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要約

本プロトコルは、単一のペレットリーチツー把握タスクにおいて、高速ビデオ撮影と組み合わせた無線光遺伝学を使用して、自由に動くマウスにおける熟練した運動行動の性能に関与する神経回路を特徴付ける方法を記述している。

要約

細かい運動能力は日常生活に不可欠であり、いくつかの神経系障害で損なわれる可能性があります。これらのタスクの獲得とパフォーマンスには、感覚運動の統合が必要であり、両側の脳回路の正確な制御が必要です。動物モデルに単手作業の行動パラダイムを実装することで、タスクの実行中に制御条件や疾患における特定の核の神経活動の操作と記録を可能にするため、線条体のような脳構造が複雑な運動行動に寄与することの理解が向上します。

その創設以来、光遺伝学は、ニューロン集団の選択的および標的を絞った活性化または阻害を可能にすることによって、脳を尋問するための支配的なツールであった。光遺伝学と行動アッセイの組み合わせは、特定の脳機能の根底にあるメカニズムに光を当てます。小型化された発光ダイオード(LED)を備えたワイヤレスヘッドマウントシステムは、完全に自由に動く動物の遠隔光遺伝学的制御を可能にします。これにより、有線システムの制限が回避され、発光効率を損なうことなく動物の行動に対する制限が軽減されます。現在のプロトコルは、ワイヤレス光遺伝学的アプローチと高速ビデオ撮影を単手作業の器用さで組み合わせ、特定のニューロン集団の細かい運動行動への寄与を解剖する。

概要

運動熟練行動は、私たちが行うほとんどの運動中に存在し、いくつかの脳障害1、2、3、4、5、6に罹患することが知られている。熟練した運動の発達、学習、および性能を研究することを可能にするタスクを実装することは、特に脳損傷、神経変性および神経発達障害のモデルにおいて、運動機能の神経生物学的基盤を理解するために不可欠である2,7,8,9,10,11,12,13 .物体に手を伸ばして取り出すことは、日常生活の行動において日常的に行われ、それは初期の発達の間に獲得され、その後何年もの間5,6を通して洗練される最初の運動能力の1つです。それは、物体の特徴の知覚、運動計画、行動選択、運動実行、身体協調、および速度変調7、14、15、16などの感覚運動プロセスを必要とする複雑な挙動を含む。したがって、単手による高器用なタスクは、両半球16、17、18、19、20、21、22の多くの脳構造の参加を必要とする。マウスにおいて、単一のペレットリーチ・ツー・把持タスクは、別々に制御および分析することができるいくつかの相について特徴付けられる7、13、23。この特徴は、獲得および行動性能の異なる段階における特定のニューロン亜集団の寄与を研究することを可能にし、運動系の詳細な研究のためのプラットフォームを提供する13、23、24。動きは数秒で起こります。したがって、高速ビデオ撮影は、熟練した運動軌道7,25の別個の段階における運動学的解析に使用されるべきである。ビデオから、身体の姿勢、軌道、速度、およびエラーの種類を含むいくつかのパラメータを抽出することができる25。キネマティック解析は、無線光遺伝学的操作中の微妙な変化を検出するために使用することができる7,23。

小型化された発光ダイオード(LED)を使用してワイヤレスヘッドマウントシステムを介して光を送達することで、動物が作業を実行している間にリモートで光遺伝学的制御を行うことができます。無線光遺伝学的コントローラは、刺激器からのシングルパルスまたは連続トリガコマンドを受け入れ、小型化されたLED23、26に接続された受信機に赤外線(IR)信号を送信する。現在のプロトコルは、この無線光遺伝学的アプローチを器用なタスクの高速ビデオ撮影と組み合わせて、微細な運動行動の実行中に特定のニューロン集団の役割を解剖する23。これは単手作業であるため、両方の半球における構造の参加を評価することができます。伝統的に、脳は非常に非対称的な方法で身体の動きを制御します。しかし、器用性の高いタスクは、同側核および核内のニューロン亜集団の差次的寄与を含む多くの脳構造からの慎重な調整および制御を必要とする10、20、21、22、23。このプロトコルは、両半球からの皮質下構造が前肢23の軌道を制御することを示している。このパラダイムは、他の脳領域および脳疾患のモデルを研究するのに適している可能性がある。

プロトコル

動物の使用を含む手順は、地域および国のガイドラインに従って実施され、対応する機関動物ケアおよび使用委員会(細胞生理学研究所IACUCプロトコルVLH151-19)によって承認された。C57BL/6バックグラウンドを有する生後27、35〜40日目のDrd1−Creトランスジェニック雄マウスを、現在のプロトコールにおいて使用した。マウスを以下の条件で飼育した:温度22±1°C;湿度55%;ライトスケジュール12/12時間、午後7時に消灯し、出生後21日目に離乳した。離乳した子犬は、2〜5人の同性グループに収容された。動物は、マイクロバリアトップを有する静的ハウジングに収容された。寝具は滅菌アスペン削りくずで構成されていました。げっ歯類ペレットおよびRO精製水は、特記の場合を除き、 自由摂取で提供した。

1. 外科的処置

  1. 目的の構造の背側腹部座標に従って所望の長さのLEDカニューレを準備する(理想的には頭蓋骨の厚さを考慮するために0.5mm長く、背外線条体については3.5mm)。
    1. ガラス繊維を最終的な所望のサイズよりも長い長さに切断し、粗いサンドペーパーで繊維先端を目標長さまで粉砕し、最後に繊維先端を細かいサンドペーパーで磨く。
      注:LEDカニューレは、赤外線受信機に取り付けられた直径250μmのガラス光ファイバです( 材料表を参照)。
  2. ナノインジェクター用のガラスピペット(外径1.14mm、内径0.53mm、長さ3.5)を水平プラーで引っ張り( 材料表を参照)、後のために保管します。プーラーを1つのループにプログラムして、長い緩やかなスロープテーパ(4-5 mm)で15〜20μmの先端直径を取得します。
  3. 定位装置、フード、マイクロインジェクター( 材料表を参照)、および周囲の表面を70%エタノールで徹底的に消毒して、手術領域を準備します。
    注:マウス定位装置は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を正確に注入し、LEDカニューレを関心領域に配置するために不可欠です。
  4. 清潔な白衣または使い捨ての手術用ガウン、滅菌手袋、フェイスマスク、使い捨てヘッドキャップなど、手順に適した個人用保護具を着用してください。
  5. 滅菌手術器具、綿の先端、溶液、マイクロピペット、ピペットチップ、毛細血管、鉱物油によるマイクロフィル、マーカーなど、必要な機器を手術領域の近くに置きます。
  6. マイクロインジェクション用のピペットに鉱物油を充填し、マイクロインジェクターに入れます。マイクロインジェクターが鉱物油を排出して正しく動作していることを確認します。
    注:手術中に使用するすべての器具は、オートクレーブ処理および滅菌する必要があります。無菌技術を使用する必要があります。
  7. ガス状のイソフルランで動物を麻酔して麻酔を誘発し、0.5-1 L /分の純酸素で手術中に1.2%麻酔します。手術は、動物が深い麻酔のポイントに達した後にのみ始まり、わずかなピンチの後に足の離脱がないことによって評価される。
    1. 動物の呼吸数と体温を継続的に監視します。34°Cに設定した加熱パッドにより体温を維持します。
  8. 眼科用軟膏を塗布する。トリマーと脱毛クリームで頭皮から脱毛。8%のポビドン - ヨウ素( 材料表を参照)と70%のエタノールをそれぞれ3回交互に含む綿棒で頭皮を拭きます。
  9. マウスを定位装置に入れ、頭部を固定し、頭蓋骨が中側軸および前後軸に水平になるようにする。
  10. 矢状軸に沿った目のレベルで頭皮を通してメスで1cmの切開を行います。皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させ、綿棒で骨膜をきれいにします。
  11. 生理食塩水と滅菌綿棒で頭蓋表面をきれいにしてください。滅菌吸収性眼槍(材料表を参照)または同様の滅菌吸収材料を使用して、表面 の出血を解決します。
  12. 綿棒で2.5%過酸化水素を1滴塗り、頭蓋骨の縫合糸を目に見えるようにし、より良い基準を得るために数秒間作用させます。数秒後、きれいな綿棒で徹底的に拭きます。
  13. ガラスピペット(最終先端径15μm)で、ブレグマとラムダを見つけて、頭蓋骨が前後軸に水平になっていることを確認します。
    注:ガラスピペットの先端を見るために実体顕微鏡またはUSB顕微鏡を使用することをお勧めします。必要な場合は、マウスホルダーの高さを調整して頭蓋骨を水平にします。
  14. 毛細血管を、選択した前後(AP)および内側 - 側方(ML)座標(背側線条体AP 1.2mm、ML 2.28mm)に向かって移動させる。選択した座標の上にある頭皮の基準点を滅菌マーカーでペイントします。
  15. 基準点では、滅菌回転工具または小型の丸い歯科用ドリルビットを用いて低速から中速で頭蓋骨に穏やかな圧力を加えて直径約1mmの開頭術を行う( 材料表を参照)。
  16. 毛細血管に、チャネルロドプシンを発現させるAAV1-dflox-hChR-2-mCherryなどの300~400nLのCre依存性アデノ随伴ウイルス(AAV)を負荷するか、またはAAVを目的の領域の対照としてレポータータンパク質(例えばmCherry)のみを発現させる( 材料表を参照)。先端が目詰まりしていないことを確認し、ガラスピペットを所望の背腹側(DV)座標(背側線条体DV -3.35mm)で脳に導入する。
    1. 自動インジェクターで200nLを23nL/sの速度で注入します。注射終了後10分間待ってから、こぼれないようにガラスピペットをゆっくりと引き抜いてください。
      注:30G針を使用して、適切なマイクロインジェクターで注射することが可能です。
  17. 綿棒で残留物をきれいにして乾かしてください。
  18. 滅菌ガラスLEDカニューレを定位アームに取り付け、ブレグマを基準として座標を校正します。組織の損傷を避けるためにカニューレを非常にゆっくりと(300μm/分)挿入し、注射部位の100μm上に置きます。
  19. LEDカニューレが所定の位置に収まったら、開頭術の縁に一滴(100μL)の組織接着剤を加える。
  20. 製造元の指示に従って歯科用セメント混合物( 材料表を参照)を準備し、繊維を頭蓋骨に固定します。
    注:簡単に言えば、セメントセットの前により多くの作業時間を持つために冷蔵磁器皿を使用してください。磁器皿に樹脂透明粉末2スクープを加え、クイックベース4滴と触媒1滴を加え、よく混ぜる。粉末/液体比は、より薄いまたはより厚い粘度が必要な場合に調整することができる。
  21. 滅菌ブラシを使用して、カニューレコネクタの周りに歯科用セメント混合物を少しずつ塗布し、頭蓋骨が覆われてコネクタが頭蓋骨にしっかりと取り付けられ、ピンが完全に自由になるまで層を構築します。マウスの皮膚に歯科用セメントを塗らないでください。
  22. 完全に乾燥させる。
  23. 組織接着剤を使用してインプラントの周りの皮膚を閉じます( 材料表を参照)。
  24. マウスを33°Cの加熱パッドの上の回復ケージに置き、痛み/不快感の1つ以上の兆候があるかどうかを監視します:1)ハンチアップ、運動活動の欠如または低下、2)手入れされていない汚れたコートに反映されたグルーミングの失敗、3)過度の舐めや引っ掻き傷、切開部位の赤み、 4)攻撃的な行動、5)食欲不振または脱水、および6)巣形成の欠如。
    メモ:インプラントの取り外しを避けるため、すべての手順の間、マウスを個別にケージに入れたままにしておいてください。カニューレが剥離した場合は、ペントバルビタールナトリウム150mg/kgを注射して安楽死を行い、深麻酔に達した後に断頭する。
  25. 皮下注射 (SC) メロキシカム 1 mg / kg 1日1回、術後3日間、鎮痛を提供します.
  26. さらなる手順の前に、完全な回復のために少なくとも7日間、オプシン発現のために14日間待ってください。
    注:術後フォローアップを12時間ごとに3日間行い、実験終了時に安楽死の日まで毎日動物をチェックします。

2. リーチ・トゥ・グリップ・トレーニング

  1. 術後7日目に、食物剥奪プロトコル28を開始する。マウスを3日間連続して秤量し、それらの平均自由摂取体重を求めた。次に、動物が体重の約90%以上85%以上を維持するのに十分な栄養素を受け取るように、食物制限をスケジュールします。
    注:これは、毎日2.5〜3gの食物を提供することによって達成される。動物の体重を毎日監視し、動物の行動や外観(コートや目の外観など)を観察して全体的な幸福度をスコアリングします。参考文献29の身体状態スコアリングシステムを使用してください。
  2. 事前トレーニング、トレーニング、およびテスト期間中、各マウスに、標準的な食物ペレットの他に、毎日20ペレット(ダストレスチョコレート風味ペレット20mg)( 材料表を参照)(作業中または後に食べる)を投与する。
  3. 馴化の3日前に、0.4 g /動物/日20 mgのダストレスチョコレート風味ペレットを自宅のケージに散布して、マウスがリーチツー把握作業中に報酬として役立つペレットを知るようにします。
  4. マウスを、予備訓練の1日前に試験チャンバーに10分間入れ、チャンバー床にペレットを散らばらせて馴化させます(図1A)。
  5. トレーニングとテストの後、毎日食べ物を許可してください。毎日同じようなスケジュールを立ててください。
  6. 事前訓練の初日に、マウスをリーチツー把持室に置き、正面から観察する。ペレットを開口部の近くにチャンバーの前に置き、ペレットを消費し始めるようにします。この段階で、マウスは任意の形態のペレットをつかむことが許される。
  7. 事前トレーニングの2日目に、マウスがリーチツーグリップ運動を形作ることができるように、ペレットを開口部から開口部(開口部から1cm)に到達するまで、さらに遠くに置きます(図1C)。
  8. マウスを訓練してケージの後方に走り、ケージの開口部に戻って次の食物ペレットを受け取り、試験を個別化する戦略として。
    注:これは、マウスがケージの背面に来るまで待ってから、各試行のくぼみにペレットを置くことによって達成できます。
  9. 右足または左足のいずれかでつかむようにペレットを置きます。
    注:マウスは、訓練とテストの次の日に使用される、把握するために優先的に1本の足を使用し始めます。
  10. 20回の試験または最大10分経過するまでの毎日のセッションで6日間動物を訓練する。トレーニングの2日目から、モックレシーバー(寸法12 x 18 x 7 mm、1 g、 材料表を参照)を置くと、マウスはタスクを実行している間に体重に慣れます(図1B)。毎日、ヒットとミスの試行回数をスコアリングします。
  11. 通常のカメラで動作を記録し、チャンバーの前面から30〜60フレーム/秒をキャプチャします。さらに、訓練室の下に鏡を45°の角度で配置して、動物の姿勢を監視することもできます(図1D、E)。
  12. ポストホック運動学的解析(図2)の場合は、高速カメラ(材料表を参照)を45°の角度で取り付けて、ケージの側面から記録します。3D解析が必要な場合は、2台目の高速カメラを配置して、チャンバーの正面から35°の角度で記録します。両方のカメラは、動物の側面に応じてケージの右側または左側に配置し、同じフレームレートでキャプチャし、同期する必要があります7(図3D、E)。
  13. 可能であれば、高速カメラを 100 フレーム/秒に設定し、解像度は 376 x 252 ピクセル以上に設定します。白い発泡スチロールの壁をチャンバーの側面と背面の後ろに配置して、背景を減らし、コントラストを高めます(図1E)。
  14. 試験日に、モックユニットを無線光遺伝学的刺激用の赤外線受信機と交換してください(図1B、C)。
  15. マウスが到達し始めたら、リモコンでLEDカニューレを手動で回して、行動が実行される間、2秒以内に継続的な刺激を与えます。自動刺激パラダイムをプログラミングすることが好ましい。刺激装置は、先端1.0mW/mm 2の強度で470nm(青色光)のLEDをトリガします。
  16. スコアリングや運動学的解析など、さらなる検査のためにビデオを収集します。

3. 事後組織学的確認

  1. 実験終了後、ウイルス発現及びLEDカニューレ配置を確認する。ケタミン100mg / kgとキシラジン10mg / kgのカクテルで動物を麻酔する。マウスが深い麻酔の徴候を示したら(ステップ1.7)、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流し、続いて4%PFAを投与する。
  2. 埋め込みカニューレを鉗子でコネクターをしっかりつかみ、そっと引き上げるようにして慎重に外します。
  3. 4%PFA23で脳を24時間抽出して後固定する。
  4. PBSで3〜10分間洗浄します。
  5. ミクロトームを用いて脳を50μmの切片に切断する( 材料表を参照)。
  6. DAPIを使用してハードセットされた取り付けメディアを使用してスライド内のセクションを取り付け、核を染色し、スライドを覆います。
  7. 乾燥後、切片を共焦点顕微鏡で観察し、移植されたカニューレの位置と任意の蛍光タンパク質と融合したCh2Rの発現を検証した。

結果

リーチ・トゥ・サクセス・タスクは、さまざまな実験操作の下での細かいスキルの動きのシェーピング、学習、パフォーマンス、および運動学を研究するために広く使用されているパラダイムです。マウスは数日でタスクを実行することを学び、5日間のトレーニング後にプラトーに達する55%以上の精度を達成します(図2A、B)。以前に報告されたものと同様?...

ディスカッション

明確に定義された行動パラダイムにおけるニューロン集団の光遺伝学的操作の使用は、運動制御の根底にあるメカニズムに関する我々の知識を進歩させている7,23。無線方式は、複数の動物または自由運動34,35での試験を必要とするタスクに特に適している。それにもかかわらず、技術と装置が洗練される...

開示事項

著者らは開示しないことを宣言します。

謝辞

この作業は、UNAM-PAPIITプロジェクト IA203520によって支援された。我々は、IFCの動物施設がマウスコロニーの維持管理に協力し、ITサポートのための計算ユニット、特にFrancisco Perez-Eugenioに感謝する。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anaesthesia machineRWDR583SIsoflurane vaporizer
AnesketPiSAKetamine
BreadboardThorlabsMB3090/MSolid aluminum optical breadboard
Camera lenseCanon50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera systemBrainVisionMiCAM02Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solutionPiSASodium chloride solution 9%
Customized training chamberIn house
Drill bit #105Dremel2 615 010 5AEEngraving cutter
Dustless precission chocolate pelletsBio-ServF05301
Ethyl AlcoholJ.T.  Baker9000-02Ethanol
EyespearsUltracell40400-8Eyespears of absorbent PVA material
FlurisoVetOneV1 502017-250Isoflurane
Glass capillariesDrumond Scientific3-000-203-G/XPipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxideFarmacomAntiseptic
High-speed cameraBrainVisionMiCAM02-CMOSMonochrome high-speed cameras
Infrared emmiterTeleopto
Insulin syringe
LED cannulaTeleoptoTelC-c-l-dLED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uLEppendorfZ740436
Micro-pipette pullerSutterP-87Horizontal puller
Microscope LSM780ZeissConfocal microscope
Microtome
Mock receiverTeleopto
NanoJect IIDrumond Scientific3-000-204Micro injector
Oxygen tankInfrana
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpAAddgene20297Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
ParaformaldehydeSigmaP-6148
Phosphate saline bufferSigmaP-4417Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uLThermoFisherAM126350.5-10 uL  volume
PisabentalPiSASodium pentobarbital
PlexiglasscommercialAcrylic sheet
Povidone iodineFarmacomAntiseptic
ProcinPiSAXylacine
PuralubePerrigo pharma1228112Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary toolKmoonMini grinderStandard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatusStoelting51730DDigital apparatus
Super-Bond C&BSun MedicalDental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controllerTeleopto
Tg Drd1-Cre mouse lineGensat036916-UCDTransgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive3M Vetbond1469SB
TPI Vibratome 1000 plusPeicoMicrotome
Vectashield mounting media with DAPIVector laboratoriesH-1200Mounting media
Wireless receiverTeleoptoTELER-1-P

参考文献

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