Выделение клеток моноцитарно-макрофаговой линии из костей крыс методом вторичной адгезии

Резюме

Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии.

Аннотация

При снижении минеральной плотности костной ткани кости чаще ломаются, что негативно сказывается на качестве жизни пациента. Рост и развитие костей в основном регулируются остеобластами и остеокластами. Широко признано, что остеокласты получают из моноцитарно-макрофаговых клеток костного мозга (BBM). БММ и другие гемопоэтические стволовые клетки расположены в полости костного мозга. Поэтому выделение одиночных стабильных БММ из разных и гетерогенных клеточных популяций является огромной проблемой. Здесь мы представляем протокол изоляции БММ от крыс SD, называемый методом вторичной адгезии. Адгезивные клетки, культивируемые в течение 24-48 ч в первичной культуре, собирали. Проточный цитометрический анализ показал, что примерно 37,94% клеток были CD11b/c+ (моноцитарно-макрофагальный поверхностный антиген). Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP) и анализ вестерн-блоттинга показали, что BBM могут дифференцироваться в остеокласты in vitro. Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что вторичные клетки адгезии могут рассматриваться как подходящая клеточная модель для исследования дифференцировки остеокластов.

Введение

Сообщалось, что клетки моноцитарно-макрофаговой линии, существующие в костном мозге, могут дифференцироваться в моноциты крови и тканевые макрофаги ^1,2. Вышеуказанные клетки, которые могут дифференцироваться в остеокласты, чтобы сбалансировать рост и развитие костей, обычно используются в качестве клеточной модели для индуцирования остеокластов in vivo ^3,4. Костный мозг представляет собой специальную ткань, содержащую несколько различных типов клеток, которые включают, но не ограничиваются только мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга, моноцитарно-макрофагальными клетками (БММ), гемопоэтическими стволовыми клетками, эндотелиальными клетками и иммунными клетками. Фактически, несколько предыдущих исследований показали, что адгезивные клетки, выброшенные из полости костного мозга длинной кости, могут дифференцироваться в остеобласты, остеокласты, хондроциты или адипоциты 5,6,7,8. Хотя различные методы изоляции и культивирования использовались для получения различных однородных клеточных популяций, по-прежнему существуют большие проблемы в выделении и культивировании БММ из множества различных типов клеток.

Было разработано несколько методов извлечения мононуклеарных макрофагов костного мозга (BMSCs). Однако большинство из этих методов являются сложными ^9,10,11. Например, центрифугирование градиента плотности требует специализированного комплекта, а операция занимает много времени и громоздко. Этот метод подходит для выделения БММ из больших объемов образцов крови, но не из образцов костного мозга ^9,12,13. Кроме того, извлечение образцов тканей с помощью переваривания коллагеназы является сложной и трудоемкой процедурой; этот метод не рекомендуется для выделения БММ из образцов костного мозга^14,15. Кроме того, хотя разделение потока может привести к высокоочищенным популяциям моноцитов/макрофагов, оно требует очень больших размеров выборки и высоких требований к инструментам и оборудованию^10,16. Кроме того, метод обогащения микрогранул чрезвычайно дорог и неосуществим в общей лаборатории¹⁷.

Поэтому в текущем исследовании был предложен удобный, быстрый и дешевый метод выделения мононуклеарных макрофагов из костного мозга. Клетки костного мозга, приклеенные в течение разных временных точек, использовались для выделения БММ с использованием метода вторичной адгезии. BBM, извлеченные с помощью вышеуказанного метода, могут индуцировать образование остеокластов in vitro, обеспечивая тем самым простую и удобную клеточную модель для будущего изучения остеопороза in vitro.

протокол

Все эксперименты в этом исследовании были проведены в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных Центра лабораторных исследований животных Чжэцзянского китайского медицинского университета (номер одобрения: IACUC-20181029-11).

1. Извлечение клеток

1. Поместите крыс Sprague-Dawley (крысы SD, 1-10 дней, самец или самка) в клетки эвтаназии, заполненные CO₂ со сбалансированной скоростью 30%-70% объема контейнера в минуту. После того, как крысы потеряют сознание (20-60 мин), усыпляют крысу путем вывиха шейки матки, чтобы обеспечить безболезненную смерть.
2. Погрузите крыс в 75% спирт на 10 мин для дезинфекции.
3. Аккуратно удалите все конечности крысы ножницами и щипцами, аспирируйте PBS с помощью пипетки и смойте кровь, прилипшую к конечностям.
4. Добавьте 5 мл раствора пенициллина/стрептомицина в 500 мл ДМЭМ и хорошо перемешайте. Возьмите 50 мл стерильной центрифужной трубки, добавьте 5 мл FBS и 45 мл среды DMEM и тщательно перемешайте, чтобы получить 10% FBS DMEM, содержащий 1% раствор пенициллина / стрептомицина. Добавьте 2 мл вышеуказанной питательной среды в пробирку объемом 5 мл.
5. Переместите кости конечностей в трубку объемом 5 мл. Используйте ножницы, чтобы разрезать кости конечностей в трубке на мелкие кусочки (1-3 мм) и смешать гомогенат, чтобы повторно подвешивать клетки костного мозга в культуральную среду. Постоять 5 мин, пока фрагменты ткани не осядут на дно трубки.
6. Добавьте 10 мл 10% FBS DMEM в 100 мм культуральную чашку, а затем переложите супернатант в культуральную посуду. При аспирации надосадочного вещества избегайте переноса остатков тканей в культуральную посуду.
7. Инкубировать при 37 °C и 5% CO₂ в течение приблизительно 24 ч. После этого инкубационного времени большинство мезенхимальных стволовых клеток будут прилипать к стенке культуральной чашки и медленно расти, в то время как большинство БММ все еще будут подвешены в культуральной среде.
8. Переместите клеточную суспензию в 100-мм чашке для культивирования в новую колбу размером^{25 см2} и продолжайте культивировать клетки при 37 °C и 5% CO₂ в течение дополнительных 24 ч. БММ будут прилипать к стенке колбы через 24-48 ч культуры. Аккуратно удалите старую среду и замените ее свежей средой после того, как КБМ прилипнут к стенке колбы.
9. Субкультура, когда клетки в колбе достигали 80%-90% слияния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки культивировали при 37 °C и 5% CO₂. Во время культивирования морфология клеток постепенно унифицировалась. Клетки были большими, неправильной формы, радиально растущими и прикрепленными к колбе в виде диска, где можно было наблюдать несколько ядер.

2. Окрашивание ячейки FACS

1. Трипсин переваривают с использованием 1-2 мл коммерческого трипсина при 37 °C и 5% CO₂ в течение 5 мин и подсчитывают вторичные адгезивные клетки для обеспечения конечного количества клеток 100 000 на образец (подсчет клеток с помощью гемоцитометра Нойбауэра).
2. Разделить клетки на три группы (500 мкл PBS содержит 100 000 клеток): (1) пустая контрольная группа, содержащая неокрашенные клетки; 2) контрольная группа изотипов; и (3) экспериментальная группа (окрашивание CD11b/c).
3. Инкубировать первичные антитела (отсутствие антител для пустой контрольной группы; контроль изотипа анти-CD11 для контрольной группы изотипа, 0,6 мкл антитела/образец, 1 мкг/образец; анти-CD11b/c для экспериментальной группы, 1 мкл антитела/образец, 1 мкг/образец) на льду в течение 30 мин.
4. Центрифугу при 300-350 х г в течение 5 мин, отбросьте надосадочный агент и повторно суспендируйте ячейки с 500 мкл PBS. Повторите вышеуказанную процедуру один раз, чтобы убедиться, что несвязанные первичные антитела смыты.
5. Инкубировать соответствующее вторичное антитело (без антитела для пустой контрольной группы; козий анти-кролик IgG для контроля изотипа и экспериментальных групп, антитело 0,25 мкл/образец, 1:2000) на льду в темноте в течение 30 мин.
6. Центрифугу при 300-350 х г в течение 5 мин, отбросьте надосадочный агент и повторно суспендируйте ячейки с 500 мкл PBS. Повторите вышеуказанную процедуру один раз, чтобы убедиться, что несвязанные вторые антитела смыты.
7. Обнаружение CD11b/c положительных клеток с помощью проточной цитометрии (10 000 клеток/образец) и анализ данных с помощью программного обеспечения (например, FlowJo 7.5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения конечного процента клеток CD11b/c+ использовалась следующая формула: Процент CD11b/c+ клеток в экспериментальной группе - процент CD11+ клеток в контрольной группе изотипа.

3. Окрашивание Райта-Гимса

1. Посейте адгезивные вторичные клетки, которые были пройдены три раза, на 35 мм² клеточные альпинистские листы (1 × 10⁶ клеток / лунка) и культивируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч.
2. Выбрасываем питательную среду и трижды промываем ПБС.
3. Добавьте раствор красителя Райта-Гимса (0,5 мл-0,8 мл) в лист для подъема клеток в течение 1 мин.
4. Краситель смешать с дистиллированной водой (0,5 мл-0,8 мл) ватным тампоном и постоять 10 мин.
5. Раствор красителя промыть дистиллированной водой, а затем высушить в течение 1-3 мин. Наблюдайте под микроскопом.

4. Окрашивание TRAP

1. Посейте адгезивные вторичные клетки, которые были пройдены три раза, на 35 мм² клеточные альпинистские листы (1 × 10⁶ клеток / лунка) и культивируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч.
2. Заменить старую среду 10% FBS DMEM или индукционной средой остеокластов, дополненной активатором рецептора 50 нг/мл ядерного фактора-κB лиганда (RANKL) и 30 нг/мл макрофагового колониестимулирующего фактора (M-CSF), и культивировать при 37 °C и 5% CO₂ в течение дополнительных 7 дней.
3. Окрашивайте клетки с помощью окрашивающего набора TRAP в соответствии с протоколом производителя и наблюдайте под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: TRAP-положительные клетки были определены как остеокласты, которые были фиолетовыми под световым микроскопом. Количество TRAP-положительных клеток измеряли с помощью программного обеспечения ImageJ.

5. Вестерн Блот

1. Засейте адгезивные вторичные клетки, которые были пройдены три раза на 35 мм² клеточных альпинистских листах (1 × 10⁶ клеток / лунка) и культивируйте в течение 24 ч.
2. Заменить старую среду свежей 10% FBS DMEM или индукционной средой остеокластов (50 нг/мл RANKL и 30 нг/мл M-CSF) и культивировать в течение дополнительных 7 дней при 37 °C и 5% CO₂.
3. Экстрагируют общие клеточные белки с буфером RIPA, отделяют 10% SDS-PAGE и переносят на поливинилиденфторидные мембраны^18,19.
4. Запрещать 5% порошком обезжиренной кислоты (25 мл) в течение 2 ч и промывать трижды, по 10 мин каждый раз, с TBS-Tween 20 (TBST).
5. Инкубировать первичные антитела при 4 °C в течение ночи (анти-β-актин, анти-TRAP и антикатепсин К; все первичные антитела разбавляли 1:1000, 10 мл разбавленного антитела / полосы) и трижды промывали TBST.
6. Инкубировать вторичное антитело (козий анти-кролик IgG, разведение 1:2000, 10 мл разбавленного антитела/полосы) при комнатной температуре в течение 2 ч и трижды промыть TBST. Визуализируйте белковые полосы с помощью развивающегося раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни экспрессии вышеуказанных белков были нормализованы до β-актина.

Результаты

Вторичная популяция адгезивных клеток была стабильной и однородной. При непрерывной пролиферации клеток большинство клеток становилось больше, с неправильной формой и росло в радиальный адгезивный диск (рисунок 2C,D). Проточная цитометрия пок...

Обсуждение

Остеокласты являются одним из наиболее значимых типов клеток, участвующих в возникновении и развитии заболеваний костей, а также одним из основных объектов исследования заболеваний костей²⁰. Моноциты / макрофаги могут дифференцироваться в остеокласты. Поскольку мононукл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1