In vivo Controle Optogenético Sem Fio do Comportamento Motor Qualificado

Resumo

O presente protocolo descreve como usar optogenética sem fio combinada com videografia de alta velocidade em uma única tarefa de alcance à compreensão de pelotas para caracterizar os circuitos neurais envolvidos no desempenho do comportamento motor qualificado em camundongos em movimento livre.

Resumo

Habilidades motoras finas são essenciais na vida cotidiana e podem ser comprometidas em vários distúrbios do sistema nervoso. A aquisição e o desempenho dessas tarefas requerem integração sensorial-motor e envolvem controle preciso dos circuitos cerebrais bilaterais. A implementação de paradigmas comportamentais unimanuais em modelos animais melhorará a compreensão da contribuição das estruturas cerebrais, como o estriado, para o comportamento motor complexo, pois permite a manipulação e o registro da atividade neural de núcleos específicos em condições de controle e doença durante o desempenho da tarefa.

Desde sua criação, a optogenética tem sido uma ferramenta dominante para interrogar o cérebro, permitindo ativação seletiva e direcionada ou inibição de populações neuronais. A combinação de optogenética com ensaios comportamentais lança luz sobre os mecanismos subjacentes de funções cerebrais específicas. Sistemas sem fio montados na cabeça com diodos miniaturizados emissores de luz (LEDs) permitem controle optogenético remoto em um animal totalmente em movimento livre. Isso evita que as limitações de um sistema com fio sejam menos restritivas para o comportamento dos animais sem comprometer a eficiência das emissões leves. O protocolo atual combina uma abordagem optogenética sem fio com videografia de alta velocidade em uma tarefa de destreza unimanual para dissecar a contribuição de populações neuronais específicas para o comportamento motor fino.

Introdução

O comportamento motor qualificado está presente durante a maioria dos movimentos realizados por nós, e é conhecido por ser afetado em vários distúrbios cerebrais 1,2,3,4,5,6. Implementar tarefas que permitam estudar o desenvolvimento, a aprendizagem e o desempenho de movimentos qualificados é crucial para entender os fundamentos neurobiológicos da função motora, especialmente em modelos de lesões cerebrais, distúrbios neurodegenerativas e neurodesenvolvimentos 2,7,8,9,10,11,12,13 . Alcançar e recuperar objetos é feito rotineiramente em ações da vida cotidiana, e é uma das primeiras habilidades motoras adquiridas durante o desenvolvimento precoce e depois refinadas ao longo dos anos ^5,6. Compreende um comportamento complexo que requer processos sensoriais-motores, como a percepção das características do objeto, planejamento de movimento, seleção de ação, execução de movimento, coordenação corporal e modulação de velocidade 7,14,15,16. Assim, tarefas unimanuais de alta destreza requerem a participação de muitas estruturas cerebrais de ambos os hemisférios 16,17,18,19,20,21,22. Em camundongos, a única tarefa de alcance à compreensão de pelotas é caracterizada para várias fases que podem ser controladas e analisadas separadamente ^7,13,23. Esse recurso permite estudar a contribuição de subpopulações neuronais específicas em diferentes estágios de aquisição e desempenho comportamental e fornece uma plataforma para estudos detalhados de sistemas motores 13,23,24. O movimento ocorre em alguns segundos; assim, a videografia de alta velocidade deve ser utilizada para análise cinemática em estágios distintos da trajetória motora qualificada ^7,25. Vários parâmetros podem ser extraídos dos vídeos, incluindo postura corporal, trajetória, velocidade e tipo de erros²⁵. A análise cinemática pode ser usada para detectar alterações sutis durante a manipulação optogenética sem fio ^7,23.

O uso de diodos miniaturizados emissores de luz (LEDs) para fornecer luz através de um sistema sem fio montado na cabeça torna possível ter controle optogenético remoto enquanto o animal executa a tarefa. O controlador optogenético sem fio aceita comandos de gatilho de pulso único ou contínuo de um estimulador e envia sinais infravermelhos (IR) para um receptor conectado ao LED miniaturizado^23,26. O protocolo atual combina essa abordagem optogenética sem fio com a videografia de alta velocidade de uma tarefa de destreza para dissecar o papel de populações neuronais específicas durante o desempenho do bom comportamento motor²³. Por ser uma tarefa unimanual, permite avaliar a participação de estruturas em ambos os hemisférios. Tradicionalmente, o cérebro controla o movimento corporal de forma altamente assimétrica; no entanto, tarefas de alta destreza requerem coordenação e controle cuidadosos de muitas estruturas cerebrais, incluindo núcleos ipsilaterais e contribuição diferencial de subpopulações neuronais dentro dos núcleos 10,20,21,22,23. Este protocolo mostra que estruturas subcorticais de ambos os hemisférios controlam a trajetória do membro²³. Esse paradigma pode ser adequado para estudar outras regiões cerebrais e modelos de doenças cerebrais.

Protocolo

Os procedimentos envolvendo uso de animais foram realizados seguindo diretrizes locais e nacionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Protocolo IACUC do Instituto de Fisiologia Celular VLH151-19). Foram utilizados camundongos transgênicos transgênicos Drd1-Cre²⁷, 35-40 dias de pós-natal com fundo C57BL/6 no protocolo atual. Os camundongos foram mantidos nas seguintes condições: temperatura 22±1 °C; umidade 55%; horário de luz 12/12 h com luzes apagadas às 19:00 e foram desmamados no pós-natal dia 21. Filhotes desmamados foram alojados em grupos do mesmo sexo de 2-5. Os animais estavam alojados em habitações estáticas com micro-barreiras. A cama consistia em aparas de aspen estéreis. Pelotas de roedores e água purificada de RO foram fornecidas ad libitum, exceto quando notadas.

1. Procedimentos cirúrgicos

1. Prepare uma cânula led no comprimento desejado de acordo com as coordenadas dorsoventra da estrutura de interesse (idealmente 0,5 mm a mais para explicar a espessura do crânio, para o estriado dorsolateral 3,5 mm) (Figura 1).
   1. Corte a fibra de vidro em um comprimento maior do que o tamanho final desejado, triture a ponta de fibra até o comprimento alvo com lixa áspera e, finalmente, polir a ponta de fibra com lixa fina.
      NOTA: A cânula led é uma fibra óptica de vidro de 250 μm de diâmetro anexada a um receptor infravermelho (ver Tabela de Materiais).
2. Puxe as pipetas de vidro (1,14 mm de diâmetro externo, 0,53 mm de diâmetro interno e 3,5 de comprimento) para o nano-injetor com um puxador horizontal (ver Tabela de Materiais) e armazene-as para depois. Programe o puxador em uma alça para obter um diâmetro de ponta de 15-20 μm com um longo taper de inclinação gradual (4-5 mm).
3. Prepare a área de cirurgia desinfetando completamente o aparelho estereotaxico, capô, microinjetor (ver Tabela de Materiais) e superfícies circundantes com 70% de etanol.
   NOTA: Um aparelho estereotaxico do mouse é essencial para injetar o Adeno Associated Virus (AAVs) com precisão e colocar a cânula LED na região de interesse.
4. Use os equipamentos de proteção individual apropriados para o procedimento, incluindo um jaleco limpo ou vestido cirúrgico descartável, luvas estéreis, máscara facial e tampa de cabeça descartável.
5. Coloque os equipamentos necessários perto da área cirúrgica, como ferramentas cirúrgicas estéreis, pontas de algodão, soluções, micropipette, pontas de pipeta, capilares, microencha com óleo mineral e marcador.
6. Encha uma pipeta para microinjeções com óleo mineral e coloque-a no microinjetor. Certifique-se de que o micro-injetor está funcionando corretamente, ejetando algum óleo mineral.
   NOTA: Todos os instrumentos utilizados durante a cirurgia devem ser autoclavados e estéreis. Deve ser utilizada técnica asséptica.
7. Anestesiar animais com isoflurano gasoso 4-5% para induzir anestesia e 1,2% durante toda a cirurgia com 0,5-1 L/min de oxigênio puro. A cirurgia só começa após o animal ter atingido um ponto de anestesia profunda, avaliado pela ausência de retirada da pata após uma leve pitada.
   1. Monitore continuamente a taxa de respiração e a temperatura do animal. Mantenha a temperatura do corpo por uma almofada de aquecimento a 34 °C.
8. Aplique uma pomada oftálmica. Retire o cabelo do couro cabeludo com um aparador e creme para depilação. Limpe o couro cabeludo com cotonetes com 8% de povidone-iodo (ver Tabela de Materiais) e 70% de etanol alternado três vezes cada.
9. Coloque o mouse no aparelho estereotaxico e fixe a cabeça, garantindo que o crânio esteja nivelado nos eixos mediolateral e anterior-posterior.
10. Faça uma incisão de 1 cm com um bisturi através do couro cabeludo ao nível dos olhos ao longo do eixo sagital. Retraia a pele para expor o crânio e limpar o periósteo com cotonetes.
11. Limpe a superfície do crânio com solução salina e cotonetes de algodão estéreis. Resolva qualquer sangramento na superfície usando lanças oculares absorventes estéreis (ver Tabela de Materiais) ou material absorvente estéril similar.
12. Aplique uma gota de 2,5% de peróxido de hidrogênio com um cotonete e deixe agir por alguns segundos para tornar as suturas do crânio visíveis e ter uma referência melhor. Depois de alguns segundos, limpe bem com um cotonete limpo.
13. Com a pipeta de vidro (15 μm de diâmetro final da ponta), localize bregma e lambda para verificar se o crânio está nivelado no eixo anterior-posterior.
    NOTA: Recomenda-se ter um microscópio estereoscópico ou microscópio USB para ver a ponta da pipeta de vidro. Caso seja necessário, ajuste a altura do porta-voz para nivelar o crânio.
14. Mova o capilar em direção às coordenadas anterior-posterior (AP) e medial-lateral (ML) (dorsolateral striatum AP 1,2 mm, ML 2,28 mm). Pinte um ponto de referência no couro cabeludo acima das coordenadas selecionadas com um marcador estéril.
15. No ponto de referência, realize uma craniotomia de ~1 mm de diâmetro aplicando pressão suave no crânio com uma ferramenta rotativa estéril ou broca dentária a uma velocidade de baixa a média velocidade com uma pequena broca dentária redonda (ver Tabela de Materiais).
16. Carregue o capilar com 300-400 nL de vírus associado ao adeno dependente de Cre (AAV) como AAV1-dflox-hChR-2-mCherry para expressar Channelrhodopsin ou um AAV para expressar apenas a proteína repórter (por exemplo, mCherry) como um controle na região de interesse (ver Tabela de Materiais). Verifique se a ponta não está entupida e, em seguida, introduza a pipeta de vidro no cérebro nas coordenadas dorso-ventral (DV) desejadas (estriatum dorsolateral DV -3,35 mm).
    1. Injete 200 nL usando um injetor automático a uma taxa de 23 nL/s. Espere 10 minutos após terminar a injeção, retire a pipeta de vidro lentamente para evitar derramamento.
       NOTA: É possível usar uma agulha de 30 G para injetar com o micro-injetor apropriado.
17. Limpe e seque os resíduos com cotonetes de algodão.
18. Conecte a cânula LED de vidro estéril ao braço estereotaxic e calibrar as coordenadas usando bregma como referência. Insira a cânula muito lentamente (300 μm/min) para evitar danos teciduais e coloque-a 100 μm acima do local da injeção.
19. Uma vez que a cânula led esteja no lugar, adicione uma gota (100 μL) de adesivo de tecido na borda da craniotomia.
20. Prepare a mistura de cimento dental (ver Tabela de Materiais) seguindo as instruções do fabricante para fixar a fibra no crânio.
    NOTA: Brevemente, use um prato de porcelana resfriado para ter mais tempo de trabalho antes do cimento definir. Adicione 2 colheres de pó limpo de resina ao prato de porcelana, adicione 4 gotas de base rápida e 1 gota de catalisador, depois misture bem. A relação pó/líquido pode ser ajustada se for necessária uma viscosidade mais fina ou mais espessa.
21. Usando uma escova estéril, aplique a mistura de cimento dental ao redor do conector da cânula pouco a pouco, construindo camadas até que o crânio esteja coberto e o conector esteja firmemente preso ao crânio, deixando os pinos completamente livres. Evite colocar cimento dental na pele do rato.
22. Deixe secar completamente.
23. Feche a pele ao redor do implante usando adesivo de tecido (ver Tabela de Materiais).
24. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação sobre uma almofada de aquecimento a 33° C. Monitore para a presença de um ou mais dos seguintes sinais de dor/desconforto: 1) Curvado, falta ou redução da atividade motora, 2) Não se preparar refletido em um casaco sujo despenteado, 3) Lambida excessiva ou arranhão, vermelhidão no local da incisão, 4) comportamento agressivo, 5) anorexia ou desidratação, e 6) Falta de formação de ninho.
    NOTA: Mantenha o rato individualmente enjaulado durante todos os procedimentos para evitar o descolamento do implante. Em caso de desprendimento da cânula, realize a eutanásia injetando 150 mg/kg de pentobarbital de sódio seguido de decapitação após a anestesia profunda ser alcançada.
25. Injete subcutânea (SC) meloxicam 1 mg/kg uma vez por dia durante três dias após a cirurgia para fornecer analgesia.
26. Aguarde pelo menos 7 dias para recuperação completa e 14 dias para a expressão de opsin antes de novos procedimentos.
    NOTA: Realize um acompanhamento pós-operatório a cada 12 horas durante três dias e, em seguida, verifique os animais todos os dias até o dia da eutanásia no final do experimento.

2. Treinamento de alcance para garras

1. No 7º dia pós-cirurgia, inicie o protocolo de privação de alimentos²⁸. Pese camundongos por três dias consecutivos para determinar seu peso corporal médio ad libitum. Em seguida, agende restrições alimentares para que os animais recebam nutrientes suficientes para manter aproximadamente 90% e não menos de 85% do peso corporal.
   NOTA: Isso é conseguido fornecendo 2,5-3 g de alimentos diariamente. Monitore o peso dos animais diariamente e escore para o bem-estar geral observando o comportamento e a aparência dos animais, por exemplo, aparência de casaco e olhos. Use o sistema de pontuação de condição corporal a partir da Referência²⁹.
2. Durante os períodos de pré-treinamento, treinamento e testes, forneça a cada rato 20 pelotas (20 mg de pelotas com sabor de chocolate sem poeira) diariamente (ver Tabela de Materiais) (comido durante a tarefa ou depois) além das pelotas de alimentos padrão.
3. Três dias antes da habituação, espalhe 0,4 g/animal/dia 20 mgs de pelotas com sabor de chocolate sem poeira em suas gaiolas de casa, para que os ratos se familiarizem com as pelotas que servem de recompensa durante a tarefa de alcançar o controle.
4. Habite os ratos colocando-os 10 minutos na câmara de testes um dia antes do pré-treinamento com pelotas espalhadas no chão da câmara (Figura 1A).
5. Permitir comida diariamente após o treinamento e testes. Mantenha um horário semelhante todos os dias.
6. No primeiro dia de pré-treinamento, coloque os ratos na câmara de alcance e observe pela frente. Coloque as pelotas em frente à câmara perto da abertura para que comecem a consumir as pelotas. Nesta fase, os ratos podem pegar as pelotas de qualquer forma.
7. No segundo dia de pré-treinamento, coloque as pelotas cada vez mais longe da abertura até levá-las ao recuo (1 cm da abertura) para que os ratos possam moldar seu movimento de alcance ao alcance (Figura 1C).
8. Treine ratos para correr para a parte de trás da gaiola e retornar à abertura da gaiola para receber a próxima pelota de alimentos como estratégia para individualizar os ensaios.
   NOTA: Isso pode ser conseguido esperando até que o mouse esteja na parte traseira da gaiola antes de colocar uma pelota no recuo para cada ensaio.
9. Coloque pelotas para serem agarradas por sua pata direita ou esquerda.
   NOTA: Os ratos começam a usar preferencialmente uma pata para agarrar, que serão usados nos próximos dias de treinamento e teste.
10. Treine animais por 6 dias em sessões diárias com duração de 20 ensaios ou até um máximo de 10 minutos decorrido. A partir do 2º dia de treinamento, coloque o receptor simulado (dimensões 12 x 18 x 7 mm, 1 g, ver Tabela de Materiais), para que os ratos se habituam ao peso durante a realização da tarefa (Figura 1B). Cada dia marca o número de testes acertados e perdidos.
11. Grave o comportamento com uma câmera regular e capture 30-60 quadros/s da frente da câmara. Além disso, pode-se colocar um espelho sob a câmara de treinamento em um ângulo de 45° para monitorar a postura dos animais (Figura 1D,E).
12. Para análise cinemática pós-hoc (Figura 2), monte uma câmera de alta velocidade (ver Tabela de Materiais) em um ângulo de 45° para gravar a partir do lado da gaiola. Se for necessária uma análise 3D, coloque uma segunda câmera de alta velocidade para gravar em um ângulo de 35° da frente da câmara; ambas as câmeras devem ser colocadas no lado direito ou esquerdo da gaiola, dependendo da sidedness dos animais e devem ser capturadas na mesma taxa de quadros e sincronizadas⁷ (Figura 3D,E).
13. Defina as câmeras de alta velocidade para 100 quadros/s com uma resolução de 376 x 252 pixels ou mais, se possível. Coloque paredes brancas de isopor atrás das laterais e atrás da câmara para reduzir o fundo e aumentar o contraste (Figura 1E).
14. No dia do teste, substitua a unidade simulada por um receptor infravermelho para estimulação optogenética sem fio (Figura 1B,C).
15. Quando os ratos começarem a alcançar, gire a cânula LED manualmente com o controlador remoto para ter uma estimulação contínua para o tempo em que o comportamento é realizado e por não mais de 2 s. A programação de um paradigma de estimulação automática é preferível. O dispositivo de estimulação aciona um LED de 470 nm (luz azul) com intensidade na ponta de 1,0 mW/mm².
16. Colete os vídeos para exames mais aprofundados, incluindo pontuação e análise cinemática.

3. Confirmação histológica pós-hoc

1. Após a conclusão de um experimento, confirme a expressão viral e a colocação da cânula led. Anestesiar o animal com um coquetel de cetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg. Uma vez que o camundongo apresenta sinais de anestesia profunda (passo 1.7), perfuse com soro fisiológico tamponado de fosfato gelado (PBS), seguido por 4% pfa.
2. Remova a cânula implantada cuidadosamente, agarrando firmemente o conector com fórceps e puxando para cima suavemente.
3. Extrair e pós-fixar o cérebro por 24 h em 4% PFA²³.
4. Realizar lavagens de 3 a 10 min com PBS.
5. Corte o cérebro em seções de 50 μm usando um microtome (ver Tabela de Materiais).
6. Monte as seções em slides com mídia de montagem de conjunto rígido com DAPI para coloricionar núcleos e cobrir slides.
7. Após a secagem, observe as seções sob o microscópio confocal e verifique a localização e expressão da cânula implantada e expressão de Ch2R fundido com qualquer proteína fluorescente.

Resultados

A tarefa de alcance-a-compreensão é um paradigma amplamente utilizado para estudar a formação, o aprendizado, o desempenho e a cinemática do movimento de habilidades finas sob diferentes manipulações experimentais. Os ratos aprendem a executar a tarefa em alguns dias e atingem mais de 55% de precisão atingindo um patamar após 5 dias de treinamento (Figura 2A,B). Semelhante ao que foi relatado anteriormente, um percentual de animais não executa a tarefa adequadament...

Discussão

O uso da manipulação optogenética de populações neuronais em paradigmas comportamentais bem definidos está avançando nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes ao controle motor ^7,23. Métodos sem fio são especialmente adequados para tarefas que requerem testes em vários animais ou livre circulação^34,35. No entanto, como as técnicas e dispositivos são refinados, deve ser a opção de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P