이차 부착 방법에 의한 쥐 뼈로부터 단핵구-대식세포 계통 세포의 분리

요약

여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

뼈 미네랄 밀도가 감소하면 뼈가 골절 될 가능성이 높아 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미칩니다. 뼈의 성장과 발달은 주로 조골 세포와 파골 세포에 의해 조절됩니다. 파골세포는 골수 단핵구-대식세포(BMMs)로부터 유래된다는 것이 널리 받아들여지고 있다. BMM 및 기타 조혈 줄기 세포는 골수 공동에 위치한다. 따라서, 상이한 이종 및 이종 세포 집단으로부터 단일 안정한 BMM을 단리하는 것은 큰 도전이다. 여기서 우리는 보조 순응 방법이라고 불리는 SD 쥐로부터 BMM을 분리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 일차 배양에서 24-48 h 동안 배양된 부착성 세포를 수집하였다. 유세포 분석 결과 세포의 약 37.94%가 CD11b/c+(단핵구-대식세포 표면 항원)인 것으로 나타났다. 타르트레이트 내성 산 포스파타제(TRAP) 염색 및 웨스턴 블롯 분석은 BMM이 시험관 내에서 파골세포로 분화될 수 있음을 입증하였다. 위의 발견은 이차 부착 세포가 파골세포 분화 연구에 적합한 세포 모델로 간주 될 수 있음을 시사했다.

서문

골수에 존재하는 단핵구-대식세포 혈통세포는 혈액 단핵구 및 조직 대식세포 ^1,2로 분화할 수 있다고 보고되었다. 뼈의 성장과 발달의 균형을 맞추기 위해 파골세포로 분화할 수 있는 상기 세포들은 일반적으로 생체내 파골세포를 유도하기 위한 세포 모델로서 ^{사용된다3,4}. 골수는 골수 중간엽 줄기 세포, 골수 단핵구 - 대식 세포 (BMMs), 조혈 줄기 세포, 내피 세포 및 면역 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 가지 유형의 세포를 포함하는 특수 조직입니다. 사실, 이전의 여러 연구에 따르면 긴 뼈의 골수강에서 밀려난 부착 세포는 조골 세포, 파골세포, 연 골 세포 또는 지방세포 5,6,7,8로 분화 될 수 있다고 제안했습니다. 상이한 동질적인 세포 집단을 생산하기 위해 상이한 분리 및 배양 방법이 사용되었지만, 다양한 상이한 세포 유형으로부터 BMM을 단리하고 배양하는데 여전히 큰 도전이 있다.

골수 단핵 대식세포 (BMSCs)를 추출하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 복잡한 ^9,10,11입니다. 예를 들어, 밀도 구배 원심분리에는 특수 키트가 필요하며 작업은 시간이 많이 걸리고 번거롭다. 이 방법은 대량 혈액 샘플에서 BMM을 분리하는 데 적합하지만 골수 샘플 ^9,12,13에서는 그렇지 않습니다. 또한, 콜라게나제 소화를 사용하여 조직 샘플을 추출하는 것은 복잡하고 시간이 많이 걸리는 절차입니다. 이 방법은 골수 샘플^14,15에서 BMM을 분리하는 데 권장되지 않습니다. 또한, 유동 분리는 고도로 정제된 단핵구/대식세포 집단을 초래할 수 있지만, 매우 큰 표본 크기와 높은 장비 및 장비 요구 사항^10,16을 필요로 한다. 추가적으로, 마이크로비드 농축 방법은 매우 비싸고, 일반 실험실(¹⁷)에서 실현가능하지 않다.

따라서, 현재의 연구에서는 골수로부터 단핵 대식세포를 분리하기 위해 편리하고, 빠르고, 값싼 방법이 제안되었다. 상이한 시점 동안 부착된 골수 세포는 이차 부착 방법을 사용하여 BMMs를 분리하는데 사용되었다. 상기 방법으로 추출된 BMM은 시험관내에서 파골세포의 형성을 유도할 수 있었고, 따라서 시험 관내에서 골다공증에 대한 미래의 연구를 위한 간단하고 편리한 세포 모델을 제공한다.

프로토콜

본 연구의 모든 실험은 절강 중국 의과 대학 실험실 동물 연구 센터 (승인 번호 : IACUC-20181029-11)의 동물 실험 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 세포 추출

1. Sprague-Dawley 래트 (SD 래트, 1-10 일령, 남성 또는 여성)를_CO2 로 채워진 안락사 케이지에 30 % -70 % 용기 부피 / 분의 균형 잡힌 속도로 넣으십시오. 쥐가 의식을 잃은 후 (20-60 분), 통증없는 죽음을 보장하기 위해 자궁 경부 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
2. 소독을 위해 쥐를 75 % 알코올에 10 분 동안 담그십시오.
3. 조심스럽게 가위와 집게로 쥐의 모든 팔다리를 제거하고, 피펫을 사용하여 PBS로 흡인하고 팔다리에 부착 된 혈액을 씻어냅니다.
4. 페니실린/스트렙토마이신 용액 5 mL를 DMEM 500 mL에 넣고 잘 섞는다. 50 mL 멸균 원심분리 튜브를 취하여 FBS 5 mL와 DMEM 배지 45 mL를 첨가하고 완전히 혼합하여 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 함유하는 10% FBS DMEM을 얻었다. 상기 배양액 2 mL를 5 mL 튜브에 첨가한다.
5. 사지 뼈를 5 mL 튜브로 옮깁니다. 가위를 사용하여 튜브의 사지 뼈를 작은 조각 (1-3mm)으로 자르고 균질액을 혼합하여 골수 세포를 배양 배지에 재현탁시킵니다. 조직 단편이 튜브의 바닥에 정착 할 때까지 5 분 동안 방치하십시오.
6. 10 mL의 10% FBS DMEM을 100 mm 배양 접시에 넣은 다음, 상청액을 배양 접시로 옮긴다. 상청액을 흡인 할 때는 조직 파편을 배양 접시로 옮기지 마십시오.
7. 대략 24시간 동안 37°C 및 5%_CO2 에서 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 시간 후에, 대부분의 중간엽 줄기 세포는 배양 접시 벽에 부착되어 천천히 성장할 것이고, 반면에 대부분의 BMMs는 여전히 배양 배지에 현탁될 것이다.
8. 세포 현탁액을 100 mm 배양 접시 내의 새로운 25 cm2 플라스크로 옮기고 추가₂₄ 시간 동안 37°C 및 5%^CO2에서 세포를 계속 배양한다. 오래된 배지를 조심스럽게 제거하고 BMM이 플라스크 벽에 부착 된 후 신선한 매체로 교체하십시오.
9. 계대-플라스크 내의 세포가 80%-90% 컨플루언시에 도달했을 때 계대배양.
   주: 모든 세포는 37°C 및 5%_CO2에서 배양되었다. 배양 동안, 세포 형태학은 점진적으로 통일되었다. 세포는 크고, 불규칙하게 형성되고, 방사상으로 성장하고, 여러 핵이 관찰될 수 있는 디스크 형태로 플라스크에 부착되었다.

2. 세포의 FACS 염색

1. 트립신 다이제스트는 37°C 및 5% CO2에서 1-2mL의 상업용 트립_{신을 사용하여} 5분 동안 소화하고 100,000/샘플의 최종 세포 수를 보장하기 위해 2차 부착 세포를 계수합니다(Neubauer 혈구분석기로 세포 계수).
2. 세포를 세 그룹으로 나눕니다 (500 μL의 PBS는 100,000 세포를 함유함): (1) 염색되지 않은 세포를 함유하는 블랭크 대조군; (2) 이소타입 대조군; 및 (3) 실험군 (CD11b/c 염색).
3. 1차 항체(빈 대조군에 대한 항체 없음, 이소타입 대조군에 대한 항-CD11 이소타입 대조군, 0.6μL의 항체/샘플, 1μg/샘플; 실험군의 경우 항-CD11b/c, 항체/샘플 1μL, 1μg/샘플)를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다.
4. 300-350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 500 μL의 PBS로 재현탁시켰다. 결합되지 않은 일차 항체가 씻겨 나갔는지 확인하기 위해 위의 절차를 한 번 반복하십시오.
5. 상응하는 2차 항체(블랭크 대조군에 대한 항체 없음; 염소 항-토끼 IgG, 이소타입 대조군 및 실험군에 대한 토끼 IgG, 0.25 μL 항체/샘플, 1:2,000)를 어둠 속에서 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한다.
6. 300-350 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포를 500 μL의 PBS로 재현탁시켰다. 결합되지 않은 두 번째 항체가 씻겨 나갔는지 확인하기 위해 위의 절차를 한 번 반복하십시오.
7. 유세포 분석기(10,000개 세포/샘플)에 의해 CD11b/c 양성 세포를 검출하고 소프트웨어(예: FlowJo 7.5)로 데이터를 분석합니다.
   참고: CD11b/c+ 세포의 최종 백분율을 얻기 위해, 다음 공식을 사용하였다: 실험군에서 CD11b/c+ 세포의 백분율 - 이소타입 대조군에서 CD11+ 세포의 백분율.

3. 라이트-짐사 염색

1. 35^mm2 세포 등반 시트 (1 × 10⁶ 세포/웰) 상에 3회 계대된 부착성 2차 세포를 시드하고, 37°C 및 5%_{CO2에서 24} 시간 동안 배양한다.
2. 배양액을 버리고 PBS로 세 번 세척한다.
3. 라이트-짐사 염료 용액(0.5 mL-0.8 mL)을 세포 등반 시트에 1분 동안 첨가한다.
4. 염료를 증류수(0.5 mL-0.8 mL)와 면봉과 혼합하고, 10분 동안 방치한다.
5. 염료 용액을 증류수로 세척한 다음, 1-3분 동안 건조시킨다. 현미경으로 관찰하십시오.

4. 트랩 염색

1. 35^mm2 세포 등반 시트 (1 × 10⁶ 세포/웰) 상에 3회 계대된 부착성 2차 세포를 시드하고, 37°C 및 5%_{CO2에서 24} 시간 동안 배양한다.
2. 기존 배지를 핵 인자-κB 리간드 (RANKL) 및 30 ng/mL의 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)의 50 ng/mL 수용체 활성화제로 보충된 10% FBS DMEM 또는 파골세포 유도 배지로 교체하고, 추가로 7일 동안 37°C 및 5%_CO2 에서 배양하였다.
3. 제조자의 프로토콜에 따라 TRAP 염색 키트로 세포를 염색하고 현미경으로 관찰하였다.
   참고: TRAP 양성 세포는 파골세포로 정의되었으며, 이는 광학 현미경 하에서 보라색이었다. TRAP 양성 세포의 수는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

5. 웨스턴 블롯

1. 35 mm 2 세포 등반 시트 (1 × 10⁶ 세포 / 웰)에서 3 회 계대 된 부착성² 차 세포를 시드하고 24 시간 동안 배양하십시오.
2. 기존 배지를 신선한 10% FBS DMEM 또는 파골세포 유도 배지(50 ng/mL의 RANKL 및 30 ng/mL의 M-CSF)로 교체하고 37°C 및 5%_CO2에서 추가로 7일 동안 배양하였다.
3. RIPA 버퍼로 총 세포 단백질을 추출하고, 10% SDS-PAGE로 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인^18,19로 옮^긴다.
4. 5% 스키밀크파우더(25mL)로 2시간 동안 차단하고 TBS-트윈 20(TBST)으로 매번 10분 동안 세 번 세척하십시오.
5. 1차 항체를 4°C에서 밤새 인큐베이션하고(항-β-액틴, 항-TRAP, 및 항-카텝신 K; 모든 1차 항체는 1:1,000, 10 mL 희석된 항체/밴드로 희석하였다), TBST로 세 번 세척한다.
6. 2차 항체(염소 항-토끼 IgG, 1:2,000 희석액, 10 mL 희석된 항체/밴드)를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, TBST로 세 번 세척한다. 개발 솔루션을 사용하여 단백질 밴드를 시각화하십시오.
   참고: 상기 단백질의 발현 수준은 β-액틴으로 정규화되었다.

결과

이차 부착성 세포 집단은 안정하고 균일하였다. 지속적인 세포 증식으로 대부분의 세포는 불규칙한 모양으로 더 커졌고 방사형 부착 디스크로 성장했습니다 (그림 2C, D). 유세포 분석기는 단핵구-대식세포 계통 세포의 표면에 있는 분자 마커인 CD11b/c를 발현하는 세포의 비율이 약 37.94%인 것으로 나타났다(도 2A

토론

파골세포는 골 질환의 발생 및 발달에 관여하는 가장 중요한 세포 유형 중 하나이며, 골 질환 연구²⁰의 주요 목적 중 하나입니다. 단핵구 / 대식세포는 파골세포로 분화 될 수 있습니다. 단핵 대식세포(RAW264.7 세포)는 구입하기에 너무 비싸고 배양 중에 쉽게 활성화되기 때문에, 이 세포주를 이용한 시험관내 분화 실험을 수행하는 것은 어렵다. 골수에서 단핵구/대식세포를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm2 cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Anti-cathepsin K	Abcam	ab19027	1:1,000
Anti-CD11 isotype control	Abcam	ab172730	1 μg/test,1.675 mg/Ml
Anti-CD11b/c	Absin	abs124232	1μg/test, 1 mg/mL
Anti-TRAP	Abcam	ab191406	1:1,000
Anti-β-actin	Beyotime	AF5003	1:1,000
Cell climbing slices	NEST Biotechnology	80102
Cell culture dish	corning	430167
Cell culture flask	corning	430168
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C
Goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab150077	for IF, 1:2,000
goat anti-rabbit IgG	Abcam	ab6721	for WB, 1:2,000
M-CSF	Pepro tech	400-28
PBS	Biosharp	BL302A
RANKL	Pepro tech	400-30
SD rat	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd		1-10 days old
SDS-PAGE gel preparation kit	Solarbio	P1200
TRAP/ALP Staining Kit	Wako	294-67001
Trypsin-EDTA solution	Biosharp	BL512A
Wright-Giemsa solution	Keygen Biotech	KGA225-1