В городе Виво Беспроводной оптогенетический контроль квалифицированного двигательного поведения

Резюме

Настоящий протокол описывает, как использовать беспроводную оптогенетику в сочетании с высокоскоростной видеографией в одной задаче захвата гранул для характеристики нейронных цепей, участвующих в выполнении квалифицированного двигательного поведения у свободно движущихся мышей.

Аннотация

Мелкая моторика необходима в повседневной жизни и может быть скомпрометирована при нескольких расстройствах нервной системы. Приобретение и выполнение этих задач требует сенсорно-моторной интеграции и включает в себя точное управление двусторонними мозговыми цепями. Реализация одноручных поведенческих парадигм в животных моделях улучшит понимание вклада структур мозга, таких как полосатое тело, в сложное двигательное поведение, поскольку это позволяет манипулировать и регистрировать нейронную активность конкретных ядер в контрольных условиях и заболеваниях во время выполнения задачи.

С момента своего создания оптогенетика была доминирующим инструментом для опроса мозга, позволяя селективную и целенаправленную активацию или ингибирование нейронных популяций. Сочетание оптогенетики с поведенческими анализами проливает свет на основные механизмы конкретных функций мозга. Беспроводные головные системы с миниатюрными светодиодами (СВЕТОДИОДАМИ) позволяют осуществлять дистанционное оптогенетическое управление у полностью свободно движущегося животного. Это позволяет избежать ограничений проводной системы, которая является менее ограничительной для поведения животных без ущерба для эффективности светового излучения. Текущий протокол сочетает в себе подход беспроводной оптогенетики с высокоскоростной видеографией в универсальной задаче ловкости для анализа вклада конкретных нейронных популяций в мелкомоторное поведение.

Введение

Двигательное поведение присутствует во время большинства движений, выполняемых нами, и, как известно, оно затрагивается при нескольких расстройствах головного мозга 1,2,3,4,5,6. Выполнение задач, позволяющих изучать развитие, обучение и выполнение квалифицированных движений, имеет решающее значение для понимания нейробиологических основ двигательной функции, особенно в моделях черепно-мозговой травмы, нейродегенеративных расстройств и нарушений нервно-психического развития 2,7,8,9,10,11,12,13 . Дотягивание и извлечение предметов осуществляется регулярно в повседневных действиях, и это один из первых двигательных навыков, приобретенных во время раннего развития, а затем усовершенствованных в течение ^5,6 лет. Он включает в себя сложное поведение, которое требует сенсорно-моторных процессов, таких как восприятие особенностей объекта, планирование движения, выбор действий, выполнение движения, координация тела и модуляция скорости 7,14,15,16. Таким образом, онирукие задания на высокую ловкость требуют участия многих структур мозга обоих полушарий 16,17,18,19,20,21,22. У мышей задача до захвата одной гранулы характеризуется для нескольких фаз, которые можно контролировать и анализировать отдельно ^7,13,23. Данная особенность позволяет изучать вклад специфических нейрональных субпопуляций на разных этапах приобретения и выполнения поведения и предоставляет платформу для детального изучения^{двигательных систем} 13,23,24. Движение происходит за пару секунд; таким образом, высокоскоростная видеография должна использоваться для кинематического анализа на отдельных этапах траектории квалифицированного двигателя ^7,25. Из видео можно извлечь несколько параметров, включая положение тела, траекторию, скорость и тип ошибок²⁵. Кинематический анализ может быть использован для обнаружения тонких изменений во время беспроводных оптогенетических манипуляций ^7,23.

Использование миниатюрных светодиодов (СВЕТОДИОДОВ) для доставки света через беспроводную систему, установленную на голове, позволяет иметь дистанционное оптогенетическое управление, пока животное выполняет задачу. Беспроводной оптогенетический контроллер принимает одноимпульсные или непрерывные триггерные команды от стимулятора и отправляет инфракрасные (ИК) сигналы на приемник, подключенный к миниатюрному светодиоду^23,26. Текущий протокол сочетает в себе этот беспроводной оптогенетический подход с высокоскоростной видеографией задачи ловкости для препарирования роли конкретных нейронных популяций во время выполнения мелкомоторного поведения²³. Поскольку это однорукая задача, она позволяет оценить участие структур в обоих полушариях. Традиционно мозг контролирует движение тела очень асимметричным образом; однако задачи с высокой ловкостью требуют тщательной координации и контроля со стороны многих структур мозга, включая ипсилатеральные ядра и дифференциальный вклад нейронных субпопуляций в^ядрах 10,20,21,22,23. Этот протокол показывает, что подкорковые структуры из обоих полушарий контролируют траекторию передней конечности²³. Эта парадигма может быть подходящей для изучения других областей мозга и моделей заболеваний мозга.

протокол

Процедуры, связанные с использованием животных, были проведены в соответствии с местными и национальными руководящими принципами и одобрены соответствующим Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (протокол Института клеточной физиологии IACUC VLH151-19). В текущем протоколе использовались трансгенные самцы мышей Drd1-Cre²⁷, 35-40 дней после родов с фоном C57BL/6. Мышей содержали при следующих условиях: температура 22±1 °C; влажность 55%; световой график 12/12 ч с выключенным светом в 7 часов вечера и были отлучены от груди на 21-й день послеродового дня. Отъемные щенки размещались в однополых группах по 2-5 особей. Животные размещались в статическом жилище с микробарьерными верхушками. Постельное белье состояло из стерильной осиновой стружки. Гранулы грызунов и водой, очищенной обратной связью, были предоставлены ad libitum, за исключением отмеченных случаев.

1. Хирургические процедуры

1. Подготовьте светодиодную канюлю на нужной длине в соответствии с дорсовентральными координатами интересующей структуры (в идеале на 0,5 мм длиннее для учета толщины черепа, для дорсолатерального полосатого тела 3,5 мм) (рисунок 1).
   1. Разрежьте стекловолокно на длину, превышающую окончательный желаемый размер, измельчите наконечник волокна до целевой длины грубой наждачной бумагой и, наконец, отполируйте наконечник волокна мелкой наждачной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Светодиодная канюля представляет собой стекловолокно диаметром 250 мкм, прикрепленное к инфракрасному приемнику (см. Таблицу материалов).
2. Вытащите стеклянные пипетки (наружный диаметр 1,14 мм, внутренний диаметр 0,53 мм и длина 3,5 мм) для наноинжектора с горизонтальным съемником (см. Таблицу материалов) и храните их на потом. Запрограммируйте съемник в одну петлю, чтобы получить диаметр наконечника 15-20 мкм с длинным постепенным конусом наклона (4-5 мм).
3. Подготовьте область операции, тщательно дезинфицируя стереотаксический аппарат, капюшон, микроинжектор (см. Таблицу материалов) и окружающие поверхности 70% этанолом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиный стереотаксический аппарат необходим для точного введения аденоассоциированного вируса (AAV) и размещения светодиодной канюли в интересующей области.
4. Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты для процедуры, включая чистый лабораторный халат или одноразовый хирургический халат, стерильные перчатки, маску для лица и одноразовый головной колпачок.
5. Разместите необходимое оборудование рядом с областью операции, такое как стерильные хирургические инструменты, хлопковые наконечники, растворы, микропипетки, наконечники пипеток, капилляры, микронаполнение минеральным маслом и маркер.
6. Наполните пипетку для микроинъекций минеральным маслом и поместите ее в микроинжектор. Убедитесь, что микроинжектор работает правильно, выбросив немного минерального масла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты, используемые во время операции, должны быть автоклавными и стерильными. Следует использовать асептическую технику.
7. Анестезируйте животных газообразным изофлураном 4-5%, чтобы вызвать анестезию и 1,2% на протяжении всей операции с 0,5-1 л / мин чистого кислорода. Операция начинается только после того, как животное достигло точки глубокой анестезии, оцениваемой по отсутствию изъятия лапы после легкого ущемления.
   1. Постоянно следите за частотой дыхания и температурой животного. Поддерживайте температуру тела с помощью грелки, установленной при 34 °C.
8. Нанесите офтальмологическую мазь. Удалите волосы с кожи головы с помощью тримера и крема для удаления волос. Протрите кожу головы ватными тампонами, содержащими 8% повидона-йода (см. Таблицу материалов) и 70% этанола, чередуемых по три раза каждый.
9. Поместите мышь в стереотаксический аппарат и закрепите голову, убедившись, что череп выровнен в медиолатеральной и передне-задней осях.
10. Сделайте разрез 1 см скальпелем через кожу головы на уровне глаз вдоль сагиттальной оси. Втяните кожу, чтобы обнажить череп и очистите надкостницу ватными тампонами.
11. Очистите поверхность черепа физиологическим раствором и стерильными ватными тампонами. Устраните любое кровотечение на поверхности с помощью стерильных абсорбирующих глазных копий (см. Таблицу материалов) или аналогичного стерильного абсорбирующего материала.
12. Нанесите каплю 2,5% перекиси водорода ватным тампоном и дайте ей действовать в течение нескольких секунд, чтобы швы черепа были видны и имели лучшую ссылку. Через несколько секунд тщательно очистите его чистым ватным тампоном.
13. С помощью стеклянной пипетки (конечный диаметр наконечника 15 мкм) найдите брегму и лямбду, чтобы убедиться, что череп выровнен в передне-задней оси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется иметь стереоскопический микроскоп или USB-микроскоп, чтобы увидеть кончик стеклянной пипетки. В случае необходимости отрегулируйте высоту держателя рта, чтобы выровнять череп.
14. Переместите капилляр в сторону выбранных передне-задних (AP) и медиально-латеральных (ML) координат (дорсолатеральное полосатое тело AP 1,2 мм, ML 2,28 мм). Нарисуйте точку отсчета в коже головы над выбранными координатами стерильным маркером.
15. В контрольной точке выполните краниотомию диаметром ~ 1 мм, оказывая мягкое давление на череп стерильным вращающимся инструментом или зубной бормашиной на низкой и средней скорости с помощью небольшого круглого зубного бормашины (см. Таблицу материалов).
16. Загрузите в капилляр 300-400 нл cre-зависимого аденоассоциированного вируса (AAV), такого как AAV1-dflox-hChR-2-mCherry, для экспрессии ченнендродопсина или AAV для экспрессии только репортерного белка (например, mCherry) в качестве контроля в интересующей области (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что наконечник не забит, затем вводят стеклянную пипетку в мозг по заданным дорсо-вентральным (DV) координатам (дорсолатеральное полосатое тело DV -3,35 мм).
    1. Впрыск 200 нЛ с помощью автоматического инжектора со скоростью 23 нл/с. Подождите 10 минут после завершения инъекции, медленно вынимайте стеклянную пипетку, чтобы избежать разлива.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать иглу 30 г для инъекции с помощью соответствующего микроинжектора.
17. Очистите и высушите все остатки ватными тампонами.
18. Прикрепите стерильную стеклянную светодиодную канюлю к стереотаксическому кронштейну и откалибруйте координаты, используя брегму в качестве эталона. Вставьте канюлю очень медленно (300 мкм/мин), чтобы избежать повреждения тканей, и поместите ее на 100 мкм выше места инъекции.
19. Как только светодиодная канюля будет на месте, добавьте каплю (100 мкл) тканевого клея на краю трепанации черепа.
20. Приготовьте зубную цементную смесь (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя по фиксации волокна на черепе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вкратце, используйте охлажденную фарфоровую посуду, чтобы иметь больше рабочего времени перед цементными наборами. Добавить в фарфоровую посуду 2 мерные ложки прозрачного порошка смолы, добавить 4 капли быстрого основания и 1 каплю катализатора, затем хорошо перемешать. Соотношение порошок/жидкость можно регулировать, если требуется более тонкая или более толстая вязкость.
21. Используя стерильную щетку, нанесите зубную цементную смесь вокруг соединителя канюли понемногу, наращивая слои до тех пор, пока череп не будет покрыт, а соединитель надежно прикреплен к черепу, оставив штифты полностью свободными. Избегайте попадания зубного цемента на кожу мыши.
22. Дайте полностью высохнуть.
23. Закройте кожу вокруг имплантата с помощью тканевого клея (см. Таблицу материалов).
24. Поместите мышь в восстановительную клетку над грелкой при 33°С. Следите за наличием одного или нескольких из следующих признаков боли/дискомфорта: 1) Сгорбленность, отсутствие или снижение двигательной активности, 2) Неспособность ухаживать отражается в неухоженной грязной шерсти, 3) Чрезмерное облизывание или расчесывание, покраснение в месте разреза, 4) агрессивное поведение, 5) анорексия или обезвоживание и 6) отсутствие гнездообразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мышь индивидуально в клетке во время всех процедур, чтобы избежать отсоединения имплантата. В случае отслоения канюли проводят эвтаназию путем инъекции 150 мг/кг пентобарбитала натрия с последующим обезглавливанием после достижения глубокой анестезии.
25. Вводят подкожно (SC) мелоксикам 1 мг/кг один раз в день в течение трех дней после операции для обеспечения анальгезии.
26. Подождите не менее 7 дней для полного выздоровления и 14 дней для экспрессии опсина перед дальнейшими процедурами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте послеоперационное наблюдение каждые 12 часов в течение трех дней, затем проверяйте животных каждый день до дня эвтаназии в конце эксперимента.

2. Тренировка «Охват до понимания»

1. На 7 день после операции начните протокол лишения пищи²⁸. Взвешивайте мышей в течение трех дней подряд, чтобы определить их среднюю массу тела ad libitum. Затем запланируйте ограничения в еде таким образом, чтобы животные получали достаточно питательных веществ для поддержания примерно 90% и не менее 85% массы тела.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это достигается путем обеспечения 2,5-3 г пищи ежедневно. Ежедневно контролируйте вес животных и оценивайте общее самочувствие, наблюдая за поведением и внешним видом животных, например, за внешним видом шерсти и глаз. Используйте систему оценки состояния тела из ссылки²⁹.
2. Во время предтренинга, обучения и тестирования обеспечьте каждую мышь 20 гранулами (20 мг беспыльных гранул со вкусом шоколада) в день (см. Таблицу материалов) (съеденных во время выполнения задания или после) помимо стандартных пищевых гранул.
3. За три дня до привыкания разбросайте 0,4 г / животное / день 20 мг беспыльных гранул со вкусом шоколада в своих домашних клетках, чтобы мыши познакомились с гранулами, которые служат наградой во время задачи «до захвата».
4. Приучите мышей, поместив их за 10 минут в испытательную камеру за день до предварительной тренировки с гранулами, разбросанными по полу камеры (рисунок 1А).
5. Разрешайте принимать пищу ежедневно после тренировки и тестирования. Придерживайтесь аналогичного графика каждый день.
6. В первый день предварительной тренировки поместите мышей в камеру с досягаемостью и наблюдайте спереди. Поместите гранулы перед камерой близко к отверстию, чтобы они начали потреблять гранулы. На этом этапе мышам разрешается захватывать гранулы в любом виде.
7. На второй день предварительной тренировки поместите гранулы все дальше и дальше от отверстия, пока они не доставят их в углубление (1 см от отверстия), чтобы мыши могли формировать свое движение до захвата (рисунок 1C).
8. Обучите мышей бежать в заднюю часть клетки и возвращаться в отверстие клетки, чтобы получить следующую пищевую гранулу в качестве стратегии индивидуализации испытаний.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этого можно достичь, подождав, пока мышь окажется в задней части клетки, прежде чем помещать гранулу в углубление для каждого испытания.
9. Поместите гранулы, чтобы они были схвачены либо правой, либо левой лапой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши начинают использовать преимущественно одну лапу для захвата, которая будет использоваться в последующие дни обучения и тестирования.
10. Тренируйте животных в течение 6 дней в ежедневных сеансах продолжительностью 20 испытаний или до 10 минут. Со 2-го дня тренировки ставят макет приемника (размеры 12 х 18 х 7 мм, 1 г, см. Таблицу материалов), чтобы мыши привыкли к весу при выполнении задания (рисунок 1В). Каждый день начисляйте количество попаданий и пропущенных испытаний.
11. Записывайте поведение с помощью обычной камеры и захватывайте 30-60 кадров/с передней части камеры. Кроме того, можно поместить зеркало под тренировочную камеру под углом 45° для контроля осанки животных (рисунок 1D, E).
12. Для пост-специального кинематического анализа (рисунок 2) установите высокоскоростную камеру (см. Таблицу материалов) под углом 45° для записи со стороны клетки. Если требуется 3D-анализ, поместите вторую высокоскоростную камеру для записи под углом 35° от передней части камеры; обе камеры должны быть размещены в правой или левой части клетки в зависимости от односторонности животных и должны захватывать с одинаковой частотой кадров и быть синхронизированы⁷ (рисунок 3D, E).
13. Установите скоростные камеры на 100 кадров/с с разрешением 376 x 252 пикселей или более, если это возможно. Поместите белые стенки из пенополистирола по бокам и задней части камеры, чтобы уменьшить фон и увеличить контрастность (рисунок 1E).
14. В день тестирования замените макет блока инфракрасным приемником для беспроводной оптогенетической стимуляции (рисунок 1B, C).
15. Когда мыши начнут достигать, поверните светодиодную канюлю вручную с помощью пульта дистанционного управления, чтобы иметь непрерывную стимуляцию на время выполнения поведения и не дольше 2 с. Программирование парадигмы автоматической стимуляции является предпочтительным. Стимулирующее устройство запускает светодиод 470 нм (синий свет) с интенсивностью на кончике 1,0 мВт/^мм2.
16. Соберите видео для дальнейшего изучения, включая подсчет баллов и кинематический анализ.

3. Пост-hoc гистологическое подтверждение

1. По завершении эксперимента подтвердите вирусную экспрессию и размещение светодиодной канюли. Обезболить животное коктейлем из кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг. Как только у мыши появятся признаки глубокой анестезии (шаг 1,7), перфьюируйте ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), за которым следует 4% PFA.
2. Аккуратно удалите имплантированную канюлю, крепко захватив соединитель щипцами и осторожно подтянув вверх.
3. Экстрагировать и постфиксировать мозг в течение 24 ч в 4% PFA²³.
4. Выполняйте 3-10 мин стирки с PBS.
5. Разрезайте мозг на участки по 50 мкм с помощью микротома (см. Таблицу материалов).
6. Монтируйте секции в слайды с жестко установленным монтажным носителем с DAPI для окрашивания ядер и покрытия слайдов.
7. После высыхания понаблюдайте за срезами под конфокальным микроскопом и проверьте местоположение имплантированной канюли и экспрессию Ch2R, слитого с любым флуоресцентным белком.

Результаты

Задача «достичь понимания» — это парадигма, широко используемая для изучения формирования, обучения, производительности и кинематики движения тонких навыков при различных экспериментальных манипуляциях. Мыши учатся выполнять задание за пару дней и достигают более 55% точности, дости?...

Обсуждение

Использование оптогенетических манипуляций с нейронными популяциями в четко определенных поведенческих парадигмах расширяет наши знания о механизмах, лежащих в основе двигательного контроля ^7,23. Беспроводные методы особенно подходят для задач, требую...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaesthesia machine	RWD	R583S	Isoflurane vaporizer
Anesket	PiSA		Ketamine
Breadboard	Thorlabs	MB3090/M	Solid aluminum optical breadboard
Camera lense	Canon		50mmf/ 1.4 manual focus lenses (c-mount)
Camera system	BrainVision	MiCAM02	Camera controller and synchronizer
Cotton swabs
CS solution	PiSA		Sodium chloride solution 9%
Customized training chamber	In house
Drill bit #105	Dremel	2 615 010 5AE	Engraving cutter
Dustless precission chocolate pellets	Bio-Serv	F05301
Ethyl Alcohol	J.T.  Baker	9000-02	Ethanol
Eyespears	Ultracell	40400-8	Eyespears of absorbent PVA material
Fluriso	VetOne	V1 502017-250	Isoflurane
Glass capillaries	Drumond Scientific	3-000-203-G/X	Pipettes for NanoJect II
Hidrogen peroxide	Farmacom		Antiseptic
High-speed camera	BrainVision	MiCAM02-CMOS	Monochrome high-speed cameras
Infrared emmiter	Teleopto
Insulin syringe
LED cannula	Teleopto	TelC-c-l-d	LED cannula 250um 487nm light
Micropipette 10 uL	Eppendorf	Z740436
Micro-pipette puller	Sutter	P-87	Horizontal puller
Microscope LSM780	Zeiss		Confocal microscope
Microtome
Mock receiver	Teleopto
NanoJect II	Drumond Scientific	3-000-204	Micro injector
Oxygen tank	Infra	na
pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA	Addgene	20297	Viral vector for ChR-2 expression
Parafilm
Paraformaldehyde	Sigma	P-6148
Phosphate saline buffer	Sigma	P-4417	Phosphate saline buffer tablets
Pipette tips 10 uL	ThermoFisher	AM12635	0.5-10 uL  volume
Pisabental	PiSA		Sodium pentobarbital
Plexiglass	commercial		Acrylic sheet
Povidone iodine	Farmacom		Antiseptic
Procin	PiSA		Xylacine
Puralube	Perrigo pharma	1228112	Eye lubricant 15% mineral oil/85% petrolatum
Rotary tool	Kmoon	Mini grinder	Standard
Scalpel
Scalpel blade
Stereotaxic apparatus	Stoelting	51730D	Digital apparatus
Super-Bond C&B	Sun Medical		Dental cement
Surgical dispossable cap
Teleopto remote controller	Teleopto
Tg Drd1-Cre mouse line	Gensat	036916-UCD	Transgene insertion FK150Gsat
Tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
TPI Vibratome 1000 plus	Peico		Microtome
Vectashield mounting media with DAPI	Vector laboratories	H-1200	Mounting media
Wireless receiver	Teleopto	TELER-1-P