Isolamento delle cellule linfoidi innate uterine per l'analisi mediante citometria a flusso

Riepilogo

Questo è un metodo per isolare le cellule linfoidi uterine da topi sia gravidi che non gravidi. Questo metodo può essere utilizzato per molteplici applicazioni a valle come la fenotipizzazione FACS, lo smistamento cellulare, i saggi funzionali, l'RNA-seq e la proteomica. Il protocollo qui dimostra come fenotipizzare le cellule linfoidi innate uterine del gruppo 1 mediante citometria a flusso.

Abstract

Qui è descritto un metodo semplice per isolare e fenotipo le cellule linfoidi innate uterine del gruppo 1 di topo (g1 uILC) dal singolo utero gravido mediante citometria a flusso. Il protocollo descrive come impostare l'accoppiamento temporale per ottenere più dighe sincrone, la digestione meccanica ed enzimatica dell'utero gravido, la colorazione delle sospensioni monocellulari e una strategia FACS per fenotipo e discriminare gli uILC g1. Sebbene questo metodo perda inevitabilmente l'informazione spaziale della distribuzione cellulare all'interno del tessuto, il protocollo è stato applicato con successo per determinare l'eterogeneità uILC, la loro risposta ai fattori materni e fetali che influenzano la gravidanza, il loro profilo di espressione genica e le loro funzioni.

Introduzione

Descritto qui è un metodo semplice per ottenere un alto rendimento di linfociti innati uterini da singolo utero in gravidanza. Questo metodo preserva l'espressione della superficie proteica e la funzionalità dei linfociti innati uterini ed è adatto per applicazioni successive come fenotipizzazione FACS, RNAseq, proteomica o saggi funzionali. Qui, l'attenzione si concentra sulla fenotipizzazione delle uILC del gruppo 1 mediante citometria a flusso.

L'utero è composto da tre strati: l'endometrio, il miometrio e il perimetrio (Figura 1). L'endometrio è la mucosa, che riveste il lume dell'utero. Il progesterone, prodotto dal corpo luteo, converte l'endometrio in decidua. Il miometrio è composto da due strati di muscolatura liscia che compongono la parete uterina. Il perimetrio è la sierosa che avvolge l'utero e lo collega al peritoneo attraverso l'ampio legamento chiamato mesometrio. In una sezione trasversale dell'utero, la parte opposta al lume è chiamata lato mesometriale, mentre la parte vicina al lume è chiamata lato anti-mesometriale. Una varietà di leucociti materni popolano l'endometrio e la decidua, compresi diversi tipi di cellule, dove le cellule immunitarie innate rappresentano la stragrande maggioranza delle cellule. Le cellule linfoidi innate (ILC), i macrofagi, le cellule dendritiche (DC), così come i linfociti T CD4⁺ e CD8⁺, le cellule T regolatorie (Tregs) e le cellule B rare possono svolgere un ruolo importante nella regolazione dell'ambiente uterino durante la ^{gravidanza1,2}. Gli ILC nell'utero si trovano non solo nella mucosa, ma anche nel miometrio nei topi. Compresi tutti e tre i gruppi di ILC, l'utero è infatti l'organo più densamente popolato da ILC di gruppo 1. Con la trasformazione strutturale dei tessuti uterini durante la gestazione, cambiano anche il numero e la proporzione dei leucociti uterini (vedere figura 2A per un esempio di variazioni nella percentuale dei sottoinsiemi uILC del gruppo 1)^3,4.

Quando si fa riferimento ai topi in questo articolo, si intende il ceppo C57BL / 6 di topi da laboratorio inbred. I topi di razza (ad esempio, i topi NMRI) sono spesso utilizzati nella ricerca riproduttiva a causa del loro alto tasso riproduttivo. Tuttavia, l'uso di ceppi inbred è necessario per generare risultati coerenti e il background genetico preferito dell'immunologo è C57BL / 6, noto anche come B6.

Circa il 30% dei leucociti uterini nelle madri B6 a metà gestazione sono g1 uILC, che sono definite dalla citometria a flusso come cellule CD45^{+CD3-CD19-NK1.1+}NKp46⁺ vitali (Figura 2B): NK pro-angiogenico residente nei tessuti (trNK), NK convenzionale produttore di IFN-g (cNK) e uILC14,5. La percentuale di cellule uNK è ancora più alta negli esseri umani, raggiungendo circa il 70% nel primo ^trimestre6. Ci sono più somiglianze che differenze tra uNK umano e topo e ^uILC7,8. Sebbene sia importante tenere a mente le differenze, è utile integrare le informazioni disponibili sulle due specie. Quando si combinano le informazioni ottenute dallo studio dell'uILC negli esseri umani e nei roditori di laboratorio, è chiaro che le cellule NK aiutano nei cambiamenti omeostatici essenziali per la biologia dell'utero, compreso il mantenimento dell'integrità arteriosa9 e il rimodellamento dell'arteria a ^spirale10, così come l'invasione del trofoblasto11,12. Svolgono anche ruoli specifici nella difesa contro gli agenti ^{patogeni13,14}. Nei topi e nei ratti, oltre a riempire la decidua intorno al sito di impianto, le cellule NK si accumulano tra i due strati muscolari del miometrio delle dighe in una struttura transitoria nota come aggregato linfoide mesometriale della gravidanza (MLAp)¹⁵ (Figura 1B), nota anche in passato come ghiandola metriale, la cui funzione è ancora da scoprire.

Qui è descritto un protocollo dettagliato del metodo utilizzato in laboratorio per isolare i linfociti dall'utero di topi gravidi utilizzando una combinazione di disaggregazione meccanica e digestione enzimatica. Poiché l'intero utero viene utilizzato nel metodo, i linfociti isolati dall'utero durante la gestazione sono una miscela di cellule deciduali e miometriali. È possibile un'ulteriore dissezione della decidua dalla parete uterina e dal suo MLAp, ed è stata descritta ^prima16. Il metodo qui descritto è stato sviluppato per ottenere linfociti uterini preservando l'espressione della superficie proteica, la funzionalità cellulare e la vitalità. Il risultato è una sospensione monocellulare con detriti cellulari residui minimi e una resa tipicamente compresa tra 1 e 5 milioni di cellule a metà gestazione (10,5 giorni) per un utero in gravidanza. Le applicazioni di questo metodo comprendono la fenotipizzazione mediante citometria a flusso, l'ordinamento cellulare per successivi studi trascrittomici o proteomici, studi funzionali come la produzione intracellulare di citochine, la degranulazione, ELISPOT o saggi citotossici. Il protocollo qui presentato si concentra sull'identificazione delle ILC di gruppo 1, ma può essere adattato ad altri tipi di cellule come altre ILC, cellule T, cellule B, DC o macrofagi con piccole modifiche del pannello anticorpale utilizzato per l'analisi FACS. Il protocollo può anche essere utilizzato per isolare le cellule da altri tessuti e per gli uteri non gravidi in pool.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo documento sono stati condotti secondo l'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 sotto PP2363781 emesso dal Ministero degli Interni del Regno Unito. Il protocollo seguente è costituito da diverse sezioni che iniziano dall'allevamento dei topi e terminano con la colorazione per l'analisi FACS. La Figura 3 riflette i passaggi principali del protocollo. I materiali utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Allevamento generale dei topi, accoppiamento e dissezione

1. Tenere topi femmina di 7-14 settimane in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) e alloggiati in gruppo (in genere 4-6 femmine in base alle dimensioni della gabbia e al peso dell'animale), per 10-14 giorni per innescare l'effetto Lee-Boot, che si traduce in sincronizzazione ^dell'estro17.
2. Mantenere i maschi in condizioni di SPF, alloggiati singolarmente e riposati per almeno 48 ore tra ogni accoppiamento (tempo per la rigenerazione degli spermatozoi). È preferibile utilizzare maschi di 3-4 mesi di età comprovata in quanto sono in genere più performanti rispetto ai giovani.
3. Per aumentare la probabilità che le femmine rimangano incinte, introdurre letti sporchi dalla gabbia di un maschio nella gabbia femminile 3 giorni prima dell'accoppiamento. Ciò innesca l'effetto ^Whitten18 dall'esposizione ai feromoni delle urine maschili e si traduce in estro sincronizzato e una maggiore ricettività per l'accoppiamento.
4. Il giorno 0 (D0), impostare i topi per l'accoppiamento usando uno stallone maschio per due femmine; considerare un tasso di spina di circa il 20% -25%.
   NOTA: l'accoppiamento avverrà probabilmente di notte poiché i topi sono animali notturni.
5. Al mattino successivo all'accoppiamento (D0.5), verificare la presenza di un tappo vaginale, che è un indicatore di copulazione (Figura 4). Il tappo vaginale è un aggregato dell'eiaculato maschile e in genere persiste fino a 8-24 ore dopo l'accoppiamento. Controlla le spine la mattina presto.
6. Consolida le femmine collegate in una nuova gabbia e assegnale. Riporta i maschi alle loro gabbie per riposare.
7. A D9,5 o 10,5 dopo l'accoppiamento, preparare 5 tubi da 5 ml con 1 mL di HBSS sterile 1x (con ^Mg2+ e ^Ca2+) per la raccolta dei tessuti e metterli sul ghiaccio.
8. Procedere all'eutanasia animale per lussazione cervicale, seguita da dissanguamento per confermare la morte.
9. Lavorare in un ambiente sterile se l'applicazione a valle lo richiede. Subito dopo l'eutanasia, pulire il corpo del topo con etanolo al 70% e procedere alla dissezione sotto un armadio a flusso laminare con strumenti sterili.
10. Sezionare l'utero gravido privo di grasso mesometriale (Figura 5) e posizionare l'intero utero in un tubo da 5 ml preparato e opportunamente etichettato. Tenere i tubi sul ghiaccio.

2. Digestione meccanica ed enzimatica dell'utero

1. Per preparare la soluzione di digestione enzimatica, mescolare 3 mL per utero di HBSS sterile 1x con 30 μg/mL di DNAse e 0,1 unità Wünsch (WU)/mL di Liberase DH o 0,52 WU/mL di Liberase TM. Mettere la soluzione a bagnomaria a 37 °C.
   NOTA: è possibile utilizzare sia Liberase TM che Liberase DH. La scelta dell'uno rispetto all'altro deve essere guidata dal loro potenziale effetto sugli epitopi riconosciuti dagli anticorpi utilizzati per la successiva analisi citometrica a flusso.
   ATTENZIONE: Se si utilizzano enzimi liofilizzati, lavorare sotto il cofano.
2. Preparare 20 mL di EDTA da 5 mM in PBS (no ^Ca2+/^Mg2+). Porre metà della soluzione a 37 °C a bagnomaria e l'altra metà sul ghiaccio.
3. Sotto un armadietto di flusso laminare, rimuovere delicatamente il grasso che circonda l'utero gravido con strumenti sterili in una capsula di Petri sterile. Non lasciare asciugare il tessuto.
4. Sezionare ogni sito di impianto con strumenti sterili per rimuovere i feti (struttura traslucida a forma di cavalluccio marino, lunga circa 1 mm) (Figura 6A). Scartare i feti.
5. Riportare l'utero alla loro raccolta originale tubo da 5 ml e tritare il tessuto usando le forbici direttamente nel tubo da 5 ml e nel mezzo di raccolta. Tenere i tubi sul ghiaccio tutto il tempo tra le procedure.
6. Posizionare i tubi da 5 ml contenenti il tessuto tritato a bagnomaria a 37 °C.
7. Aggiungere 3 mL di miscela di digestione enzimatica calda a ciascun campione in modo che il volume totale di liquido nel tubo sia di 4 mL (1 mL di mezzo di raccolta con l'utero tritato e 3 mL di soluzione di digestione enzimatica). Incubare i tubi da 5 ml per 30 minuti a 37 °C con agitazione per migliorare l'attività di digestione enzimatica.
8. Ruotare i tubi da 5 ml e metterli sul ghiaccio per inibire l'azione degli enzimi. Quindi, successivamente, trasferire il contenuto in tubi centrifughi da 15 mL opportunamente etichettati.
9. Sciacquare tutto dai tubi da 5 mL nei tubi della centrifuga da 15 mL utilizzando 10 mL di soluzione EDTA PBS da 5 mM ghiacciata.
10. Centrifugare i tubi della centrifuga da 15 mL contenenti i tessuti digeriti per 10 minuti a 400 x g.
11. Scartare il surnatante, far scorrere delicatamente il pellet e quindi risospenderlo in 10 ml di soluzione calda (37 °C) 5 mM EDTA PBS.
12. Incubare i campioni nelle provette della centrifuga da 15 mL a 37 °C con agitazione per 15 minuti per rimuovere il mezzo di digestione residuo e ridurre l'aggregazione cellulare.
13. Vortice i campioni in alto per 10 s per facilitare ulteriormente la dissociazione dei tessuti.

3. Elaborazione dell'utero in una sospensione a singola cellula

1. Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 1 mL, forzare il tessuto digerito attraverso un filtro da 70 μm su un tubo centrifugo da 50 mL correttamente etichettato e sterile per rimuovere i grumi cellulari e il tessuto non dissociato.
2. Lavare il colino più volte con un totale di 10 ml di PBS freddo per raccogliere tutte le cellule.
3. Ruotare il tubo della centrifuga da 50 mL per 10 minuti a 400 x g.
   NOTA: Eseguire i passaggi successivi utilizzando l'opzione A o l'opzione B. L'opzione A consente un migliore arricchimento dei linfociti con meno detriti e contaminazione delle cellule stromali rispetto all'opzione B. Tuttavia, l'opzione B offre una maggiore resa delle cellule immunitarie a causa della minore perdita di cellule e della minore variabilità della resa cellulare tra i campioni. L'opzione B è anche più facile da eseguire tecnicamente. Pertanto, a seconda delle preferenze, procedere con l'opzione A o l'opzione B.
   1. I passaggi per l'opzione A sono i seguenti.
      1. Etichettare una provetta centrifuga sterile da 15 mL per campione contenente 5 mL di Percoll isotonico all'80% (v/v) diluito in PBS.
      2. Dopo la rotazione, scartare il surnatante dal tubo della centrifuga da 50 ml. Utilizzare un pipetto boy per risospescere ogni pellet in 8 mL di Percoll isotonico al 40% (v / v) in PBS.
      3. Utilizzare un pipet boy a bassa velocità per sovrapporre accuratamente il pellet risospeso nella soluzione percoll al 40% sulla soluzione percoll all'80%. Pipetta lentamente e continuamente; tenere il tubo da 15 ml con un angolo di 45° (Figura 6B).
      4. Senza disturbare la sovrapposizione, centrifugare i tubi della centrifuga da 15 mL per 20 min a 850 x g, a temperatura ambiente (accelerazione media e rottura minima).
      5. Rimuovere con attenzione i tubi dalla centrifuga senza disturbare gli strati di Percoll (Figura 6C).
      6. Senza disturbare l'anello dei leucociti all'interfaccia delle due soluzioni di Percoll, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per scartare tutti tranne circa 0,5-1 ml dello strato superiore di Percoll.
      7. Mentre si cerca di aspirare una quantità minima di soluzione di Percoll (fino a 4-5 ml totali), raccogliere con cura l'anello dei leucociti e trasferire le cellule in un nuovo tubo centrifugo da 15 mL etichettato.
      8. Riempire ogni campione con 10 ml di mezzo sterile RMPI-1640 integrato con il 10% di FBS inattivato dal calore.
      9. Centrifuga per 5 min a 500 x g a 4 °C.
      10. Scartare il surnatante e procedere alla lisi dei globuli rossi.
   2. I passaggi per l'opzione B sono i seguenti.
      1. Etichettare una provetta centrifuga sterile da 15 ml per campione.
      2. Dopo la rotazione, scartare il surnatante dal tubo della centrifuga da 50 ml. Utilizzare un pipetto boy per risospesciare ogni pellet con 8 mL di Percoll isotonico al 35% (v /v) in mezzo RPMI-1640.
      3. Trasferire i campioni in tubi da 15 mL per centrifughe.
      4. Centrifugare i campioni a 940 x g per 10 minuti a temperatura ambiente con accelerazione media e pausa minima.
      5. Aspirare accuratamente il surnatante usando un aspiratore o un ragazzo pipetta (non invertendo il tubo).
      6. Sospendere il pellet in 14 mL di mezzo RPMI-1640 integrato con FBS inattivato termicamente al 10% e quindi centrifugare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
      7. Scartare il surnatante per aspirazione e procedere alla lisi dei globuli rossi.

4.Lisi dei globuli rossi

1. Per lisare i globuli rossi, risospesare i campioni in 3 mL di 1 soluzione lisante RBC e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 10 ml di PBS nei campioni per fermare la reazione.
3. Centrifugare i tubi a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Aggiungere 10 ml di PBS e ripetere il passaggio 4.3.
5. Sospendere ogni pellet in 1 mL di mezzo RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS inattivato dal calore.
6. Passare i campioni attraverso filtri cellulari sterili da 70 μm.
7. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando il tripano blu e una camera Neubauer secondo le istruzioni del produttore.
8. Regolare la concentrazione della sospensione cellulare a 1-2 milioni di cellule in 100 μL di PBS o mezzo.

5. Strategia e controlli di progettazione del pannello

NOTA: Il pannello descritto in questo documento è adatto per la discriminazione delle celle uILC1, trNK e cNK ed è stato progettato per essere utilizzato su un BD LSRFortessa a 5 laser. Piccole modifiche possono essere fatte per studiare diverse popolazioni cellulari e utilizzare fluorocromi alternativi. Si raccomanda di verificare la configurazione dello strumento, utilizzando anticorpi titolati per una separazione ottimale, consultando l'indice di luminosità del produttore e utilizzando i coloranti più brillanti per antigeni a bassa espressione come NKp46 e seguendo le linee guida ^generali19. Si consiglia di includere un controllo Fluorescence Minus One (FMO) per NKp46.

6. Colorazione delle cellule linfoidi innate per la fenotipizzazione FACS

1. Trasferire 1-2 milioni di celle per pozzo in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti.
2. Ruotare la piastra a 400 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante facendolo scorrere in un lavandino.
3. Sostituire i pellet cellulari in 100 μL di PBS (senza proteine e azide) utilizzando una pipetta multicanale.
   NOTA: Assicurarsi che il PBS non contenga azide di sodio, Tris o proteine per il passaggio successivo.
4. Ripetere il passaggio 6.2.
5. Cellule risospese in 50 μL di colorante di vitalità fissabile diluito in PBS (senza proteine e azide) (1:1.000). Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
   NOTA: Assicurarsi che il PBS non contenga azide di sodio, Tris o proteine come FBS o BSA in quanto ciò potrebbe comportare una diminuzione dell'intensità di colorazione delle cellule morte e/ o una maggiore colorazione di fondo per le cellule vive.
   ATTENZIONE: Se il colorante di vitalità è in polvere, utilizzare sotto il cofano.
6. Aggiungere 150 μL di PBS, risospescere le celle con una pipetta multicanale e quindi ripetere il passaggio 6.2.
7. Risospesare le cellule in 25 μL di tampone FACS (PBS integrato con 1% BSA o 2% FBS) contenente reagente bloccante il recettore Fc. Incubare le cellule per 5 minuti a 4 °C.
8. Aggiungere 25 μL di un cocktail di anticorpi di superficie.
   NOTA: Titolare sempre gli anticorpi e ottimizzare il pannello anticorpale prima dell'esperimento.
9. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
10. Aggiungere 150 μL di buffer FACS a ciascun pozzetto, mescolare accuratamente e quindi ripetere il passaggio 6.2.
11. Ripetere il passaggio 6.10.
    NOTA: eseguire ulteriori passaggi utilizzando l'opzione A o l'opzione B. Utilizzare l'opzione A per colorare le celle con marcatori di superficie. Utilizzare l'opzione B per studiare i marcatori intracellulari mediante citometria a flusso.
    1. I passaggi per l'opzione A sono i seguenti.
       1. Sospendere i campioni in 100 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) per pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
          ATTENZIONE: Utilizzare PFA sotto il cofano. Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza per scartare i rifiuti/oggetti pfanici che sono venuti a contatto con PFA (ad esempio, pipette) in modo sicuro.
       2. Ripetere il passaggio 6.2, due volte.
          ATTENZIONE: non scartare scorrendo nel lavandino qui in quanto contiene PFA. Aspirare con una pipetta ed eliminare i rifiuti come da scheda di sicurezza.
       3. Risospesare i campioni in 200 μL di PBS.
       4. Trasferire i campioni in provette FACS etichettate e rabboccare con 100 μL di PBS. Conservare i tubi sul ghiaccio o in frigorifero fino alla lavorazione con analisi FACS. Acquisire i campioni su un citometro a flusso entro 24 ore.
    2. I passaggi per l'opzione B sono i seguenti.
       1. Sospendere i campioni in 100 μL di soluzione di fissazione/permeabilizzazione per pozzetto (contenente paraformaldeide) e incubare per 20 min a 4 °C.
          ATTENZIONE: Utilizzare PFA sotto il cofano. Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza per scartare i rifiuti/oggetti pfanici che sono venuti a contatto con PFA (ad esempio, pipette) in modo sicuro.
       2. Ripetere il passaggio 6.2.
          ATTENZIONE: non scartare scorrendo nel lavandino qui in quanto contiene PFA. Aspirare con una pipetta ed eliminare i rifiuti come da scheda di sicurezza.
       3. Aggiungere 200 μL di 1x tampone di permeabilizzazione / lavaggio, mescolare bene e quindi ripetere il passaggio 6.2.
       4. Ripetere il passaggio 6.11.2.3.
       5. Risospendare le cellule fisse e permeabilizzate in 50 μL di 1x tampone di permeabilizzazione/lavaggio contenente anticorpi miscela per la colorazione intracellulare.
       6. Incubare i campioni a 4 °C per 30 minuti al buio.
       7. Aggiungere 200 μL di 1x permeabilizzazione / soluzione di lavaggio, mescolare bene e quindi ripetere il passaggio 6.2.
       8. Ripetere il passaggio 6.11.2.7.
       9. Risospesare i campioni in 200 μL di PBS.
       10. Trasferire i campioni in provette FACS etichettate e rabboccare con 100 μL di PBS. Conservare i tubi sul ghiaccio o in frigorifero fino alla lavorazione con analisi FACS. Acquisire i campioni su un citometro a flusso entro 24 ore.
           NOTA: dopo aver eseguito questo protocollo, la sospensione cellulare deciduale è pronta per l'analisi FACS. Si consiglia di registrare il maggior numero possibile di eventi per campione; almeno 1.000-3.000 eventi di una popolazione parentale devono essere ottenuti per ottenere risultati affidabili.

Risultati

I passaggi principali del metodo descritti per ottenere una sospensione a singola cellula di leucociti uterini sono riassunti nella Figura 3. Nella Figura 2B sono dimostrate la strategia di gating FACS di base utilizzata per l'identificazione di tre sottoinsiemi di ILC g1 in topi B6: cellule uILC1 (CD49a⁺Eomes^-), trNK (CD49a⁺Eomes⁺) e cNK (CD49a-Eomes⁺). Ulteriori analisi di queste popolazioni possono essere eseguite per studiare vari marcatori superficiali e intracellulari di ilC g1. Ad esempio, la co-espressione dei recettori IFN-ɣ e self-MHC può essere valutata nelle cellule uILC1, trNK e cNK dopo la stimolazione con anticorpi anti-NK1.1 (Figura 7).

A seconda della domanda di ricerca, sia il protocollo (Figura 3) che il pannello anticorpale possono essere adattati. È importante sottolineare che si raccomanda di utilizzare sia gli anticorpi anti-NK1.1 che anti-NKp46 in un pannello FACS per g1 ILC gating (Figura 2B e Tabella 1). Va notato che le ILC g1 ottenute da sangue, milza o fegato hanno una maggiore espressione di NKp46 sulla loro superficie rispetto alla controparte uterina (Figura 8). La colorazione superficiale per NK1.1 offre una migliore separazione e consente di gated facilmente le ILC g1 uterine (Figura 8). Mentre NKp46 è espresso da tutti i ceppi di topo, l'antigene NKR-P1C riconosciuto dall'anticorpo anti-NK1.1 PK136 è espresso solo da alcuni ceppi di topo, tra cui C57BL/6 (cioè B6), FVB/N e NZB, ma non in AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL o 129. Inoltre, se il ricercatore intende studiare recettori cruciali delle cellule NK come i recettori MHC Ly49, è importante essere consapevoli delle variazioni alleliche nei ceppi di topo di laboratorio, che ricapitolano l'elevata variabilità dei recettori umani simili alle immunoglobuline a cellule killer (KIR). Inoltre, se le cellule devono essere stimolate con NK1.1 per un test funzionale, come descritto in Kim, S. et ^al.20, potrebbe essere desiderabile colorare le cellule con anti-NKp46 piuttosto che anti-NK1.1, poiché l'antigene NKR-P1C può essere occupato dalla reticolazione anti-NK1.1 o una downregulation del recettore può seguire la stimolazione. L'occupazione del recettore o la downregulation possono impedire la colorazione con lo stesso anticorpo usato per stimolare.

Un problema comune con la dissociazione tissutale enzimatica è l'alterazione degli epitopi superficiali sulle cellule da parte di enzimi utilizzati per un mezzo di digestione. Ad esempio, la colorazione per il recettore MHC CD94:NKG2A è scarsa se si utilizza Liberase TM. Tuttavia, la digestione con Liberase DH preserva il riconoscimento NKG2A da parte del clone di anticorpi 16A11 (Figura 9). Si raccomanda di controllare l'influenza degli enzimi su tutti gli epitopi nel proprio pannello FACS. A tale scopo, utilizzare la sospensione di splenociti di topo ottenuti per dissociazione meccanica (passando l'intera milza attraverso un filtro da 70 μm). Il campione viene quindi diviso in due o più parti seguite da incubazione con un mezzo con o senza enzima(i).

Come accennato in precedenza, le cellule derivate dal sangue sono presenti nei campioni dissociati di tessuto. Se necessario, i contaminanti del sangue possono essere esclusi utilizzando un metodo di colorazione intravascolare sviluppato nel laboratorio ^Masopust21. La Figura 10 dimostra che circa il 6,5% delle ILC g1 presenti nei campioni di tessuto uterino al giorno di gestazione 8,5 sono derivate dal sangue. Gli anticorpi anti-CD45 utilizzati per la colorazione intravascolare possono essere coniugati con un fluorocromo utilizzato per un canale di scarico; questo escluderà i contaminanti del sangue senza utilizzare un canale di fluorescenza extra. I problemi più comuni e le loro soluzioni sono presentati nella Tabella 2.

Figura 1: Sezione trasversale di un utero di topo. (A) Sezione trasversale dell'utero di topo (non gravida) che indica una varietà di leucociti materni che popolano l'utero. (B) Sezione trasversale dell'utero di topo (giorno di gestazione 8.5). (C) Sezione trasversale dell'utero del topo (giorno di gestazione 13.5). (D) Confronto tra la formazione di placenta tra topo e uomo dallo stadio di blastocisti in poi. Immagini create con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sottopopolazioni di g1 ILC1 uterino. (A) Percentuali di cNK uterino, ILC1 e trNK nei topi durante la prima infanzia e la gravidanza. W - settimane, gd - giorno di gestazione. Grafico modificato da Filipovic, I. et ^al.4. (B) Strategia di Gating per analizzare i sottoinsiemi ILC del gruppo uterino 1 mediante citometria a flusso. I linfociti sono stati isolati dai tessuti uterini al giorno di gestazione 10.5. La digestione dei tessuti è stata eseguita utilizzando un mezzo di digestione contenente Liberase TM. Le cellule sono state chiuse in base alla loro capacità di disperdere la luce. I doppietti sono stati esclusi utilizzando un grafico FSC-A rispetto a FSC-H e solo le cellule vitali CD45 ^{+ CD3-CD19 sono} state analizzate ulteriormente. All'interno delle cellule CD45⁺CD3-CD19-vitali, la porta ILC di gruppo 1 è stata identificata ^{come cellule} NK1.1⁺ NKp46+. All'interno delle ILC del gruppo 1, possono essere identificati tre sottoinsiemi: cellule NK convenzionali CD49a-Eomes⁺ (cNK), cellule NK cd49a⁺Eomes⁺ residenti nei tessuti (trNK) e CD49a⁺Eomes^- uILC1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Una guida visiva per i passaggi principali del protocollo. (1) Sezionare l'utero gravido privo di grasso mesometriale. (2) Rimuovere i feti; riportare l'utero al tubo da 5 ml e tritare il tessuto. Procedere con la fase di digestione enzimatica: aggiungere 3 ml di miscela di digestione enzimatica calda a ciascun campione. Incubare i tubi da 5 mL per 30 minuti a 37 °C con agitazione. (3) (i) Dopo la digestione, sciacquare tutto da 5 tubi mL in tubi da 15 mL utilizzando 10 mL di soluzione EDTA PBS da 5 mM ghiacciata. (ii) Centrifugare tubi da 15 mL contenenti tessuti digeriti per 10 minuti a 400 x g. (iii) Scartare il surnatante; scorrere delicatamente il pellet e risospenderlo in 10 mL di soluzione calda (37 °C) 5 mM EDTA PBS. iv) Incubare campioni nelle provette da 15 mL a 37 °C con agitazione, per 15 min. (4) Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 1 mL, forzare il tessuto digerito attraverso un colino da 70 μm su un tubo da 50 mL opportunamente etichettato e sterile e ruotare per 10 minuti a 400 x g. (5) Dopo la rotazione, procedere con l'opzione A (qui rappresentata nei diagrammi) o B. Opzione A: scartare il surnatante dal tubo da 50 ml e, usando un pipet boy, risospesciare ogni pellet in 8 mL del 40% (v/v) isotonico Percoll in PBS. (6) (i) L'opzione A è continuata: utilizzando un pipet boy a bassa velocità, sovrapporre accuratamente il pellet risospeso in soluzione di Percoll al 40% sui 5 ml di soluzione di Percoll all'80%. Pipetta lentamente e continuamente; tenere il tubo da 15 ml con un angolo di 45°. (ii) Senza disturbare la sovrapposizione, centrifugare i tubi da 15 ml a 850 x g per 20 minuti a temperatura ambiente, con accelerazione media e rottura lenta. (7) Dopo la rotazione, mentre si cerca di succhiare una quantità minima di soluzione di Percoll (fino a 4-5 ml totali), raccogliere con cura l'anello dei leucociti. (8) Eseguire le fasi di lisi dei globuli rossi. (9) Conta la cella usando il tripano blu e una camera neubauer. (10) Trasferire 1-2 milioni di cellule per pozzo in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti. (11) Procedere con la colorazione del colorante di vitalità e degli anticorpi. (12) Infine, trasferire i campioni in provette FACS etichettate. Conservare i tubi su ghiaccio o in frigorifero fino alla lavorazione con analisi FACS entro 24 ore. Immagini create con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Tappo vaginale (A) e assenza di esso (B) nelle femmine C57BL/6 a 0,5 giorni dopo l'accoppiamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Dissezione per estrarre l'utero da un topo gravido. (A) La diga viene bloccata con aghi su una tavola morbida per pulire il corpo con il 70% di etanolo. Vengono praticate due incisioni verticali, come indicato dalle linee tratteggiate blu. (B) La pelle viene sollevata per esporre gli organi interni. Le anse intestinali vengono delicatamente spostate verso l'alto per visualizzare l'utero. (C) L'utero viene campionato tagliando in tre punti: vicino alle ovaie e alla cervice, come indicato rispettivamente dalle due linee tratteggiate blu e dalla freccia blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Preparazione della sospensione unicellulare. (A) Rimozione meccanica degli embrioni dal loro sito di impianto. B) sovrapposizione del gradiente di Percoll; lo strato superiore contiene la sospensione monocellulare nel 40% di Percoll e lo strato inferiore nell'80% di Percoll. (C) Formazione dell'anello linfocitario dopo centrifugazione del gradiente percoll. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Analisi FACS rappresentativa del saggio funzionale con ILC di gruppo 1. Rilevamento intracellulare di IFN-ɣ e CD107a di superficie in ILC di gruppo 1 che esprimono recettori NK per auto-MHC (Ly49C, Ly49I e NKG2A) rispetto a quelli che non lo fanno, dopo la reticolazione NK1.1 con anticorpi legati alla piastra. Le cellule sono state isolate dai tessuti uterini al giorno di gestazione 9.5. La digestione dei tessuti è stata eseguita utilizzando un mezzo di digestione contenente Liberase DH. Sono mostrati i valori grezzi di tutti e quattro i quadranti (angoli) e la percentuale relativa di responder tra le cellule che esprimono recettori per se stessi e i responder che non hanno auto-recettori (numeri in grassetto). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Colorazione dei linfociti splenici e uterini con anticorpi anti-NKp46 e anti-NK1.1. (A) Le sospensioni cellulari ottenute dalla milza di topo e dall'utero (B) al giorno di gestazione 10,5 sono state separate in due; una parte è stata macchiata con NKp46-APC (rosso) e l'altra con NK1.1-APC (blu). Si noti che la colorazione NKp46 dei linfociti uterini non separa le cellule NKp46⁺ e NKp46^- in modo ordinato come i linfociti splenici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Diminuzione dell'MFI NKG2A (clone anticorpale: 16A11) mediante incubazione con mezzo di digestione. La sospensione cellulare degli splenociti di topo C56BL/6 è stata divisa in tre parti. Una parte è stata incubata nel mezzo di digestione Liberase DH (HBSS contenente 0,13 WU/mL Liberase DH e 30 μg/mL di DNAse), e un'altra parte è stata incubata con il mezzo di digestione Liberase TM (HBSS contenente 0,52 WU/mL Liberase TM e 30 μg/mL di DNAse). La terza parte è stata trattata con HBSS pulito per 30 minuti a 37 °C. L'espressione del marcatore NKG2A sulle ILC g1 è stata valutata mediante citometria a flusso. Grafico tratto da Shreeve N. Il ruolo dell'inibizione delle cellule NK uterine in gravidanza (Tesi); Relatore: Colucci F, 2020. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Colorazione intravitale con anticorpi anti-CD45 per l'esclusione di ILC g1 derivate dal sangue. Un topo diga C57BL/6 al giorno di gestazione 8.5 è stato abbattuto 3 minuti dopo l'iniezione endovenosa con 3 μg di CD45-AF647. L'utero, il sangue intero e il timo sono stati raccolti ed elaborati per l'analisi FACS. L'asse X mostra il segnale della colorazione endovenosa con CD45-AF647 e l'asse Y mostra il segnale da CD45-BUV395 colorato in vitro . Le percentuali di sottopopolazioni sono mostrate in quadranti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Anticorpo / Colorante	Clone	Fluorocromo	Laser
1 (canale dump)	Zombie Violet Fixable Vitalability colorante			Viola
	CD19 ·	1D3 ·	BV421 ·
	CD3 ·	145-2C11 ·	BV421 ·
2	CD45 ·	30-F11	FITC ·	Blu
3	NK1,1	PK136 ·	BV605 ·	Viola
4	NKp46 ·	29A1,4	APC	Rosso
5	CD49a ·	Ha31/8 ·	BUV395 ·	Ultravioletto
6	EOMES	Dan11mag	PE	Verde

Tabella 1: Un esempio di pannello FACS per citometro convenzionale a 5 laser.

Problema	Possibile causa	Suggerimento
L'anello cellulare non è visibile all'interfaccia di due soluzioni percoll	Scarsa stratificazione della soluzione di percoll o miscelazione di due strati durante la manipolazione del campione	Prestare particolare attenzione a non rompere il cuscino percoll all'80% durante la sovrapposizione. Prestare attenzione durante la gestione del campione: non disturbare l'interfaccia percoll
	Basso numero di leucociti (ad esempio, quando si utilizza un utero non gravido)	L'interfaccia può essere vista anche quando il numero di cella sull'interfaccia è molto basso. Anche se l'anello non è visibile, raccogliere il liquido tra il 40% e l'80% di soluzioni percoll, poiché potrebbero esserci ancora abbastanza celle per un'ulteriore elaborazione
Lisi RBC incompleta	Le celle non sono state risospese correttamente nel buffer di lisi	Pipettare le celle su e giù per rompere i grumi e risospese completamente le celle nel tampone di lisi
	La soluzione di lisatura è fredda	Equilibrare la soluzione lisante a temperatura ambiente prima dell'uso
		Prolungare il tempo di incubazione con la soluzione di lisi fino a 15 minuti
		La fase di lisi RBC può essere ripetuta
Bassa resa cellulare	Scarsa digestione enzimatica	Controlla se gli enzimi non sono obsoleti e sono stati conservati secondo i loro manuali
	Perdita di cellule durante le fasi di lavaggio	Ispezionare il pellet cellulare dopo ogni fase di lavaggio: il pellet opaco sul fondo del pozzo dopo la centrifuga. L'utilizzo di piastre con fondo a V invece di piastre con fondo a U, centrifuga a rotore oscillante, tempi di centrifugazione più lunghi possono ridurre la perdita di celle
	Il campione di tessuto contiene un basso numero di linfociti (ad esempio, quando si utilizza un utero non gravido)	Raggruppare diversi uteri per ottenere abbastanza eventi per l'analisi. Considerare l'utilizzo dell'opzione B del protocollo per l'isolamento cellulare
Elevata variabilità del numero assoluto di leucociti ottenuto da topi dello stesso gruppo	Raccolta incoerente di celle all'interfaccia di soluzioni percoll al 40% e all'80%	Assicurati di raccogliere l'intera frazione cellulare sull'interfaccia percoll. Considerare l'utilizzo dell'opzione B del protocollo per l'isolamento cellulare
Non in grado di rilevare sottopopolazioni/marcatori linfocitari attesi o MFI insolitamente basso per alcuni marcatori di superficie cellulare	La digestione enzimatica influenza l'espressione superficiale di alcuni epitopi o la loro degradazione	Ottimizzare la digestione enzimatica modificando: enzima (ad es. a diverso tipo di liberasi o collagenasi) e/o durata dell'incubazione e/o concentrazione enzimatica
Elevato rumore di fondo nel citometro a flusso	Alta percentuale di detriti cellulari o contaminazione da globuli rossi	Regolare il parametro di soglia FSC. Considerare l'utilizzo dell'opzione A del protocollo per l'isolamento cellulare

Tabella 2: Guida alla risoluzione dei problemi.

Discussione

Il metodo contiene diversi passaggi critici discussi di seguito. Il primo passo critico è quello di ottenere gravidanze sincrone multiple man mano che la frequenza relativa delle popolazioni di leucociti cambia durante la gravidanza. Avere più dighe nello stesso giorno gestazionale consente di ripetere biologicamente negli stessi esperimenti o di raggruppare i linfociti da singole dighe per ottenere numeri maggiori richiesti per le applicazioni a valle. L'accoppiamento temporizzato consente al ricercatore di individuare il concepimento entro un periodo di 24 ore. Sebbene i topi vivano per circa 2,5 anni, saranno in età riproduttiva da 4-7 settimane fino a 6-8 mesi. Poiché i topi più giovani di solito producono cuccioli più piccoli, i topi femmina non sono generalmente accoppiati fino a quando non sono tra 6-8 settimane e i topi maschi fino a quando non sono tra 8-10 settimane. Dato che l'estro dura circa 15 ore nei topi e si verifica ogni 4-5 giorni, il tasso di accoppiamento tipico (rivelato da un tappo vaginale, vedi Figura 4) è di circa il 25%. È quindi importante utilizzare topi in estro e pianificare numeri sufficienti per ottenere il numero richiesto di dighe per un determinato esperimento. La fase del ciclo di estro può essere determinata dalla citologia dello striscio ^vaginale22. La velocità della spina può essere migliorata riposando i maschi 48 ore prima dell'accoppiamento e sfruttando l'effetto ^Whitten18. In alternativa, si può somministrare siero di cavalla in gravidanza, che imita l'effetto dell'ormone follicolo-stimolante endogeno, inducendo la maturazione degli ovociti e, 42-50 ore dopo, la gonadotropina corionica umana, che imita l'effetto dell'ormone luteinizzante endogeno, inducendo l'ovulazione. Questo trattamento ormonale bypassa il fabbisogno di estro e rende ricettive praticamente tutte le femmine trattate.

Un secondo passo fondamentale è garantire la qualità della colorazione FACS. Gli anticorpi utilizzati nella citometria a flusso devono essere sempre titolati e utilizzati alla concentrazione ottimale, ed è necessario verificare che la digestione enzimatica non scinde epitopi antigenici cruciali. Per valutare se un enzima fende un epitopo, si potrebbero macchiare due frazioni dello stesso campione in parallelo, una sottoposta a digestione enzimatica e l'altra a digestione meccanica. Allo stesso modo, l'uso di controlli appropriati e di singole macchie è fondamentale per ottenere dati affidabili. Per eventi rari, le perline possono essere utilizzate per generare campioni di macchie singole. Si raccomanda di non utilizzare perline per impostare tensioni, ma piuttosto una popolazione di cellule contenenti linfociti e altri leucociti, come gli splenociti. Se vengono utilizzate perline, è necessario titolare gli anticorpi per la colorazione delle perline, quindi l'intensità di fluorescenza delle perle colorate sarà paragonabile all'intensità di fluorescenza delle cellule. In caso di difficoltà a separare le cellule positive da quelle negative per un particolare marcatore, un controllo FMO può anche essere utilizzato per facilitare il gating per un marcatore specifico. Nel caso di marcatori intracellulari, deve essere utilizzato un controllo isotipico in quanto la colorazione intracellulare potrebbe provocare anticorpi residui non legati, che possono essere ancora presenti all'interno delle cellule dopo le fasi di lavaggio e quindi aumentare il segnale di fondo. Si raccomanda di eseguire i campioni entro 24 ore dal fissaggio delle cellule per ottenere i migliori risultati nella fenotipizzazione mediante analisi FACS, poiché l'autofluorescenza aumenta significativamente nel tempo e l'intensità di fluorescenza di alcuni anticorpi potrebbe diminuire nel tempo.

Un altro fattore cruciale da considerare è l'applicazione a valle della sospensione monocellulare ottenuta con il protocollo. Per i saggi funzionali, è essenziale lavorare in condizioni sterili. Allo stesso modo, per i successivi studi omici, è importante lavorare in sterile e RNasi, DNasi e proteasi-free.

Il protocollo qui presentato si concentra sulla fenotipizzazione del gruppo 1 ILC, ma può essere adattato per la fenotipizzazione di altri tipi di cellule modificando il pannello anticorpale. Si raccomanda che tutti gli anticorpi siano testati contro la sospensione cellulare digerita e non digerita per rilevare la perdita/alterazione degli epitopi superficiali mediante il trattamento enzimatico. Allo stesso modo, diversi enzimi possono essere utilizzati per digerire il tessuto e aumentare la resa cellulare, ma il suo effetto sugli epitopi antigenici cruciali deve essere attentamente studiato. Mentre NKp46 è un buon marcatore per le cellule NK spleniche e funziona in tutti i ceppi di topi di laboratorio, l'espressione di NKp46 sulle cellule uNK nei topi C57BL/6 è considerevolmente inferiore rispetto alle cellule NK della milza. È meglio macchiare sia per NK1.1 che per NKp46 contemporaneamente. Se più organi devono essere confrontati direttamente, si raccomanda di trattare tutti i campioni allo stesso modo, anche se la digestione enzimatica non è richiesta per tessuti come la milza o il midollo osseo. Sebbene il metodo qui presentato sia applicabile all'utero non gravido, l'isolamento dell'anello linfocitario mediante un gradiente di Percoll a due fasi sarà impegnativo e la resa delle cellule isolate potrebbe essere troppo bassa per un'analisi FACS affidabile e quindi richiederà il raggruppamento di cellule isolate dall'utero di singoli topi non ^gravidi23.

Ci sono limitazioni al protocollo da considerare per l'interpretazione dei dati. Come nel caso di tutti i tessuti, i linfociti circolanti provenienti dal sangue saranno isolati insieme alle cellule residenti nei tessuti. Se l'esclusione dei linfociti circolanti è essenziale per l'interpretazione dei dati, la colorazione intravitale può essere eseguita per etichettare le cellule circolanti. Inoltre, una seconda limitazione al protocollo è che alcune cellule andranno perse in quanto non tutte le cellule possono essere estratte dal tessuto. I problemi più comuni e la relativa risoluzione dei problemi sono presentati nella Tabella 2.

Storicamente, lo studio delle cellule nei tessuti si è basato sull'esame istologico delle sezioni tissutali. L'eccellente recensione di Sandra ^Peel24 riassume il lavoro svolto in più di 100 anni fino alla fine degli anni '80. Le descrizioni di cellule in seguito conosciute come cellule uNK appaiono infatti in manoscritti pubblicati più di mezzo secolo prima che i linfociti fossero scoperti. Quindi, prima della scoperta delle cellule NK nel 1975, e le cellule uNK sono state indicate come cellule del glicogeno materno o cellule della ghiandola metriale granulata. Anne Croy ha dato importanti contributi sul ^campo25 e ha gentilmente insegnato al team la dissezione che aveva ^ottimizzato3, e che è attualmente utilizzata. Sebbene sia strumentale nel descrivere la morfologia e la posizione tissutale delle cellule uNK, l'esame istologico classico è limitato alla rilevazione di pochi marcatori sulle cellule di interesse. Nel 2008 è stato descritto un metodo basato sulla citometria a flusso per rilevare simultaneamente più marcatori sui linfociti ^uterini26. Questo è essenzialmente il metodo che è stato descritto in questo articolo. Tecnologie più recenti come la trascrittomica spaziale e l'imaging mediante citometria di massa combinano la potenza dell'istologia e della citometria a flusso, consentendo sia il rilevamento simultaneo di più geni o proteine, rispettivamente, sia la conservazione della normale architettura tissutale.

Le applicazioni del metodo qui descritto sono molteplici e includono la fenotipizzazione FACS, il saggio funzionale (come ELISPOT, la degranulazione o i saggi citotossici), lo smistamento cellulare e la successiva trascrittomica o proteomica. Ulteriori applicazioni che potrebbero essere sviluppate sulla base di questo metodo includono la coltura e l'espansione di cellule NK deciduali dopo la selezione cellulare o l'arricchimento mediante esaurimento negativo. Attualmente, non esiste un protocollo per coltivare ed espandere le cellule uNK di topo e preservarne la vitalità e la funzionalità per un periodo prolungato, in modo simile alle cellule NK umane che possono essere coltivate ed espanse per 7-14 giorni con l'aggiunta di IL-2 o una combinazione DI IL-12 e IL-15. L'ottimizzazione di un tale metodo per le cellule uNK del topo fornirebbe una maggiore flessibilità durante l'esecuzione di saggi funzionali e consentirebbe di testare più condizioni con un numero di celle più elevato. D'altra parte, le condizioni di coltura sono note per modificare il fenotipo unico dei linfociti e potenzialmente anche la loro funzione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
70 µm cell strainers	Falcon	352350
BSA	Sigma	A9647-100G
CD19 antibody	BD	562701
CD3 antibody	BD	562600
CD45 antibody	BioLegend	103108
CD49a antibody	BD	740262
DNase I	Roche (Sigma)	10104159001
EOMES antibody	eBioscience	12-4875-82
Fc block Trustain fcx	BioLegend	101320
Fetal Bovine Serum	Gibco	10217-106
Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit)	BD	554714
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Liberase DH	Roche (Sigma)	5401089001
Lysis buffer Pharmlyse	BD	555899
NK1.1 antibody	BioLegend	108739
NKp46  antibody	BioLegend	137608
Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free)	Agar Scientific	AGR1026
PBS 10x	Gibco	14030-048
PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+)	Thermo Scientific	14190144
Percoll	VWR international	17-0891-01
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK
Pre-Separation filters	Miltenyi	130-095-823
RMPI-1640 medium + GlutaMAX	Gibco	61870-010
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Scientific	15575020
Zombie Violet Fixable Viability dye	BioLegend	423113