ヒト腫瘍細胞及び異種マウスにおけるマクロピノサイトシスにより媒介されるATP内在化のための蛍光顕微鏡

要約

ATPサロゲートである非加水分解蛍光アデノシン三リン酸(ATP)の高い細胞分解能を可視化する再現性のある方法を開発しました。我々は、ヒト腫瘍組織を用いて異種移植されたヒト腫瘍細胞株および免疫不全マウスを用いて、イン ビトロ および インビボ内 独立のアッセイを用いて我々の方法を検証した。

要約

アデノシン三リン酸(ATP)は、細胞外ATP(eATP)を含む、薬剤耐性、上皮間葉転移(EMT)、転移などの腫瘍形成の様々な側面において重要な役割を果たすることが示されている。腫瘍内eATPは、通常組織よりも濃度が^{10 3〜10}倍高い。eATPはEMT誘導のための純粋なシグナル伝達を活性化するメッセンジャーとして機能する一方で、特定のタイプのエンドサイトーシスである上方制御されたマクロピノサイトーシスを通じて癌細胞によって内在化され、多種多様な生物学的機能を実行する。これらの機能には、ATPを必要とする生化学反応にエネルギーを提供すること、シグナル伝達中にリン酸基を寄付すること、転写補因子としての遺伝子発現の促進または加速が含まれる。ATPは容易に利用でき、癌および他の分野での研究は間違いなく増加するだろう。しかし、eATPの研究は初期段階にとどまっており、eATPと内部化された細胞内ATPが行う重要で汎用性の高い活動が完全に解明される前に、未解決の質問は未回答のままです。

これらの著者の研究者のこれらの初期のeATP研究への貢献は、非加水分解蛍光ATPの顕微鏡イメージング、マクロピノサイトーシスおよびエンドサイトーシストレーサーとして機能する高分子および低分子蛍光デックストランス、ならびにeATP化プロセスを監視し、特徴付けるために様々なエンドサイトーシス阻害剤を含む。このイメージングモダリティは、腫瘍細胞株及び免疫不全マウスに適用され、ヒト癌腫瘍を用いて異種移植し、 インビトロ 及び インビボでeATP内在化を研究した。本論文では、マクロピノサイトーシス/エンドサイトーシスを介したeATP内在化アッセイを異なるシステムで正常に実行できるようにアッセイ条件の修正と微調整を重視した、イン ビトロ および インビボ プロトコルについて説明する。

概要

腫瘍外細胞外(すなわち)栄養素の日和見摂取は、最近、癌代謝の重要な特徴と命名された^1.これらの重要な栄養素の1つはATPであり、ieATPの濃度は正常組織に見られるものよりも¹⁰³および10^倍高く、数百μM〜低mM2、3、4、5の範囲である。重要なエネルギーとシグナル伝達分子として、ATPは癌性および健康な細胞^6、7、8における細胞代謝において中心的な役割^を果たす。細胞外ATPは癌細胞増殖に関与するだけでなく、薬剤耐性を促進する^9.最近、ATPの認識されていない機能は、最近同定されており、アルツハイマー病¹⁰などの疾患にATPが関与する。確かに、がん細胞、健康な細胞、その他の病気の細胞におけるATPとその機能に関する私たちの理解は決して完全ではありません。しかし、細胞の不安定性と高い回転率のために、細胞膜を横....

プロトコル

ここに報告されたすべての手順は、オハイオ大学のIACUCおよびNIHに従って行われた。

1. 非加水分解性蛍光ATP(NHF-ATP)およびデックストランスの選択

1. 蛍光ホスホア結合NHF-ATP(図1A)およびエンドサイトシストレーサー、高分子蛍光デックストランス(TMR-HMWFDおよびTMR-LMWFD)(図1B))を選択し、適切なフィルタを搭載した発光波長(例えば、適切なフィルタを搭載したイメージングシステム)および特定のエンドサイトシスプロセスを選択する。

2. ATPローカリゼーション研究,インビトロ(図2)

図2: IN Vitro

結果

インビトロ 研究
NHF-ATPの細胞内内内イントラニゼーションは、HMWFDまたはLMWFDとのNHF-ATPの共局化によって実証された(図4)。この手順の成功は、主に、NHF-ATPおよびデクストランスの適切な濃度の使用とデクストランス(ポリリジン対中性)の適切なタイプを決定することに依存する。例えば、マクロピノサイトーシスを調査するために、HMWF.......

ディスカッション

非加水分解性ATPの細胞内在化の空間的、時間的、定量的な分析のために開発された方法。この方法は、様々な腫瘍形成モデルを含む多様な生物学的システムでの使用に広く適用され、技術的な指示および代表的なデータを提供しています。 in vivo ATPの内在化研究(プロトコルのセクション4)の間に解釈可能なデータを取得するには、腫瘍内デキストラン注射からクライオ埋め込みに経過?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A549 cells, human lung epithelial, carcinoma	National Cancer Institute	n/a	Less expensive source
Acetone	Fisher Scientific	S25904
Aluminum foil, Reynolds	Grainger	6CHG6
Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent	ThermoFisher	P36930
ATP analog	Jena Biosciences	NK-101
Autoclave, sterilizer	Grainger	33ZZ40
Blades, cryostat, high profile	C. L. Sturkey, Inc.	DT554550
Calipers, vernier	Grainger	4KU77
Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free	Millipore Sigma	51651C-1000ML
Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor	Eppendorf	5810R
Chloroform	Acros Organics	423555000
Conical tube, 15 mL	VWR	21008-216
Conical tube, 50 mL	VWR	21008-242
Coverslips, glass, 12 mm	Corning	2975-245
Cryostat, Leica CM1950	Leica Biosystems	CM1950
Delicate task wipe, Kim Wipes	Kimberly-Clark	34155
Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW)	Invitrogen	D1818	MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)	Invitrogen	D1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free	Fisher Scientific	11885076
Dry ice	Local delivery	Custom order
Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software	Nikon	Custom order
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
Forceps, Dumont #7, curved	Fine Science Tools	11274-20
Forceps, Dumont #5, straight	Fine Science Tools	11254-20
Gloves (small, medium, large)	Microflex	N191, N192, N193
Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice)	Fisher Scientific	19-046-563
Hemocytometer	Daigger	EF16034F EA
Incubator, cell culture	Eppendorf	Galaxy 170 S
Labelling tape	Fisher Scientific	159015R
Marking pen, Sharpie (ultra-fine)	Staples	642736
Mice, immunodeficient (Nu/J)	Jackson Laboratory	2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17	Fisher Scientific	13-100-675
Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)	Axygen	MCT-150-C
Microscope slide box	Fisher Scientific	50-751-4983
Needle, 27 gauge	Becton-Dickinson	752 0071
Paintbrush	Grainger	39AL12
Paper towels	Staples	33550
Paraformaldehyde	Acros Organics	416785000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6162
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3991
Pipet tips (10 μL)	Fisher Scientific	02-707-438
Pipet tips (200 μL)	Fisher Scientific	02-707-411
Pipet tips (1000 μL)	Fisher Scientific	02-707-403
Pipets, serological (10 mL)	VWR	89130-910
Pippetor, Gilson P2	Daigger	EF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL)	Daigger	EF9931A
Platform shaker - orbital, benchtop	Cole-Parmer	EW-51710-23
Positively-charged microscope slides, Superfrost	Fisher Scientific	12-550-15
Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc.	Fisher Scientific	22-079-707
Scissors, surgical - sharp, curved	Fine Science Tools	14005-12
Software for image analysis, Nikon Elements	Nikon	Custom order
Software for image analysis, ImageJ (FIJI)	National Institutes of Health	n/a	Download online (free)
Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory	Leica Biosystems	14047740044
Staining tray, 245 mm BioAssay Dish	Corning	431111
Syringe, 1 cc	Becton-Dickinson	309623
Tape, laboratory, 19 mm width	Fisher Scientific	15-901-5R
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter	Fisher Scientific	08-757-100D
Tissue culture flask, 225 cm2	ThermoFisher	159933
Tissue culture plate, 24-well	Becton-Dickinson	353226
Tissue embedding mold, stainless steel	Tissue Tek	4161
Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT)	Fisher Scientific	4585
Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25%	Gibco	25200072
Water bath, Precision GP 2S	ThermoFisher	TSGP2S