浄バッファーの200 μLを加え、よく混ぜてから、ステップ6.2を繰り返します。
       4. ステップ 6.11.2.3 を繰り返します。
       5. 細胞内染色用の抗体ミックスを含む1xパーメアビライゼーション/洗浄バッファーの50 μLで固定および透過細胞を再懸濁します。
       6. 暗い部分で30分間、4°Cでサンプルをインキュベートします。
       7. 1x透過/洗浄液の200 μLを加え、よく混ぜてから、ステップ6.2を繰り返します。
       8. ステップ 6.11.2.7 を繰り返します。
       9. サンプルを200 μLのPBSで再中断します。
       10. サンプルをラベル付きFACSチューブに移し、100 μLのPBSを上に上げろ。FACS分析で処理するまで、チューブを氷の上または冷蔵庫に保管してください。フローサイトメーター上のサンプルを24時間以内に取得します。
           注: このプロトコルを実行した後、デシデュアル セル サスペンションは FACS 分析の準備ができています。サンプルごとにできるだけ多くのイベントを記録することをお勧めします。信頼できる結果を得るには、親の人口の少なくとも1,000-3,000のイベントを取得する必要があります。

結果

上記の方法の主な工程は、子宮白血球の単一細胞懸濁液を得るために記載されている、図3に要約されている。図2Bに示されているのは、B6マウスにおけるg1 ICの3つのサブセット(uILC1(CD49a⁺Eomes^-)、trNK(CD49a⁺Eomes⁺)、およびcNK(CD49a-Eomes⁺)細胞の3つのサブセットの同定に使用される基本的なFACS格言戦略である。これらの集団のさらなる分析は、g1 ICの様々な表面および細胞内マーカーを研究するために行うことができる。一例として、抗NK1.1抗体による刺激後のuILC1、trNK、およびcNK細胞においてIFN-ɣと自己MHC受容体の共発現を評価することができる(図7)。

研究課題に応じて、プロトコル(図3)と抗体パネルの両方を適応させることができる。重要なことに、g1 ILC格座用の1つのFACSパネルに抗NK1.1抗体と抗NKp46抗体の両方を使用することが推奨される(図2Bおよび表1)。なお、血液、脾臓、肝臓から得られたg1のIICは、その表面上のNKp46の発現が子宮の対応よりも高い(図8)。NK1.1の表面染色により、分離性が向上し、子宮g1 ICを容易にゲートすることができます(図8)。NKp46はすべてのマウス株で表されるが、 抗NK1.1抗体PK136によって認識されるNKR-P1C抗原は、C57BL/6(すなわち、B6)、FVB/N、およびNZBを含むいくつかのマウス株によってのみ発現されるが、AKR、BALB/c、CBA/J、C3H、DBA/1、DBA/2、NoD、SJL、または19222においてのみ発現する。また、研究者がMHC受容体Ly49のような重要なNK細胞受容体を研究する場合、ヒトキラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)の高い変動性を再現する検査用マウス株のアレルゲン変化を認識することが重要である。また、細胞が機能アッセイのためにNK1.1で刺激される場合、Kim、S.20に記載されているように、抗NK1.1ではなく抗NKp46で細胞を染色することが望ましい場合があり、NKR-P1C抗原が架橋抗NK1.1または受容体の下方調節によって占めてもよいので、刺激に従えばよい。受容体占有またはダウンレギュレーションのいずれかが刺激に使用される同じ抗体による染色を妨げる可能性があります。

酵素組織解離に関する一般的な問題は、消化培地に使用される酵素による細胞上の表面エピトープの変化である。例えば、リベラーゼTMを使用するとMHC CD94:NKG2A受容体の染色が悪い。しかし、リベラーDHによる消化は、16A11抗体クローンによるNKG2A認識を保持する(図9)。FACSパネル内のすべてのエピトープに対する酵素の影響を確認することをお勧めします。この目的のために、機械的解離(70 μmストレーナーを通して脾臓全体を通過)によって得られたマウス脾細胞の懸濁液を使用してください。その後、サンプルを2つ以上の部分に分け、酵素の有無にかかわらず培地でインキュベーションを行います。

前述のように、血液由来細胞は、組織解分サンプル中に存在する。必要に応じて、マソプスト研究室²¹で開発された血管内染色法を用いて血液汚染物質を除外することができる。 図10 は、妊娠8.5日目の子宮組織サンプルに存在するg1 IcCsの約6.5%が血液由来であることを示している。血管内染色に使用される抗CD45抗体は、ダンプチャネルに使用されるフルオロクロムと共役することができる。これは、余分な蛍光チャネルを使用せずに血液汚染物質を除外します。最も一般的な問題とその解決策を 表 2 に示します。

図1:マウス子宮の断面。 (A)マウス子宮断面(非妊娠)は、子宮に入り込む様々な母体白血球を示す。 (B)マウス子宮断面(妊娠8.5日目)。(C)マウス子宮断面(妊娠13.5日目)。(D) 胚盤胞期以降のマウスとヒト胎盤形成の比較BioRender.com で作成された画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:初期および妊娠期のマウスにおける子宮g1 ILC1(A)の子宮cNK、ILC1およびtrNKの割合。W - 週、gd - 妊娠日。フィリポビッチ、I.ら.⁴からの修正されたグラフ。(B)フローサイトメトリーによる子宮グループ1 ILCサブセットを分析する測定戦略。リンパ球は、妊娠10.5日目に子宮組織から単離した。組織消化は、リベタTMを含む消化培地を用いて行った。細胞は、光を散乱させる能力に基づいてゲートされた。FSC-A対FSC-Hプロットを使用してダブレットを除外し、さらにCD45^+CD3-CD19-生存可能な細胞のみを分析した。CD45^+CD3-CD19-生存可能な細胞内で、グループ1 ILCゲートはNK1.1+NKp46⁺細胞として同定された。グループ1 ICの中で、CD49a-Eomes⁺従来のNK細胞(cNK)、CD49a⁺Eomes⁺組織居住NK細胞(trNK)、およびCD49a⁺Eomes-uILC1^の3つのサブセットを同定することができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:プロトコルの主要なステップの視覚的なガイド。 (1)妊娠中の子宮に心間膜脂肪を含まないものを解剖する。(2) 胎児を取り除く。子宮を5mLチューブに戻し、組織をミンチします。酵素消化ステップを進める:各サンプルに3mLの温かい酵素消化ミックスを加える。37°Cで30分間、5 mLチューブを攪拌してインキュベートします。(3) (i) 消化後、10 mLの氷冷5 mM EDTA PBS溶液を用いて、5 mLチューブから15 mLチューブに全てを洗い流します。(ii) 消化組織を含む遠心分離管15 mLチューブを、400 x gで10分間用いた。(iii) 上清を捨てる。ペレットを軽くフリックし、10 mLの温かい(37°C)5 mM EDTA PBS溶液に再懸濁します。(iv)37°Cの15 mLチューブ内のサンプルを攪拌してインキュベートし、15分間(4)滅菌1mLシリンジのプランジャーを使用して、70μmストレーナーを通して消化した組織を適切に標識された50mLチューブに強制し、400xgで10分間回転させる。(5)スピンの後、いずれかのオプションA(図で表される)またはB.オプションA:50 mLチューブから上澄み物を捨て、ピペットの少年を使用して、PBSで40%(v/v)等張性パーコルの8 mLで各ペレットを再懸濁します。(6) (i) オプション A 続き: ピペットの少年を低速で使用し、40% パーコル溶液に再懸濁したペレットを 80% パーコール溶液の 5 mL に慎重にオーバーレイします。ピペットはゆっくりと、継続的に;45°の角度で15 mLチューブを保持します。(ii) オーバーレイを乱さずに、15 mLチューブを室温で20分間、中加速度とスローブレークで遠心します。(7)スピン後、最小量のパーコール溶液(最大4〜5 mL)を吸おうとしながら、白血球のリングを慎重に採取する。(8) 赤血球のリシス工程を行う。(9) トリパンブルーとノイバウアーチャンバーを使用してセルをカウントします。(10)丸底の96ウェルプレートにウェルあたり100万〜200万個の細胞を移す。(11)生き生き性染料及び抗体染色を進める。(12)最後に、サンプルをラベル付きFACSチューブに移します。24時間以内にFACS分析で処理するまで、氷の上または冷蔵庫にチューブを保管してください。BioRender.com で作成された画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:膣プラグ(A)と0.5日ポスト交配でC57BL / 6メスの(B)の不在。

図5:妊娠したマウスから子宮を抽出するための解剖(A)ダムは、70%エタノールで体を拭くために柔らかいボード上の針で固定されています。青い点線で示されるように、2つの垂直切開が行われます。(B)皮膚を持ち上げて内臓を露出する。腸管ループは、子宮を可視化するために穏やかに上に移動されます。(C)子宮は、卵巣の隣と子宮頸部の3つの点で切断することによって、それぞれ2つの青い点線と青い矢印によって示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:単細胞懸濁液の調製. (A)移植部位からの胚の機械的除去。(B) パーコールグラデーションオーバーレイ;上層はパーコールの40%の単一細胞懸濁液を含み、下層はパーコールの80%を含む。(C)パーコール勾配の遠心分離後リンパ球環形成。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7:グループ1のICを用いた機能アッセイの代表的なFACS分析。 自己MHC(Ly49C、Ly49I、およびNKG2A)に対するNK受容体を発現するグループ1ICにおける細胞内IFN-ɣおよび表面CD107a検出は、NK1.1をプレート結合抗体で架橋した後に比較した。細胞を妊娠9.5日目に子宮組織から単離した。組織消化は、リベレースDHを含む消化媒体を用いて行った。示されているのは、4つの象限(コーナー)の生の値と、自己受容体を持たない自己および応答者(太字)の受容体を発現する細胞間の応答者の相対的な割合である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:抗NKp46および抗NK1.1抗体を用いて脾臓および子宮リンパ球を染色する。 (A)マウス脾臓と(B)子宮から得られた細胞懸濁液を妊娠10.5日目に2回に分けた。一方はNKp46-APC(赤)で染色され、もう1つはNK1.1-APC(青)で染色されています。なお、子宮リンパ球のNKp46染色は、脾リンパ球のようにNKp46⁺ およびNKp46^- 細胞をきちんと分離しない。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図9:消化培地によるインキュベーションによるNKG2A MFI(抗体クローン:16A11)の減少。 C56BL/6マウス脾細胞の細胞懸濁液は3つの部分に分けた。1つの部分をリベラーDH消化培地(0.13 WU/mLリベラーゼDHと30μg/mLのDNAseを含むHBSS)でインキュベートし、別の部分をリベラーTM消化培地(0.52 WU/mLリベラーゼTMおよび30μg/mLのDNAseを含むHBSS)でインキュベートした。3部目は37°Cで30分間きちんとしたHBSSで処理した。 g1 IC上のNKG2Aマーカーの発現をフローサイトメトリーにより評価した。シュリーブNから取られたグラフ。妊娠中の子宮NK細胞阻害の役割(テシス);スーパーバイザー:コルッチF、2020。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図10:血液由来g1 ICの排除のための抗CD45抗体によるインビタル染色。妊娠8.5日目のC57BL/6ダムマウスは、CD45-AF647の3μgで静脈注射後3分カリングした。子宮、全血、胸腺を収穫し、FACS分析のために処理した。X軸はCD45-AF647による静脈内染色からの信号を示し、Y軸は インビトロ 染色CD45-BUV395からの信号を示す。サブ人口の割合は、象限で示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

	抗体 /染料	クローン	フルオロクロム	レーザー
1 (ダンプ チャネル)	ゾンビバイオレット固定可能な生き生き性染料			紫
	CD19	1D3	BV421
	CD3	145-2C11	BV421
2	CD45	30-F11	フィット	青い
3	NK1.1	PK136	BV605	紫
4	NKp46	29A1.4	APC	赤い
5	CD49a	Ha31/8	BUV395	紫外線
6	エオメエス	ダン11マグ	PE	緑

表1:従来の5レーザーサイトメーター用FACSパネルの例。

問題	考えられる原因	提案
セルリングは2つのパーコールソリューションのインターフェイスで見えない	サンプル処理中にパーコール溶液の層が悪いか、2つの層を混合する	オーバーレイ中に80%のパーコールクッションを壊さないよう、細心の注意を払ってください。サンプル処理時に注意を払う: パーコールインターフェイスを邪魔しないでください
	白血球の数が少ない(例えば、非妊娠子宮を使用する場合)	インターフェイスのセル番号が非常に低い場合でも、インターフェイスを見ることができます。リングが見えない場合でも、さらに処理するのに十分なセルが存在する可能性があるため、40%から80%のパーコール溶液で液体を収集する
不完全なRBCライシス	細胞は、ライジングバッファー内で適切に再懸濁されなかった	ピペット細胞を上下にして塊を分解し、細胞をライシングバッファで完全に再中断する
	溶解溶液は冷たい	使用前に溶解液を室温に平衡化
		溶解液で15分までインキュベーションの延長時間
		RBCのライシスステップを繰り返すことができる
低い細胞収量	酵素消化不良	酵素が最新ではなく、マニュアルに従って保存されているかどうかを確認してください
	洗浄工程中の細胞損失	各洗浄ステップの後に細胞ペレットを検査する:スピン後のウェルの底部の不透明ペレット。V-底板の代わりに U-底板、スイングローター遠心分離機を使用して、長い遠心分離時間は、細胞損失を減らします。
	組織サンプルには、リンパ球の数が少ない(例えば、非妊娠子宮を使用する場合)	複数のアプリケーションをプールして、分析に十分なイベントを取得します。セル分離のためのプロトコルのオプション B の使用を検討する
同グループのマウスから得られる絶対白血球数の高い変動性	40%および80%パーコール溶液のインターフェースでの細胞の不整合なコレクション	PERCollインターフェイスでセル全体の分数を収集してください。セル分離のためのプロトコルのオプション B の使用を検討する
一部の細胞表面マーカーでは、期待されるリンパ球亜集団/マーカーまたは異常に低いMFIを検出できない	酵素消化は、いくつかのエピトープの表面発現またはその分解に影響を与える	酵素(例えば、異なるタイプのリベラーゼまたはコラゲラーゼ)および/またはインキュベーションおよび/または酵素濃度の長さ、または変化によって酵素消化を最適化する
フローサイトメーターの高いバックグラウンドノイズ	細胞デブリまたはRBC汚染の高い割合	FSC しきい値パラメーターを調整します。セル分離のためのプロトコルのオプション A の使用を検討する

表 2: トラブルシューティング ガイド

ディスカッション

このメソッドには、以降に説明するいくつかの重要な手順が含まれています。最初の重要なステップは、白血球集団の相対的な頻度が妊娠を通じて変化するにつれて、複数の同期妊娠を得ることです。同じ妊娠日に複数のダムを有することで、同じ実験で生物学的反復を行うか、個々のダムからリンパ球をプールして下流の用途に必要な数を増やすことができます。時取り合いにより、研究者は24時間以内に概念を特定することができます。マウスは約2.5年生きるが、生後4~7週間から6~8ヶ月の間、生殖年齢となる。若いマウスは通常小さな子犬を産生するので、雌マウスは一般的に6〜8週間の間になるまで交尾せず、雄マウスは8〜10週の間になるまで交尾しない。発芽はマウスで約15時間続き、4〜5日ごとに起こることを考えると、典型的な交配速度(膣プラグで明らかにされた図 4を参照)は約25%である。したがって、マウスをエストラスで使用し、所定の実験に必要なダム数を得るのに十分な数を計画することが重要です。この経尿期は、膣スミア細胞診²²によって決定することができる。プラグレートは、交配前に男性48時間を休ませ、ウィッテン効果¹⁸を利用することによって改善することができます。あるいは、内因性卵胞刺激ホルモンの効果を模倣する妊娠中の馬血清を投与することができ、卵母細胞成熟を誘発し、42〜50時間後に、内因性黄体形成ホルモンの効果を模倣するヒト絨毛性ゴナドトロピンは、排卵を誘発する。このホルモン治療は、エストラスの要件をバイパスし、事実上すべての治療された女性を受容させます。

第2の重要なステップは、FACS染色の品質を確保することです。フローサイトメトリーで使用される抗体は、常に最適な濃度で滴定して使用する必要があり、酵素消化が重要な抗原エピトープを切断しないことを確認する必要があります。酵素がエピトープを切断するかどうかを評価するために、1つは同じサンプルの2つの部分を並行して染色し、1つは酵素的に、もう1つは機械的消化を受ける可能性があります。同様に、信頼性の高いデータを得るためには、適切なコントロールと単一の汚れの使用が重要です。まれなイベントでは、ビーズを使用して単一の染色サンプルを生成できます。電圧を設定するためにビーズを使用するのではなく、リンパ球や脾細胞などの他の白血球を含む細胞の集団を使用することをお勧めします。ビーズを使用する場合は、ビーズ染色用の抗体を適量化する必要があるため、染色されたビーズの蛍光強度は細胞の蛍光強度に匹敵します。特定のマーカーに対して負の細胞から正を分離することが困難な場合、FMOコントロールを使用して特定のマーカーの格座を容易にすることもできます。細胞内マーカーの場合、アイソタイプコントロールは、細胞内染色が残留非結合抗体をもたらし、洗浄工程後も細胞内に存在し、したがってバックグラウンドシグナルを増加させる可能性があるため、使用する必要があります。オート蛍光は時間の経過とともに大幅に増加し、一部の抗体の蛍光強度が時間の経過とともに低下する可能性があるため、FACS分析によって表現型で最良の結果を得るために、細胞を固定する24時間以内にサンプルを実行することをお勧めします。

考慮すべきもう一つの重要な要因は、プロトコルで得られた単一細胞懸濁液のダウンストリームアプリケーションです。機能アッセイの場合、滅菌状態で働く必要があります。同様に、その後のオミクス研究では、無菌およびRNase、DNaseおよびプロテアーゼフリーで働くことを重要である。

ここで紹介するプロトコルは、フェノタイピンググループ1のICに焦点を当てていますが、抗体パネルを改変することで他の細胞タイプのフェノタイピングに適応することができます。酵素処理による表面エピトープの損失/変化を検出するために、すべての抗体を消化および非消化細胞懸濁液に対して試験することが推奨されます。同様に、組織を消化して細胞収量を増加させるために異なる酵素を使用することができますが、重要な抗原エピトープに対するその効果は慎重に検討する必要があります。NKp46は脾臓NK細胞のマーカーであり、実験室用マウスのすべての株で働きますが、C57BL/ 6マウスのuNK細胞に対するNKp46の発現は脾臓NK細胞よりもかなり低いです。NK1.1とNKp46の両方を同時に染色するのが最適です。複数の臓器を直接比較する場合、脾臓や骨髄などの組織に酵素消化が必要ない場合でも、すべてのサンプルを均等に扱うことをお勧めします。ここで示す方法は非妊娠子宮に適用可能であるが、2相Percoll勾配によるリンパ球環の単離は困難であり、単離された細胞の収率は信頼性の高いFACS分析には低すぎる可能性があるため、個々の非妊娠マウス²³の子宮から分離された細胞を一緒にプールする必要がある。

データの解釈に考慮すべきプロトコルには制限があります。すべての組織の場合と同様に、血液から来る循環リンパ球は、組織居住細胞と一緒に単離される。循環リンパ球の排除がデータ解釈に不可欠である場合、循環細胞を標識するために生体内染色を行うことができる。さらに、プロトコルの第2の制限は、組織から抽出され得る細胞の一部が全ての細胞を抽出できるわけではないので失われるということである。最も一般的な問題とそのトラブルシューティングは 、表 2 に示されています。

歴史的に、組織における細胞の研究は、組織切片の組織学的検査に依存してきた。サンドラ・ピールの優れた^{レビュー24} は、80年代後半まで100年以上にわたって行われた作業を要約しています。後にuNK細胞として知られる細胞の記述は、リンパ球が発見される前に半世紀以上前に出版された原稿に実際に現れます。そこで、1975年にNK細胞が発見される前に、uNK細胞は母体グリコーゲン細胞または顆粒状心房腺細胞として示されてきました。アン・クロイは、フィールド²⁵ で大きな貢献をし、親切に彼女が最適化した解剖をチームに教えました³、そしてそれは現在使用されています。uNK細胞の形態や組織位置を記述するのに役立ちますが、古典的な組織学的検査は、対象細胞上のほんの数個のマーカーの検出に限定されます。2008年、子宮リンパ球上の複数のマーカーを同時に検出するフローサイトメトリーベースの方法が²⁶に記載された。これは、基本的に、このペーパーで説明されている方法です。質量サイトメトリーによる空間転写学やイメージングなどの最近の技術は、組織学とフローサイトメトリーの力を兼ね備え、複数の遺伝子またはタンパク質の同時検出と正常組織アーキテクチャの保存の両方を可能にします。

ここで説明する方法の用途は、複数であり、FACS表現型、機能アッセイ(ELISPOT、脱顆粒または細胞傷害アッセイなど)、細胞のソート、および後続のトランスクリプトミクスまたはプロテオミクスが含まれる。この方法に基づいて開発できるさらなる応用として、負の枯渇による細胞選別または濃縮後のデシデュアルNK細胞の培養と拡張が挙げられる。現在、マウスuNK細胞を培養および拡張し、その生存率と機能を長期間保持するプロトコルはなく、IL-2またはIL-12とIL-15の組み合わせを添加して7-14日間培養および拡張することができるヒトNK細胞と同様の方法で培養および機能性を維持する。このようなマウスuNK細胞の最適化は、機能アッセイを実行する際により柔軟性を提供し、より高い細胞数で複数の条件をテストすることを可能にするであろう。一方、培養条件は、リンパ球の独特の表現型を改変し、その機能も変える可能性もある。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm cell strainers	Falcon	352350
BSA	Sigma	A9647-100G
CD19 antibody	BD	562701
CD3 antibody	BD	562600
CD45 antibody	BioLegend	103108
CD49a antibody	BD	740262
DNase I	Roche (Sigma)	10104159001
EOMES antibody	eBioscience	12-4875-82
Fc block Trustain fcx	BioLegend	101320
Fetal Bovine Serum	Gibco	10217-106
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)	BD	554714
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Liberase DH	Roche (Sigma)	5401089001
Lysis buffer Pharmlyse	BD	555899
NK1.1 antibody	BioLegend	108739
NKp46  antibody	BioLegend	137608
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free)	Agar Scientific	AGR1026
PBS 10x	Gibco	14030-048
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+)	Thermo Scientific	14190144
Percoll	VWR international	17-0891-01
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pre-Separation filters	Miltenyi	130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAX	Gibco	61870-010
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Scientific	15575020
Zombie Violet Fixable Viability dye	BioLegend	423113