二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離

要約

ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。

要約

骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。

概要

骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている^1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている^3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した^5、6、^7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。

プロトコル

本試験における全ての実験は、浙江省中国医科大学実験動物研究センターの動物実験ガイドライン(承認番号:IACUC-20181029-11)に従って実施した。

1. 細胞抽出

1. Sprague-Dawleyラット(SDラット、生後1〜10日、雄または雌)を_CO2 で満たされた安楽死ケージに、30%〜70%の容器容量/分のバランスのとれた速度で入れる。ラットが意識を失った後(20〜60分)、頸部脱臼によってラットを安楽死させ、痛みのない死を確実にする。
2. 消毒のためにラットを75%アルコールに10分間浸漬する。
3. はさみと鉗子でラットのすべての四肢を慎重に取り除き、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。
4. 500mLのDMEMに5mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加え、よく混ぜる。50 mLの滅菌遠沈管を取り、5 mLのFBSおよび45 mLのDMEM培地を加え、十分に混合して、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む10%FBS DMEMを得た。上記の培養液2 mLを5 mLチューブに加える。
5. 四肢の骨を5mLチューブに移す。はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片(1〜3mm)に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。<....

結果

二次付着細胞集団は安定かつ均一であった。連続的な細胞増殖に伴い、細胞の大部分は不規則な形状でより大きくなり、放射状の接着円盤に成長した(図2C、D)。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11b/cを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した(図2A<.......

ディスカッション

破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである²⁰。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1